抗体的纯化：盐析法
牛血清免疫球蛋白的盐析法提取与纯化
牛血清免疫球蛋白的盐析法提取与纯化
牛血清免疫球蛋白的盐析法提取与纯化是一个复杂的过程，包括多个步骤。
以下是一个基本的流程：1. 盐析：首先，需要将牛血清中的免疫球蛋白通过盐析的方法进行提取。
这一步通常使用饱和硫酸铵溶液，通过调节溶液的pH值和离子强度，使得免疫球蛋白在盐析过程中沉淀下来。
2. 洗涤：将沉淀的免疫球蛋白进行洗涤，去除其中的盐分和其他杂质。
3. 溶解：将洗涤后的免疫球蛋白溶解在适当的缓冲液中，以保持其生物活性。
4. 纯化：通过凝胶过滤、离子交换等层析技术对免疫球蛋白进行纯化，去除其中的杂质和不同种类的免疫球蛋白。
5. 浓缩和干燥：将纯化的免疫球蛋白溶液进行浓缩，然后进行干燥处理，得到最终的产品。
需要注意的是，具体的提取和纯化步骤可能会因为实验条件、设备、原材料等因素而有所不同。
同时，为了保证免疫球蛋白的生物活性，需要在整个过程中保持适当的pH值、温度和离子强度等条件。
抗体的提取与纯化
(关键词：抗体；抗体的提取与纯化；盐析法；冷酒精沉淀法；DEAE-SephadexA-50柱层析纯化免疫球蛋白；SPA-SepharoseCL-4B 亲合层析纯化IgG；离子交换层析)精制免疫球蛋白的方法很多。
一般采用综合技术，避免蛋白变性。
如分离IgG时，多结合使用盐析法与离子交换法，以求纯化。
提取IgM的方法也很多，如应用凝胶过滤与制备电泳法，或离子交换与凝胶过滤等。
一、盐析法取x ml血清加x ml生理盐水，于搅拌下逐滴加入2xml饱和硫酸铵，硫酸铵的终饱和度为50%。
↓4℃，3h以上，使其充分沉淀离心（3000rpm）,20min,充上清，以xml生理盐水溶解沉淀，再逐滴加饱和硫酸铵x/2ml。
↓置4℃3h以上，[此时，（NH4）2SO4的饱和度为33%]重复上述第二步过程1～2次。
末次离心后所得沉淀物为γ-球蛋白，以0.02%mol/L pH7.4PBS溶解至xml装入透析袋。
↓对PBS充分透析、换液3次，至萘氏试剂测透析外液无黄色，即无NH4+为止。
取透析袋内样品少许作适当倍数稀释后，以751型紫外分光光度计测定蛋白含量。
影响盐析的因素很多，如蛋白质的浓度，盐的浓度，饱和度和pH，温度等都可影响盐析的结果，操作时要充分注意（参阅本章第二节）。
二、冷酒精沉淀法分离过程如下。
血清加3倍体积的蒸馏水，调节pH至7.7(±)冷却到0℃。
在激烈搅拌的条件下，加预冷的酒精（-20℃）到最终浓度为20%，保持在-5℃。
产生的沉淀（A），含有大多数种类的免疫球蛋白。
沉淀A悬浮于25倍体积的0.15～20mol/L NaCl溶液（冷）中，加有0.05mol/L醋酸调节pH到5.1，产生的沉淀（B），包括大部分的IgA 和IgM，IgG留在上清液内。
调节上清液的pH到7.4，加冷酒精（-20℃～-30℃）到最终浓度为25%，维持在-5℃。
所得到的沉淀（C）含有90%～98%IgG。
不同动物，IgG分离的条件和产量略有不同。
生化课件--抗原抗体的纯化
（二)亲水性离子交换剂 亲水性离子交换剂中的基质为一类天然的或 人工合成的化合物，与水亲和性较大，常用的 有纤维素、交联葡聚糖及交联琼脂糖等。 ① 纤维素离子交换剂 或称离子交换纤维素， 是以微晶纤维素为基质，再引入电荷基团构成 的。根据引入电荷基团的性质，也可分强酸性、 弱酸性、强碱性及弱碱性离子交换剂。纤维素 离子交换剂中，最为广泛使用的是二乙胺基乙 基(DEAE-)纤维素（弱碱性阴离子）和羧甲基 (CM-)纤维素（弱酸性阳离子）。（表3-6）
（一）原理
1、有机溶剂的介电常数比水小，加入有机溶剂后，整 个溶液的介电常数降低，带电的溶质分子之间引力 增强，使溶质分子相互吸引而聚集。 2、亲水性有机溶剂本身的水合作用降低了自由水的浓 度，使溶质分子周围的水化层变薄，导致脱水而相 互聚集析出，也就是降低了溶质的溶解度。 （二）有机溶剂的选择 原则：水溶性好，沉淀效率高，毒性小，惰性，便宜 常用：乙醇、丙酮、甲醇等
离子交 换剂的 类型 强酸性 交换基 团 磺酸剂 -SO3H
阳离子交换剂 中强酸 性 磷酸基 -PO3H2 亚磷酸 基-PO2H2 弱酸性 羧基 -COOH 酚基 苯环-OH 强碱性
阴离子交换剂 中强碱 性 叔胺 -N(CH3)2 弱碱性 仲胺 -NHCH3 伯胺 -NH2
季氨基 N(CH3)3
优点：交换容量大，机械强度高，膨胀率小， 便宜； 缺点：结构紧密，大分子不易进出，疏水，大 分子易变性 适用于小分子的分离
(三)影响有机溶剂沉析的因素
1、pH 有机溶剂沉析时适宜的pH，要选择在样品稳定的 pH范围内，而且尽可能选择样品溶解度最低的pH，通 常是选在等电点附近，以提高该沉析的分辨能力。 2、温度 常温下物质结构松散，有机溶剂易渗入分子内部， 引起变性；降低温度可降低溶解度；且有机溶剂与水 混合时产生放热反应，因此有机溶剂必须预先冷至较 低温度，一般在0℃以下，操作时要在冰盐浴中进行， 加入有机溶剂必须缓慢，并不断搅拌以免局部浓度过 浓。
抗体的提纯实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 掌握抗体提纯的基本原理和方法。
2. 学习并掌握利用亲和层析法、盐析法等方法对抗体进行提纯。
3. 评估提纯效果，确保抗体纯度。
二、实验原理抗体是一种具有特异性的蛋白质，主要存在于血清、组织液等体液中。
抗体提纯的目的是去除抗体中的杂质，提高其纯度和活性。
常用的抗体提纯方法有亲和层析法、盐析法、离子交换层析法等。
亲和层析法：利用抗体与抗原之间的高亲和力，将抗体吸附在特异性抗原上，通过洗脱剂洗脱抗原，实现抗体与抗原的分离。
盐析法：利用盐离子对蛋白质溶解度的影响，通过调节溶液中的盐浓度，使抗体沉淀出来。
三、实验材料1. 实验试剂：抗体溶液、抗原溶液、亲和层析柱、盐析剂、离子交换层析柱、缓冲液等。
2. 实验仪器：离心机、分光光度计、移液器、培养箱、冰箱等。
四、实验步骤1. 亲和层析法（1）将抗体溶液过柱，用缓冲液平衡亲和层析柱。
（2）将抗原溶液加入亲和层析柱，使抗体与抗原结合。
（3）用洗脱剂洗脱未结合的抗原，收集抗体洗脱液。
（4）将抗体洗脱液离心，收集上清液。
2. 盐析法（1）将抗体溶液加入适量的盐析剂，调节盐浓度至抗体沉淀的适宜范围。
（2）静置一段时间，使抗体沉淀。
（3）离心收集抗体沉淀，用缓冲液溶解沉淀。
（4）检测抗体溶液的浓度和活性。
3. 离子交换层析法（1）将抗体溶液过柱，用缓冲液平衡离子交换层析柱。
（2）根据抗体带电荷性质，选择合适的离子交换层析柱。
（3）通过改变缓冲液的离子强度，使抗体吸附在层析柱上。
（4）用梯度洗脱剂洗脱抗体，收集抗体洗脱液。
（5）离心收集抗体洗脱液。
五、实验结果与分析1. 亲和层析法通过亲和层析法提纯抗体，得到纯度较高的抗体溶液。
通过SDS-PAGE电泳检测，抗体分子量与预期相符。
2. 盐析法通过盐析法提纯抗体，得到纯度较高的抗体溶液。
通过SDS-PAGE电泳检测，抗体分子量与预期相符。
3. 离子交换层析法通过离子交换层析法提纯抗体，得到纯度较高的抗体溶液。
抗体的检测和纯化(4)
• Protein A/G亲和层析 • 亲和层析是一种快速有效的生物活 性物质的纯化方法,它通过偶联蛋白对 目的蛋白选择性的吸收和分离,可取得 较高的纯化效果,且操作简便,广泛地应 用于实验室抗体纯化。由于产品价格昂 贵,使用成本较高,限制了它的运用
• Protein A • A 蛋白是金黄色葡萄球菌的表面蛋白,分 子量为42 KD ,有6 个不同的IgG结合位点。其 中有5 个位点对IgG的Fc 片段显示很强的特异 性亲和力,不同的位点独立地与抗体结合。但 IgA , IgM , IgE 也可能结合在配体上,当达到饱 和时,一个A 蛋白分子至少可以结合两个IgG分 子。A 蛋白对IgG有高亲和力和特异性,这一特 点使之非常适合用于纯化腹水或细胞培养上 清中的单克隆抗体
精度纯化
• 目的：保证最终抗体产品纯度，能有效对 潜在的污染物，如宿主细胞蛋白 (HCP)、免 疫球蛋白、宿主DNA； • 对用于腹水生产抗体的刺激物、内毒素、 其它热原物质、培养液成分、层析凝胶析 出成分 (脱落的蛋白A配基) 进行去除；并能 有效的去除/灭活病毒。
建议的工艺
• 首先采用0.2-0.45 m的中空纤维膜技术进行 澄清 (Cell removal)； • 然后用protein-A或protein-B捕获，酸性条件 洗脱后直接pH 4.0病毒灭活； • 澄清过滤后再穿透方式上Capto Adhere； • 这一步离子交换之前或之后会有一步20nm 纳滤去病毒；最后50K膜超滤浓缩和洗滤进 行缓冲液置换。 • 有些抗体如果通过优化结果不甚满意，通 过增加一步Capto Q也基本上可以达到要求
目的：去除特定的杂质，如HCP、DNA、聚集 体和变体等。 常用的层析技术：CaptoAdhere、离子交换、 疏水层析等。
水稀释硫酸铵盐析法纯化卵黄抗体
ｓ ｏ ｔ ａ ｅ ｔ ｔｌｔ ｏ ｅ ｃ ｙ ｅｄ ｏ ｇ ｉ ９ ｈ ｗ ｔｔ ｏ ａ ｈｅ ｒ ｔ ｉｌ ｆＩ Ｙ ｓ４． ０％ ａ ｄ ｔ ｅ ｋ ｙ ｆｃ ｏｓ ａ ｆｃ ｎ ｒ ｔｉ ｅ ｏ ｅ ｒ ｈ ａｉ ｒ ｔｏ ｈ ｈ ｉ ｎ ｅ ａ ｔｒ ｆｅ ｔ ｇ ｐ ｏ ｅｎ ｒ ｃ ｖ ｒ ａ ｅ ｕ ｒ ｆｈ ａｉｎ ｈ ｉ ｙ
异性的抗体。该 纯化 方法不仅 能够制备 出纯度很高 的抗体 ， 而且工艺简单 、 经济 ， 易于大规模生产。
关键词 ： 卵黄抗体 ； 硫酸铵盐析 ；亲和常数
中 图 分 类 号 ：Ｑ４ ４ ７ Ｔ ６ ． 文 献标 识 码 ： Ａ 文 章 编 号 ：０５９ ５ （ ００ ０ －０ ７０ １０ －９ ４ ２ １ ）９０５ － ３
Ｉ Ｇ ｎ ｉ ｅ ｎ ｓａ ｋ ｎ ｆｈ ｇ ｐ ｃｆｃ ａ ｔｂ ｄ ．Ｂｙ ｔ ｉ ｕ ｉ ｃ ｔｏ ｔ ｏ ｇ ａ ｔｇ ｎ ａ ｄ ｉ ｉ ｄ ｏ ｉ ｈ ｓ ｅ ｉ ｉ ｏ ｙ ｉ ｎ ｈ ｓｐ ｒｆ ａｉｎ ｍｅ ｄ，ｔ ｅ ｈ【 ｕ ｉ ｎ ｉｏ ｉｓ ｃ ｎ ｂ ｉ ｈ ｈ ｉｈ ｑ ａ ｔ ａ ｔ ｄ ｅ ａ ｅ ｇ ｌ ｙ ｂ ｐｏ ｕ ｅ ｒｄ ｃ ｄ，ｗｈ ｃ ｓ ｐ ｏ ｅ ｓ ａ ｓｍｐ ｅ，ｅ ｏ ｏ ｃ ｎ ａ ｙ ｆｒ ｓ ａｅ ｕｐ ｐｒ ｃ ｓ ． ｉｈ ｉ ｒ ｖ ｄ ａ ｉ ｌ ｃ ｎ ｍｉａ ａ ｄ ｅ ｓ ｏ ｃ — ｏ ｅ ｓ ｌ ｌ Ｋｅ ｒ ｓ： ｏｋ ａ ｔ ｏ ｙ；ａ ｙ ｗｏ ｄ ｙ ｌ ｎ ｉ ｄ ｂ ｍｍｏ ｉｍ ｕ ｆ ｔ ｒ ｃｐ ｔｔｏ ｎｕ ｓ ｌａ ｅ ｐ ｅ ｉ ｉａｉｎ；ａ ｉ ｔ ｏ ｓａ ｔ ｆ ｎｉ ｃ ｎ ｔ ｎ ｙ
实验四 血清IgG的分离制备—盐析法
实验四 血清IgG 的分离制备—盐析法实验类型：验证型目的和要求掌握盐析法的原理及操作。
原理IgG 是免疫球蛋白（Immunoglobulin ，简称IgG ）的主要成分之一，分子量约为15万~16万，沉降生活费数约为7s 。
IgG 是动物和人体血浆的重要成分之一。
血浆蛋白质的成分多达70余种，要从血浆中分离出IgG ，首先要进行尽可能除去其他蛋白质成分的粗分离程序，使IgG 在样品中比例大为增高，然后再纯化而获得IgG 。
盐析法是粗分离蛋白质的重要方法之一。
许多蛋白质在纯水或低盐溶液中溶解度较低，若稍加一些无机盐则溶解度增加，这种现象称为“盐溶”（Salting in ）。
而当盐浓度继续增加到某一浓度时，蛋白质又变得不深而自动析出，这种现象称为“盐析‘（Salting out ）。
这些现象的原理大致是由于蛋白质是亲水胶体，带有羧基解离的负电荷或氨基解离的正电荷，其极性基团使分子间相互排斥，同时与水分子形成水膜，这些因素保证蛋白质形成溶于水的溶胶状态。
当加入少量盐时，增多了蛋白质分子上的极性基团，因而增大了蛋白质在水中溶解度，出现“盐溶”现象。
但当盐浓度增加到一定浓度时，一方面大量的水同盐分子结合，使得蛋白质没有足够的水维持溶解状态，破坏了维持蛋白质亲水胶的水膜，容易沉淀出来；另一方面加入的盐离子中和了蛋白质分子相互磁撞时即发生相互聚集沉淀出来，这样就出现了“盐析”现象。
由于各种蛋白质“盐析”出来所需的盐浓度也各异，盐析所需的最小盐量称做盐析浓度。
盐析法就是通过控制盐的浓度，使蛋白质混合溶液中的各个成分分步“盐析”出来，达到分离目的蛋白质。
盐析法是1878年Hammarster 首次使用的，他用硫酸镁成功地将血清蛋白分成为清蛋白、球蛋白两部分。
自那以后曾使用过硫酸钠、氯化钠、磷酸钠和硫酸铵等中性盐来盐析蛋白质，其中运用最广的是硫酸铵。
因为硫酸铵有许多其他盐所不具备的优点，如在水中化学性质稳定；溶解度大，25℃时能达到4.1mol/L 的浓度；溶解度的温度系数变化较小，在0~30℃范围内溶解度变化不大，如25℃时饱和溶解度为4.12mol/L ，即767g/L ，0℃时饱和溶解度为3.9mol/L ，即676g/L 。
天津医科大学抗体纯化与鉴定技术-09
操作：
20
注意问题：
21
方法三:
DEAE离子交换层析提取IgG
实验原理：
DEAE-Sephadex A-50 阴离子交换树脂能吸附阳离子； 血清中的γ-球蛋白属于中性蛋白，其余 均属酸性蛋白。在pH7.2～7.4的环境中, 酸性蛋白被DEAE-Sephadex A-50吸附， γ-球蛋白不被吸附而得以纯化。
冷冻保存 4℃保存
30
THE END
31
8
操作：
技术路线 33%饱和硫酸铵沉淀留沉淀 50%饱和硫酸铵沉淀留沉淀 分离血清等倍稀释
9
操作：
注意事项 硫酸铵的质量 饱和硫酸铵溶液配制 蛋白质浓度 盐析过程 脱盐
10
操作：
透析除盐
11
方法二:
葡萄球菌蛋白A亲和层析提取IgG
实验原理：
蛋白A（ Protein A ）或蛋白G （ Protein G ）是细菌胞壁蛋白，它们 能结合抗体Fc段。天然 Protein G具有3 个IgG结合域， 天然的Protein A具有5 个IgG结合域。这一结合非常牢固，但 其亲和力对pH的变化敏感，抗体/蛋白A 或蛋白G的亲和力随pH的降低而急剧降 低。
抗体纯化与鉴定技术
临床免疫学教研室
李会强 教授
抗体纯化的目的
去除：
杂抗体（交叉反应抗体） 杂蛋白（提纯IgG及其片段）
2
方法一:
盐析法粗提丙种球蛋白
实验原理：
蛋白质溶解度在一定范围内随盐的浓度 变化而变化。在低盐浓度下溶解度随盐 的浓度升高而增加，当盐浓度达到一定 水平时，其溶解度又以不同程度下降并 先后析出。
6
主要试剂：
抗体的精制
蛋白A是金黄色葡萄球菌细胞壁的一种蛋白抗原成分，它是单一的多肽链．分子量为42,000．分为5个片段，从N末端开始的4个由58-62个氨基酸残基组成的高度同源的片段。 每个片段都具有和IgG的Fc段结合的活性，但就整个蛋白A分子而言，只能与2个Fc段结合，这种结合是一种疏水结合，可在一定条件下，将IgG从蛋白A解脱下来。 蛋白A具有良好的再生性，耐受低pH反复处理的性能，大多数抗体都能耐受短暂的低p IgM 类单克隆抗体的分离纯化。 常用 Sephadex G200 作分离介质，可以回收到 3 个峰，最高峰为 IgM ，另外两个为 IgG ，抗体回收率达到 50-80% ，能除去微量的杂蛋白，抗体的纯度可以达到 95% 以上。
离子交换法
离子交换的原理
同等电聚焦电泳一样，离子交换剂以自身所带相反电荷与蛋白质的净电荷相结合，蛋白质进入离子交换柱后，与离子交换树脂无亲和力的蛋白质被洗脱下来。 余下的蛋白质均结合在树脂上，由于其蛋白质表面电荷性质的不同，与树脂的亲和力也各不相同。 利用不同强度的离子溶液，将其分别洗脱下来达到分离、纯化蛋白质的目的。
盐析法 (中性盐沉淀法)
盐析的原理
溶液中高浓度的中性盐离子有很强的水化能力，会夺取蛋白质分子的水化层，使蛋白质胶粒失水，发生凝集而沉淀析出。 不同的蛋白质在同一浓度盐溶液中的溶解度不同，可利用不同浓度的盐溶液使每个蛋白质成分分别析出，通常称为蛋白质的盐析。
免疫球蛋白的盐析条件
许多中性盐都能使蛋白质盐析，如硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、氯化钠和磷酸盐等。最常用的为硫酸铵，因它具有溶解度高且受温度影响较小的优点，在室温或冰箱 (4 ℃) 内均可进行。 一般认为在 pH7.0 时， 50 ％硫酸铵饱和度可将所有的免疫球蛋白都沉淀出来。 33 ％饱和度时，大部分 IgG 可沉淀出来。 40 ％饱和度时，沉淀物的得率最高，但含 IgM，IgA 等β球蛋白部分增多。
抗体纯化大全
抗体的纯化第一节硫酸铵沉淀法基本原理硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质.用此方法可以将主要的免疫球蛋白从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。
高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜,降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来.各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。
这种方法称之为盐析。
盐浓度通常用饱和度来表示。
硫酸铵因其溶解度大,温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。
试剂及仪器·组织培养上清液、血清样品或腹水等·硫酸铵（NH4)SO4·饱和硫酸铵溶液（SAS）·蒸馏水· PBS（含0。
2g/L叠氮钠) (见附录一)·透析袋·超速离心机· pH计·磁力搅拌器实验步骤以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体的硫酸铵沉淀.各种不同的免疫球蛋白盐析所需硫酸铵的饱和度也不完全相同。
通常用来分离抗体的硫酸铵饱和度为33%—50％。
一、配制饱和硫酸铵溶液（SAS）将767g(NH4）2SO4 边搅拌边慢慢加到1升蒸馏水中。
用氨水或硫酸调到pH7。
0.此即饱和度为100%的硫酸铵溶液(4。
1 mol/L，25°C）；其它不同饱和度硫酸铵溶液的配制见表1；二、沉淀1、样品（如腹水）20 000´g 离心30 min，除去细胞碎片；2、保留上清液并测量体积；3、边搅拌边慢慢加入等体积的SAS到上清液中,终浓度为1：1（v/v）；4、将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6小时或搅拌过夜（4°C），使蛋白质充分沉淀。
三、透析1、蛋白质溶液10 000´g 离心30 min（4°C)。
弃上清保留沉淀；2、将沉淀溶于少量（10-20ml）PBS—0.2g/L叠氮钠中。
沉淀溶解后放入透析袋对PBS—0.2g/L 叠氮钠透析24—48小时（4°C），每隔3—6 小时换透析缓冲液一次，以彻底除去硫酸氨;3、透析液离心，测定上清液中蛋白质含量。
单克隆抗体纯化方法
单克隆抗体纯化方法
以下是几种常见的单克隆抗体纯化方法：
1. 亲和层析：利用抗体与特定配体的亲和力进行纯化，例如使用Protein A 或 Protein G 亲和层析来捕获抗体。
2. 凝胶过滤层析：根据抗体分子大小进行分离，可以去除较小的杂质。
3. 离子交换层析：基于抗体的电荷性质进行分离，适用于去除带电荷的杂质。
4. 疏水相互作用层析：利用抗体的疏水性进行纯化，可有效去除亲水性杂质。
5. 亲和洗脱层析：通过改变洗脱条件，如离子强度或 pH 值，从亲和层析柱上洗脱目标抗体。
6. 盐析和透析：通过在高盐浓度下沉淀杂质，然后通过透析去除盐分，实现抗体的纯化。
7. 超速离心：利用离心力将抗体与其他杂质分离开来，适用于大规模制备。
这些方法可以单独或联合使用，以获得高纯度的单克隆抗体。
选择合适的纯化方法取决于抗体的特性和所需的纯度水平。
需要注意的是，在进行单克隆抗体纯化时，应严格遵循实验操作规程，并在适当的条件下进行质量控制和检测，以确保获得高质量的抗体产品。
抗体纯化
3.2.2.6 将抽滤后beads放在一干净的PE 手套上，与透析好 的抗原一起转移到15ml离心管中，封口膜封口，孵育， 室温2小时或4℃过夜 3.2.2.7 将结合了抗原的beads转移到纯化管中，加入 couping Buffer15ml冲洗 3.2.2.8 加入封闭液3ml，孵育，室温2小时或4℃过夜 3.2.2.9 PBS冲洗3次
把具有识别能力的配体L以共价键的方 式固化到含有活化基团的基质M上，制成 亲和吸附剂M-L，或者叫做固相载体。而固 化后的配体仍保持束缚特异物质的能力。 因此，当把固相载体装入小层析柱后，让 欲分离的样品液通过该柱。这时样品中对 配体有亲和力的物质S就可以借助静电引
力、范德华力，以及结构互补效应等作用 吸附到固相载体上，而无亲和力或非特异 性吸附的物质则被起始缓冲液洗涤出来； 然后恰当的改变起始缓冲液的PH值或增强 离子强度或加入抑制剂等因子，即可以把 物质S从固相载体上解离下来，通过这一操 作程序就可以把有效成分与杂质分离开来。
3.2 步骤 3.2.1抗原透析 （仅用于融合蛋白）
3.2.1.1 准备好透析夹,并在上面贴上标签
3.2.1.2 剪取适当长的透析袋（1cm透析袋约可容纳3ml 的溶液）, PBS洗三次3次 3.2.1.3 透析夹夹好透析膜的一端,加入抗原,夹好另一端
3.2.1.4 配制新鲜的透析液,并将透析膜置于其中, 4℃ 6小 时或者过夜,重复三次;(注意:透析中应经常观察,一是防止 透析袋中的蛋白发生沉淀,二是防止透析夹上的标签脱落)
抗体的纯化
一 纯化目的
从血清中提取特异性结合的抗 体
二 纯化原理
常用盐析法、凝胶柱层析、离子交 换剂层析以及免疫亲和层析等技术对血 清抗体进行分离纯化。
盐析法原理
抗体纯化的原理和步骤
抗体纯化的原理和步骤抗体纯化，听起来是不是像一门高深的学问？其实，它就是把那些超级英雄般的抗体从一堆“杂质”中找出来的过程。
咱们的免疫系统就像一支警察队，抗体就是那些最勇敢、最聪明的警察，它们专门对付入侵的坏家伙——病毒、细菌等等。
不过，想把这些抗体从复杂的生物样品中提取出来，得有一套“秘籍”！今天，就来跟大家聊聊抗体纯化的原理和步骤，保证让你听得津津有味。
1. 抗体的基本知识1.1 抗体是什么首先，咱们得知道抗体是什么。
这玩意儿其实是由B细胞生产的蛋白质，负责识别和中和外来的侵略者。
可以想象成是专门为打击“罪犯”而生的特工，它们不仅能认得出坏家伙，还能给它们上“刑”。
每种抗体对特定的“罪犯”都有极强的专一性，这让它们在免疫反应中发挥着至关重要的作用。
1.2 抗体的种类抗体可分为多种类型，比如IgG、IgA、IgM等等。
每种都有它独特的功能，就像每位英雄都有自己的超能力。
IgG是最常见的，负责大多数的免疫防御，IgA则主要在黏膜表面发挥作用，像是个“门卫”。
要纯化抗体，了解这些小伙伴的特性可真是必不可少。
2. 抗体纯化的原理2.1 为什么需要纯化好吧，明白抗体是什么后，咱们接下来得搞清楚，为什么要纯化抗体。
想象一下，假如你去参加聚会，周围全是陌生人，你得找到自己的朋友才能安心聊天。
抗体纯化就是这样的过程——把那些“杂质”都清理掉，只留下那些“志同道合”的抗体。
纯化后的抗体才能够更有效地用于科研、治疗等各种用途。
2.2 纯化的方法抗体纯化的方法有不少，比如亲和层析、盐析、透析等等。
亲和层析可以说是个“万里挑一”的高手，它利用抗体和抗原之间的特异性结合，像钓鱼一样，把目标抗体捞出来。
盐析则是利用盐的溶解度差异，让抗体聚集在一起，轻松搞定一部分杂质。
而透析就像是洗衣机，把不需要的“小毛病”洗掉，留下干净的抗体。
3. 抗体纯化的步骤3.1 实验步骤详解接下来，咱们就聊聊具体的步骤吧。
首先，得准备好样品，通常是血清或细胞培养液。
抗体制备过程
抗体制备过程抗体是一种重要的生物分子，具有广泛的应用价值，尤其在医学和生物学研究领域。
抗体制备过程是制作抗体的关键步骤之一，本文将详细介绍抗体制备的过程。
抗体制备的过程可以分为以下几个步骤：抗原的选择、免疫动物的选择、免疫程序的设计、抗血清的制备和纯化。
第一步是选择抗原。
抗原是诱导机体产生抗体的物质，可以是蛋白质、多肽、多糖或化合物。
抗原的选择应根据研究目的和需要进行，通常选择与研究对象具有相关性的抗原。
第二步是选择免疫动物。
常用的免疫动物有小鼠、兔子、大鼠等。
选择合适的免疫动物要考虑到其灵敏度、免疫反应强度和体积等因素。
通常情况下，小鼠是最常用的免疫动物，因为其体积小、繁殖周期短且易于操作。
第三步是设计免疫程序。
免疫程序的设计要考虑到抗原的适宜剂量、免疫次数和免疫间隔时间。
在设计免疫程序时，需要注意免疫次数过多可能导致免疫动物免疫抑制，而免疫间隔时间过短则可能导致免疫反应不充分。
第四步是抗血清的制备。
免疫程序完成后，免疫动物的血液中会产生特异性抗体。
在抗血清制备过程中，需要采集免疫动物的血液，并对血液进行离心分离得到血清。
血清中包含了特异性抗体，可以用于后续实验和分析。
第五步是抗血清的纯化。
抗血清中除了包含特异性抗体外，还有其他非特异性成分，如血浆蛋白和其他血清成分。
因此，在使用抗血清之前，需要对其进行纯化。
常用的纯化方法有盐析法、胶体蛋白聚集法、亲和层析法等。
抗体制备过程的关键是合理设计和严格执行免疫程序。
只有充分考虑抗原选择、免疫动物选择、免疫程序设计以及抗血清的制备和纯化，才能获得高质量的抗体。
总结起来，抗体制备的过程包括抗原的选择、免疫动物的选择、免疫程序的设计、抗血清的制备和纯化。
这个过程需要合理选择抗原和免疫动物，并设计适当的免疫程序。
制备好的抗血清还需要进行纯化处理，以去除其他非特异性成分。
抗体制备过程的成功与否将对后续的实验和研究结果产生重要影响。
兔血清纯化
兔血清抗体分离纯化抗血清纯化的目的是尽量除去抗血清中与目的抗体不相关的成分，以防止抗体外的其他血清成分对试验结果产生影响。
因此只能根据不同目的的要求，从抗血清中除去容易干扰的有关成分，或提取相应的免疫球蛋白。
抗血清纯化的方法主要有粗提法和精制法两个过程。
粗提法主要常用硫酸铵盐析法，精制法分非特异性和特异性两种类型。
非特异性方法如葡聚糖凝胶过滤法、离子交换层析法，其方法均系基于蛋白质分子的物理性质。
特异性方法如免疫吸附法，其方法基于抗原抗体的特异性反应。
一、盐析法(Salt fractionation)（粗提）【实验原理】当用中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对于水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质水分子周围的水化膜减弱甚至消失；同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，使蛋白质分子间聚集而沉淀。
不同蛋白质由于所带电荷不同以及水化程度不同，加入不同浓度的中性盐可分段从溶液中沉淀出来。
蛋白质在不同浓度的盐溶液中相对溶解度不同，血清γ球蛋白在一定浓度盐溶液中易于沉淀，而白蛋白则不易沉淀，据此可将二者分离。
盐析法：硫酸铵分级沉淀【主要试剂与仪器】实验材料：兔血清（20 ml-200 ml）试剂：饱和硫酸铵溶液（用前以 5 mol/L NaOH调至pH7.4）、0.01 mol/L Ph7.4 磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffered Saline PBS）、奈氏试剂实验器材：三角瓶、烧杯、各种吸管、小试管、量筒、布氏漏斗、透析袋（用前用PBS或双蒸水煮沸10 min）等仪器：搅拌器、离心机、电泳仪等【溶液配制】a、饱和硫酸铵溶液的配制：取500 ml蒸馏水加热至70～80 ℃，称(NH4)2SO4400～425 g溶于蒸馏水中，搅拌20 min，趁热过滤，冷却，配制好的饱和硫酸铵溶液，瓶底应有结晶析出，在使用前用28%的氨水调pH至7.4。
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抗体的纯化：盐析法
发布时间：2009-02-18 新闻来源：
精制抗体的方法很多。
一般采用综合技术，避免蛋白变性。
如分离IgG时，多结合使用盐析法与离子交换法，以求纯化。
提取IgM的方法也很多，如应用凝胶过滤与制备电泳法，或离子交换与凝胶过滤等。
一、原理
蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度，以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。
当用中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。
同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。
1、试剂
（1）正常人混合血清；灭菌生理盐水。
（2）饱和硫酸铵溶液的配制
称（NH4）2SO4（AR）400～425克，以50～80℃之蒸馏水500ml溶解，搅拌20分钟，趁热过滤。
冷却后以浓氨水（15N NH4OH）调PH至7.4。
配制好的饱和硫酸铵，瓶底应有结晶析出。
（3）萘氏试剂配制
称HgI 11.5克，KI8克，加蒸馏水至50ml，搅拌溶解后，再加入20%NaOH 50ml。
（4）0.02M，PH7.4磷酸盐缓冲盐液（Phosphate Buffered Saline PBS）配制：
贮存液
A液：0.2M Na2HPO4：Na2HPO4·12H2O 71.64克，加蒸馏水至1000ml；
B液：0.2M NaH2P4：NaH2P4·2H2O 3.12克，加蒸馏水至1000ml；
应用液：取A液81ml加B液19ml混合，再以生理盐水作10倍稀释即成。
（5）0.1M，PH7.4磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffer P配制
将上述A液取81ml与B液19ml混合，再以蒸馏水对倍稀释即成。
（6）20%磺基水杨酸。
2、器材
普通冰箱、离心机、电磁搅拌器，751桮型紫外分光光度计、扭力天平，粗天平。
透析袋、尼龙绳、细竹棒、精密PH试纸（PH5.5～9.0）、眼科镊子、小剪刀。
烧杯、量筒、吸管、滴管、灭菌小瓶、试管等。
3、实验操作
取1X ml血清加1X ml生理盐水，于搅拌下逐滴加入2X ml饱和硫酸铵，硫酸铵的终饱和度为50%。
↓4℃，3h以上，使其充分沉淀
离心（3000rpm），20min，充上清，以x ml生理盐水溶解沉淀，再逐滴加饱和硫酸铵x/2ml。
↓置4℃3h以上，[此时，（nh4）2so4的饱和度为33%]
重复上述第二步过程1～2次。
末次离心后所得沉淀物为γ-球蛋白，以0.02% mol/l pH7.4pbs溶解至x ml 装入透析袋。
↓对PBS充分透析、换液3次，至萘氏试剂测透析外液无黄色，即无NH4+为止。
取透析袋内样品少许作适当倍数稀释后，以752型紫外分光光度计测定蛋白含量。
4、影响盐析的因素
影响盐析的因素很多，如蛋白质的浓度，盐的浓度，饱和度和pH，温度等都可影响盐析的结果，操作时要充分注意。
（1）蛋白质的浓度
盐析时，溶液中蛋白质的浓度对沉淀有双重影响，既可影响蛋白质沉淀极限，又可影响蛋白质的共沉作用。
蛋白质浓度愈高，所需盐的饱和度极限愈低，但杂蛋白的共沉作用也随之增加，从而影响蛋白质的纯化。
故常将血清以生理盐水作对倍稀释后再盐析。
（2）离子强度
各种蛋白质的沉淀要求不同的离子强度。
例如当硫酸铵饱和度不同，析出的成分就不同，饱和度为50％时，少量白蛋白及大多数拟球蛋白析出；饱和度为33％时γ球蛋白析出。
（3）盐的性质
最有效的盐是多电荷阴离子。
（4）PH值
一般说来，蛋白质所带净电荷越多，它的溶解度越大。
改变PH改变蛋白质的带电性质，也就改变了蛋白
质的溶解度。
（5）温度
盐析时温度要求并不严格，一般可在室温下操作。
血清蛋白于25℃时较0℃更易析出。
但对温度敏感的蛋白质，则应于低温下盐析。
（6）蛋白质沉淀后宜在4℃放3小时以上或过夜，以形成较大沉淀而易于分离。