(IX-2)氨基酸的保护和二肽的合成实验讲义2016
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综合化学实验
氨基酸的保护和二肽的合成
实验目的要求
1.通过实验了解氨基酸羧基和胺基的保护方法和二肽的合成方法。
2.通过复习巩固TLC跟踪反应的实验方法,学习并掌握快速柱层析纯化有机化合物的实验技术。
3.通过1H NMR谱图对产物结构进行表征。
实验原理
氨基酸(amino acids)是生物体内构成蛋白质分子的基本单位,与生物的生命活动有着密切的关系,是生命的物质基础。
肽键(peptide bond)是指一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基缩合形成的酰胺键。肽(peptide)是两个或两个以上的氨基酸以肽键相连的化合物,是生物体内一类重要的活性物质。肽按其组成的氨基酸数目为2个、3个和4个等不同而分别称为二肽、三肽和四肽等,一般含10个以下氨基酸组成的称寡肽(oligopeptide),由10个以上氨基酸组成的称多肽(polypeptide)。
肽的合成是一项很繁杂的工作,肽中的肽键易发生多种反应,如水解、氨解等,这就要求合成肽的条件必须温和,因此要对参于反应的氨基、羧基进行“活化”,使反应容易进行;同时要将不参加反应的氨基和羧基暂时"保护"起来,只留下参加反应的氨基和羧基。肽的合成中所用的保护基既要容易接上,在反应时能起保护基团的作用,又要在肽键生成后容易除去,不致引起肽键的断裂。
常用保护氨基的方法是酰化,如叔丁基甲酰基(t-Boc)、对甲苯磺酰基、a-芴甲氧羰基(Fmoc)、苄氧羰基(CBz)等。羧基一般以盐或酯的形式加以保护,常用的酯有甲酯、乙酯、苄酯和叔丁酯等。甲酯和乙酯可用皂化法去保护,但易引起消旋;苄酯可用H2/Pd法或金属钠-液氨法去保护;叔丁酯可在温和条件下用酸除去保护。
本实验用苄醇与苯丙氨酸的羧基反应生成苄酯,以保护氨基酸的羧基。用
a-芴甲氧羰基(Fmoc )酰化保护苯丙氨酸的氨基。本实验采用的EDCI 为缩合剂,在HOBT 和DMAP 作用下使苯丙氨酸中未保护的氨基和羧基进行缩合,生成二肽。EDCI 对水敏感,因此反应体系一定要保持干燥。
实验步骤
1、苯丙氨基酸羧基的保护
+PhCH 2OH
Toluene C 9H 11NO 2
Mol. Wt.: 165.19
C 7H 8O
Mol. Wt.: 108.14
2
2Ph
TsO
C 23H 25NO 5S
Mol. Wt.: 427.51
于100 ml 圆底烧瓶中,加入2.0克 ( 0.012mol) L-苯丙氨酸、2.4克 (0.126mol)对甲苯磺酸一水合物、4ml 苄醇和30ml 甲苯,加热(约140℃)回流至反应完全,用油水分离器分离生成的水(油水分离器的支管需要用石棉条保温),记录生成水的体积。冷却,旋转蒸发浓缩至约5ml ,冷至室温后加入约50ml 乙醚,有白色固体析出,抽滤,用少量乙醚淋洗,得粗产物。将粗产物用约3ml 甲醇全部溶解a (加热到约50℃),冷却到室温,加入30ml 乙醚,有白色固体析出;如无固体析出,则放入冰箱中冷冻,约半小时有白色固体析出。抽滤,得白色固体,为L-苯丙氨酸苄酯对甲苯磺酸盐,干燥,称重,测熔点。取少量样品用甲醇溶解,进行TLC 分析,并与标准品对照。
附注:
a: 本步骤用于除去为反应的苄醇。苄醇的存在会影响到后面二肽的合成。
2、氨基酸氨基的保护
+
C
9H 11NO 2Mol. Wt.: 165.19
2
O
O
O N O
O
C 19H 15NO 5Mol. Wt.: 337.33
OH HN O
C 24H 21NO 4Mol. Wt.: 387.43
3
于100ml圆底烧瓶中加入0.7克碳酸氢钠,加入25ml水使之溶解,再加入1.0克(6 mmol)苯丙氨酸和10ml DMF,室温搅拌使苯丙氨酸全部溶解。冰水浴下,将1.8克(5.3 mmol)Fmoc-Osu和25ml DMF配成的溶液滴入反应瓶中,控制在5-10min内滴完,混合物于25-30℃下搅拌至反应完全(约2小时),每隔半小时取样点板分析,并与Fmoc-Osu对照b,停止反应(如果溶液不能澄清,则需补加10ml DMF)。将溶液转移至250ml烧杯中,用1N盐酸调节pH至2-3,有大量白色沉淀析出,为Fmoc苯丙氨基酸。抽滤,用水洗2-3遍,固体置于60℃烘箱内烘干(约1小时),称重,测熔点。取少量产品用乙酸乙酯溶解,TLC分析并与标准品对照。
附注:
b:取样用乙酸乙酯溶解,展开剂为乙酸乙酯/甲醇=10/1
3、二肽的合成
OH
HN
O
C24H21NO4 Mol. Wt.: 387.43
2
Ph
TsO
C23H25NO5S
Mol. Wt.: 427.51
+
HN
O
O
2
Ph
C40H36N2O5
Mol. Wt.: 624.72
室温下,向干燥的100ml 圆底烧瓶中加入0.5克Fmoc苯丙氨基酸、0.55克L-苯丙氨酸苄酯对甲苯磺酸盐、0.26克Et3N(约0.4ml)和4mlDMF以及20ml CH2Cl2 ,搅拌均匀。最后迅速加入0.55克HATU,套上干燥管,搅拌,反应过夜,TLC检测反应完全。向反应混合物中补加20ml CH2Cl2,再加入20ml 1N盐酸,搅拌,分出有机层(下层)。有机层再依次用20ml饱和碳酸氢钠和20ml饱和食盐水洗涤。无水硫酸镁干燥,过滤,旋转蒸发浓缩至干,称重,记录粗产品的重量。
附注:
c:过滤之后,用取样管取少量母液保留,用作点板对照。标准产物用四氢呋喃溶解,展开剂为二氯甲烷/四氢呋喃=1/1