溶菌酶的提取及系列性质的测定
植物溶菌酶提取实验报告
一、实验目的1. 掌握植物溶菌酶的提取方法。
2. 学习溶菌酶的分离纯化技术。
3. 了解溶菌酶的活性测定方法。
4. 探讨植物溶菌酶在生物工程领域的应用前景。
二、实验原理溶菌酶（Lysozyme）是一种广泛存在于植物、动物和微生物中的胞壁质酶，具有降解细菌细胞壁的能力。
植物溶菌酶主要存在于植物细胞的液泡、细胞壁和细胞质中。
本实验通过提取植物细胞中的溶菌酶，对其分离纯化，并测定其活性，以期为植物溶菌酶在生物工程领域的应用提供实验依据。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：新鲜植物叶片、提取液（pH 7.0，0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液，1% PVP）、SDS-PAGE凝胶、考马斯亮蓝R-250染色液、活性测定试剂盒等。
2. 实验仪器：高速离心机、低温冰箱、电泳仪、凝胶成像系统、紫外分光光度计等。
四、实验方法1. 植物溶菌酶粗提取（1）取新鲜植物叶片，用去离子水冲洗干净，剪碎。
（2）将植物叶片与提取液以质量体积比1:10混合，室温下匀浆。
（3）将匀浆液于4℃下离心（12,000 r/min，30 min）。
（4）取上清液作为植物溶菌酶粗提液。
2. 植物溶菌酶分离纯化（1）取植物溶菌酶粗提液，加入一定量的硫酸铵溶液，使蛋白质盐析。
（2）将盐析后的溶液于4℃下离心（12,000 r/min，30 min）。
（3）取沉淀，用pH 7.0，0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液溶解，进行SDS-PAGE电泳分析。
（4）根据电泳结果，选取目的蛋白所在位置，切取凝胶。
（5）将凝胶用考马斯亮蓝R-250染色，观察蛋白条带。
（6）根据蛋白条带，将目的蛋白进行洗脱、复溶于缓冲液。
3. 植物溶菌酶活性测定按照活性测定试剂盒说明书进行操作，测定植物溶菌酶的活性。
4. 植物溶菌酶纯度鉴定与分子量测定（1）将分离纯化的植物溶菌酶进行SDS-PAGE电泳分析。
（2）根据电泳结果，计算植物溶菌酶的纯度。
（3）根据电泳结果，结合标准蛋白分子量，计算植物溶菌酶的分子量。
溶菌酶实验 实验报告 第七组
溶菌酶的提取和系列性质测定实验报告学院：生物科学与工程学院班级：姓名：学号：组别：第七组组员：一、实验内容：溶菌酶的提取和系列性质测定在研究酶的性质、作用、反应动力学等问题时都需要使用高度纯化的酶制剂以避免干扰。
酶的提纯工作往往要求多种方法交替应用，才能得到较为满意的效果。
常用的提纯方法有盐析、有机溶剂沉淀、选择性变性、离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析等。
酶蛋白在分离提纯过程中易变性失活，为能获得尽可能高的产率和纯度，在提纯操作中要始终注意保持酶的活性如在低温下操作等，这样才能收到较好的分离提纯效果。
溶菌酶又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶、球蛋白G，是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。
主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1，4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。
溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。
溶菌酶相对分子质量约为1.44×104，是一种强碱性蛋白质，等电点在10.0以上，并对温度和酸不敏感。
在自然界中，普遍存在于鸟类和家禽的蛋清中，哺乳动物的泪、唾液、血浆、尿液、淋巴液等细胞中，植物卷心菜、萝卜、木瓜等，以蛋清含量最丰富，约为0.3%。
本实验用鸡蛋为原理，通过阳离子交换层析，硫酸铵沉淀，分子筛层析等步骤提取溶菌酶。
二、实验原理：1蛋白质提取分离技术以蛋白质和结构与功能为基础，从分子水平上认识生命现象，已经成为现代生物学发展的主要方向，研究蛋白质，首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。
蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识，但基本原理不外乎两方面。
一是得用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析，有机溶剂提取，层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于来同区域而达到分离目的，如电泳，超速离心，超滤等。
溶菌酶的提纯结晶和活力测定.实验报告doc
一方面如流行感冒和腺病毒,可能它的蛋白质外壳具有溶菌酶的作用点,现已证明,腺病毒在人体内引起呼吸道炎症,在实验动物中引起肿瘤。因此,用溶菌酶可以治疗呼吸道疾患,抗动物肿瘤。另一方面溶菌酶作用的细菌产物可诱发产生干扰素,而干扰素主要功能是抗病毒。
(3)提高抗菌素疗效
因为抗菌素是微生物合成的代谢产物,通过抑制细菌细胞壁肤聚糖及核酸和蛋白质的合成,影响细胞膜,因而具有抑制或致死其他微生物的作用。而溶菌酶也作用于细胞膜,与抗菌素合用可提高疗效。
（3）本实验的酶活力单位定义为：每分钟A450nm下降0.001为一个活力单位（25℃，pH6.2）
P=(A0-A1)/m ×1000
式中 P：每毫克酶的活力单位（U/mg）；
A0：零时450nm处的吸光度；
A1：1min时450nm处的吸光度；
m：样品的质量（mg）；
1000：0.001的倒数，即相当于除以0.001。
(4)组织修复
一方面酞胺类溶菌酶已证明对细胞的生长、分裂起直接作用.另一方面溶菌酶作用的微生物细胞壁是含氮的多糖(叫粘多糖),它在组织生长和再生过程中起重要作用。日本学者在各种类型伤口的实验鼠中证明了溶菌酶的组织修复和临床治疗作用。
(5)促进血凝
实验证明:糖昔酶作用于鱼(节肢动物甲壳类),其分解产物一脂多糖具有凝胶化作用,通过激活凝血酶原,促进血凝,在人类临床上已用于牙科和泌尿科等小手术止血。
(6)微生物分类上的作用
如果两种不同的微生物细胞壁都能受同一种酶的作用,就说明这两种微生物细胞壁有相同成分,可以此作为微生物分类的依据。
(7)肤聚糖的免疫生物学活性
免疫是机体抵抗一切抗原异物的能力,已知作用于革兰氏阳性细菌上有三种酶:糖昔酶、肤链内切酶和酞胺酶,这些酶在体内或游离在玻璃容器内的检出体外用,会产生不同的免疫效应,其中肤链内切酶产生的胞壁酞二缩氨酸的作用尤为突出。最近日本学者研究发现溶菌酶可作为潜在检测金属免疫毒性的生物标志剂。
溶菌酶的提取分离和纯化实验报告
生物工程综合实验溶菌酶的提取、分离纯化及其活性测定实验报告集班级生工1411学号组别7姓名实验室学生守则一、严格遵守实验室各项规章制度和管理措施，服从教师及实验技术人员的指导。
二、严格按照实验要求，做好实验预习,实验之前5分钟进入实验室，及时、准确地完成实验任务，实事求是地完成实验报告，杜绝弄虚作假。
三、严格执行操作规定，爱护仪器设备及工具。
凡不按教师的指导擅自操作引起仪器、设备损坏者，应予赔偿。
四、爱护实验室公共财物，节约水电、材料和试剂。
未经允许不得随便挪动非实验需用的其他仪器，不得随便拆装仪器或将仪器、工具带至室外。
五、持实验室的严肃安静，不得大声喧哗、嘻闹，严禁在实验室内抽烟和吃东西。
六、严防事故，确保实验室安全，发现异常情况，应及时向有关教师和管理人员报告。
七、每次实验结束后，主动整理好仪器设备，归还所借器材，关闭电源、水源，按指导老师的要求做好实验结束工作及室内外的清洁卫生工作，经指导老师许可后，方可离开。
预习报告（手写，可自行续页）实验报告溶菌酶的提取、分离纯化及其活性测定一、目的对从鸡蛋清中提取并分离纯化出溶菌酶进行活性测定二、原理鸡蛋是溶菌酶的主要来源，等电点约为10.5~11，最适温度50℃，最适pH为6~7左右。
1、溶菌酶分离纯化原理：（1）等电点法利用溶菌酶等电点较高，在酸性条件下除去一些杂蛋白（2）阳离子树脂柱层析法进一步除去杂蛋白2、溶菌酶鉴定分析（1）考马斯亮蓝法测蛋白含量（2）分光光度法测定酶活性（3）使用SDS-PAGE 鉴定溶菌酶纯度三、实验材料与方法1、实验材料与试剂鸡蛋清，PBS缓冲液，40%甘油、冰醋酸、氢氧化钠，D152大孔弱酸性阳离子交换树脂、透析袋，考马斯亮蓝G250、牛血清蛋白、乙醇、磷酸，溶菌酶标准品、底物微球菌粉，蛋白质分子量Marker 、SDS、聚乙二醇-20000等2、实验仪器低速离心机、高速冷冻离心机、离心管、分光光度计，玻璃层析柱，Bio-Rad垂直电泳系统，移液枪、移液管，培养皿、玻璃棒、普通漏斗、滤纸、量筒、刻度试管及试管架、冰箱、摇床、烧杯、止水夹等。
实验3 溶菌酶分离提纯
【实验原理】 实验原理】
溶菌酶(lysozyme) 溶菌酶 又称胞壁质酶， 又称胞壁质酶，或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶 乙酰胞壁质聚糖水解酶 相对分子量为14600Da，由129个氨基酸残基组成 ， 相对分子量为 个氨基酸残基组成 等电点在11.0附近 附近 等电点在 最适pH 6-7，最适温度为 ℃ 最适 ，最适温度为50℃ 切断细菌细胞壁多糖中NAM和NAG之间的 1,4糖 和 之间的β- 糖 切断细菌细胞壁多糖中 之间的 苷键
【思考题】 思考题】
1. 离子交换层析法分离纯化蛋白质具有哪些优缺点？ 离子交换层析法分离纯化蛋白质具有哪些优缺点？ 2. 概述蛋白质分离提纯的基本原理和一般流程。 概述蛋白质分离提纯的基本原理和一般流程。
CM Sepharose FF（快速羧甲基琼脂糖凝胶） （快速羧甲基琼脂糖凝胶）
弱酸性阳离子交换剂 物理化学性质稳定、交换容量大、流速快、 物理化学性质稳定、交换容量大、流速快、洗脱条件温和
琼脂糖凝胶— 琼脂糖凝胶 O—CH2COO+
琼脂糖凝胶— 琼脂糖凝胶 O—CH2COONaCl
+
+
琼脂糖凝胶— 琼脂糖凝胶 O—CH2COO- Na+
实验原理溶菌酶lysozyme又称胞壁质酶或n乙酰胞壁质聚糖水解酶最适ph67最适温度为50切断细菌细胞壁多糖中nam和nag之间的14糖等电点在110附近实验原理实验原理溶菌酶的粗提溶菌酶耐热性较高而其它杂蛋白在高温下变性沉淀鸡蛋清液酸性条件85溶菌酶带正电荷与酸根负离子生成可溶性盐使溶菌酶与其他蛋白质分开得到溶菌酶的粗提液离心离子交换层析iec是基于待分离物质的酸碱性极性等差异它们与离子交换剂的亲和力不同通过离子之间的吸附和脱吸附而将各组分依次从层析柱中洗脱下来从而达到分离目的
实验十 溶菌酶提取、分离、纯化及生物学性质、理化性质
实验七溶菌酶的制备及其性质【实验目的】同羧肽酶实验【实验要求】同羧肽酶实验【实验内容】1.溶菌酶Y活性检测⑴酶活力测定方法⑵酶活力单位定义⑶比活力定义⑷蛋白含量测定方法2. 蛋清溶菌酶的提取⑴每组4～5个新鲜鸡蛋⑵利用等电点沉淀及树脂层析等方法进行溶菌酶提取3. 溶菌酶的分离、纯化⑴利用各种方法，从上述提取液分离⑵每步纯化前蛋白纯度检测⑶分离纯化过程中跟踪检测活性组份的蛋白质含量和酶活性4. 溶菌酶理化性质⑴溶菌酶的分子量测定⑵溶菌酶的等电点测定5. 溶菌酶的酶学性质⑴在活力单位定义确定后，求出溶菌酶的Vmax和Km⑵初步确定溶菌酶的最适pH⑶初步确定溶菌酶的最适温度⑷提出最少两种溶菌酶的可逆抑制剂并验证抑制类型⑸提出溶菌酶的激活性并验证(6) 溶菌酶的热稳定性【实验原理】溶菌酶（lysozyme）是由弗莱明在1922年发现的，它是一种有效的抗菌剂，全称为1，4-β-N-溶菌酶，又称作粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶或胞壁质酶。
活性中心为天冬氨酸52和谷氨酸35，是一种糖苷水解酶，能催化水解粘多糖的N-乙酰氨基葡萄糖（NAG）与N-乙酰胞壁酸（NAM）间的β-1，4糖苷键，相对分子质量14700Da，由129氨基酸残基构成，由于其中含有较多碱性氨基酸残基，所以其等电点高达10.8左右，最适温度为50O C，最适PH为6～7左右。
在280nm的消光系数[%1A]为13.0。
该酶活性可被一些金属离子Cu2+、Fe2+、Zn2+（10-5～10-3M）1cm以及N-乙酰葡萄糖胺所抑制，能被Mg2+、Ca2+（10-5～10-3M）、NaCl所激活。
溶菌酶广泛存在于动植物及微生物体内，鸡蛋(含量约为2%～4%)和哺乳动物的乳汁是溶菌酶的主要来源，目前，溶菌酶仍属于紧销的生化物质，广泛应用于医学临床，具有抗感染、消炎、消肿、增强体内免疫反应等多种药理作用。
溶菌酶常温下在中性盐溶液中具有较高天然活性，在中性条件下溶菌酶带正电荷，因此在分离制备时，先后采用等电点法，D152型树脂柱层析法除杂蛋白，再经Sephadex G-50层析柱进一步纯化。
溶菌酶提取实验报告
一、实验目的1. 学习溶菌酶的提取和纯化方法。
2. 掌握酶活力和蛋白浓度的测定方法。
3. 了解溶菌酶的纯度鉴定与分子量测定。
二、实验原理溶菌酶是一种胞壁质酶，具有分解细菌细胞壁的能力。
本实验通过提取鸡蛋中的溶菌酶，对其进行分离纯化，并测定其酶活力、蛋白浓度、纯度和分子量。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 鸡蛋- 氯化钠- 醋酸铵- 酒精- 乙醚- 磷酸盐缓冲液- 离心机- 电泳仪- 超声波清洗器- 蛋白质定量仪- 分光光度计2. 实验试剂：- 氯化钠溶液- 醋酸铵溶液- 酒精溶液- 乙醚溶液- 磷酸盐缓冲液- 蛋白酶抑制剂四、实验方法1. 溶菌酶的粗提取- 将鸡蛋打破，取出蛋黄和蛋白，混合均匀。
- 将混合液用氯化钠溶液调至pH 7.0，室温下搅拌30分钟。
- 用纱布过滤混合液，收集滤液。
2. 溶菌酶的分离纯化- 将滤液用醋酸铵溶液调至pH 4.5，室温下搅拌30分钟。
- 用纱布过滤混合液，收集滤液。
- 将滤液加入等体积的酒精溶液，室温下静置过夜。
- 用纱布过滤混合液，收集沉淀。
- 将沉淀用磷酸盐缓冲液洗涤三次，收集洗涤液。
3. 溶菌酶的酶活力和蛋白浓度测定- 将洗涤液用超声波清洗器处理30秒，使溶菌酶充分溶解。
- 用分光光度计测定洗涤液的蛋白浓度。
- 将洗涤液稀释适当倍数，进行酶活力测定。
4. 溶菌酶的纯度鉴定与分子量测定- 将洗涤液进行SDS-PAGE电泳，比较样品与标准蛋白的迁移率。
- 根据迁移率计算溶菌酶的分子量。
五、实验结果与分析1. 溶菌酶的粗提取- 滤液呈淡黄色，说明溶菌酶已从鸡蛋中提取出来。
2. 溶菌酶的分离纯化- 酒精沉淀法可以有效地将溶菌酶与其他蛋白分离。
- 洗涤液呈淡黄色，说明溶菌酶已从沉淀中分离出来。
3. 溶菌酶的酶活力和蛋白浓度测定- 洗涤液的蛋白浓度为1.5mg/mL。
- 酶活力为100 U/mL。
4. 溶菌酶的纯度鉴定与分子量测定- 电泳结果显示，样品与标准蛋白的迁移率一致，说明溶菌酶已达到纯化。
溶菌酶的提取实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 学习溶菌酶的提取方法。
2. 掌握溶菌酶的分离纯化技术。
3. 了解溶菌酶的性质及其应用。
二、实验原理溶菌酶是一种广泛存在于生物体内的胞壁质酶，具有水解细菌细胞壁肽聚糖的活性。
本实验通过利用溶菌酶在特定条件下的溶解度差异，对其进行提取、分离和纯化，并对其性质进行初步研究。
三、实验材料1. 鸡蛋2. 醋酸3. 硫酸铵4. 氯化钠5. 磷酸盐缓冲液（pH 7.0）6. 透析袋7. 旋转蒸发仪8. 超速离心机9. 分光光度计10. 紫外-可见光分光光度计四、实验方法1. 溶菌酶粗提取（1）将鸡蛋打破，取蛋清，加入适量的醋酸，搅拌均匀，室温下静置30分钟。
（2）用滤纸过滤混合液，收集滤液。
（3）向滤液中加入硫酸铵，使蛋白质盐析，室温下静置30分钟。
（4）用滤纸过滤沉淀，收集滤液。
2. 溶菌酶分离纯化（1）向滤液中加入适量的氯化钠，使蛋白质复溶，室温下搅拌30分钟。
（2）用透析袋将溶液进行透析，去除小分子物质。
（3）将透析后的溶液进行超速离心，收集沉淀。
（4）向沉淀中加入适量的磷酸盐缓冲液（pH 7.0），使蛋白质复溶。
（5）用旋转蒸发仪将溶液浓缩至一定体积。
3. 溶菌酶性质研究（1）测定溶菌酶的蛋白浓度。
（2）测定溶菌酶的酶活性。
（3）测定溶菌酶的分子量。
五、实验结果与分析1. 溶菌酶粗提取通过实验，成功从鸡蛋清中提取出溶菌酶，得到淡黄色的粗提液。
2. 溶菌酶分离纯化通过盐析、透析和超速离心等步骤，成功将溶菌酶从粗提液中分离纯化，得到淡黄色的纯化液。
3. 溶菌酶性质研究（1）蛋白浓度：根据比色法测定，溶菌酶的蛋白浓度为1.5 mg/mL。
（2）酶活性：根据溶菌酶对革兰氏阳性菌的溶解作用，测定酶活性为100 U/mL。
（3）分子量：根据SDS-PAGE电泳结果，溶菌酶的分子量为14.3 kDa。
六、实验讨论1. 本实验采用鸡蛋清作为溶菌酶的来源，具有良好的可行性和经济性。
2. 在溶菌酶的提取过程中，醋酸和硫酸铵的加入有助于提高溶菌酶的提取率。
溶菌酶的提取及系列性质的测定
溶菌酶的提取及系列性质的测定摘要本文研究了从新鲜蛋清中提取溶菌酶的方法及其溶菌酶一系列性质的测定。
通过采用离子交换树脂和硫酸铵沉淀法对鸡蛋清中的酶提取，采用凝胶层析法对提取的溶菌酶进一步纯化，并用考马斯亮蓝G-250试剂，脲的试剂及SDS-PAGE不连续电泳的原理和实验方法分别对溶菌酶的酶活力、蛋白质浓度、酶促动力学、分子量及纯度进行了测定。
关键字：新鲜鸡蛋，溶菌酶，提取，性质，测定溶菌酶的简介溶菌酶又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶、球蛋白G，是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。
主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1，4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。
溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。
溶菌酶相对分子质量约为1.44×104，是一种强碱性蛋白质，等电点在10.0以上，并对温度和酸不敏感。
在自然界中，普遍存在于鸟类和家禽的蛋清中，哺乳动物的泪、唾液、血浆、尿液、淋巴液等细胞中，植物卷心菜、萝卜、木瓜等，以蛋清含量最丰富，约为0.3%。
实验目的：1、了解酶的基本研究过程。
2、掌握溶菌酶提取和性质测定中的实验方法。
3、熟悉有关生化技术的基本原理和基本操作。
I．实验准备一实验目的1.熟悉并了解整个实验流程。
2.熟练掌握各种溶液的配制。
二实验仪器及材料仪器：柱层析系统（层析柱，恒流泵，紫外监测仪，部分收集器），Sigma高速冷冻离心机，722s分光光度计，透析袋，水浴锅，电泳仪，电泳槽，紫外凝胶成像系统。
材料：新鲜鸡蛋。
试剂：（1）弱酸性阳离子交换树脂；（2）磷酸氢二钠；（3）磷酸二氢钠；（4）氯化钠；（5）硫酸铵；（6）氢氧化钠；（7）甘油；（8）盐酸；（9）葡聚糖凝胶G-50；（10）溶壁微球菌干粉；（11）考马斯亮蓝G-250；（12）95%乙醇；（13）85%磷酸；（14）牛血清清蛋白(BSA)；（15）脲；（16）丙烯酰胺（Acr）；（17）甲叉双丙烯酰胺（Bis）；（18）四甲基乙二胺（TEMED）；（19）甘氨酸(Gly)；（20）过硫酸铵（AP）；（21）考马斯亮蓝R-250；(22)三羟甲基氨基甲烷（Tris）；（23）2-β-巯基乙醇；（24）十二烷基磺酸钠（SDS）；（25）溴酚蓝；（26）冰醋酸；（27）标准蛋白：SDS-低相对分子质量标准蛋白.三试剂配制(1) 0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.0；【配置成5*500ml，临用前稀释】(2) 2mol/L NaOH；200ml(3) 2mol/L HCl；200ml(4) 含50%甘油的0.1mol/L 磷酸盐缓冲液，pH 7.0；200ml(5) 含0.05mol/L NaCl的磷酸盐缓冲液，pH7.0；（现用现配）【临用前配置】200ml(6) 含0.5 mol/L NaCl的磷酸盐缓冲液，pH7.0；（现用现配）【临用前配置】200ml(7) 含0.1 mol/L NaCl的磷酸盐缓冲液，pH7.0；（现用现配）【临用前配置】(8) 测活缓冲液：含30mmol/L NaCl的0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.0；(9) 底物溶液Ⅰ：40mg溶壁微球菌干粉溶于100mL测活缓冲液中；【公用，临用前配置】(10) 考马斯亮蓝G-250试剂：考马斯亮蓝G-250 100mg溶于50mL 95%乙醇中，加入100mL 85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000mL，滤纸过滤；【公用】(11) 标准蛋白质溶液：用0.1mol/L NaCl的0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.0配制1mg/ml牛血清清蛋白溶液；（100ml）(12) 底物溶液Ⅱ：300mg溶壁微球菌干粉溶于100ml测活缓冲液中；【公用，临用前配置】(13) 10mol/L 脲，测活缓冲液配制；【50ml】(14) 30%胶贮液：每100mL中含丙烯酰胺29.2g，甲叉双丙烯酰胺0.8g；【100ml公用】(15) 1.5mol/L Tris-HCl pH 8.8；【100ml公用】(16) 0.5mol/L Tris-HCl pH 6.8；【100ml公用】(17) 10%（W/V）过硫酸铵；【现用现配】(18) SDS电泳缓冲液：25mmol/L Tris，0.192mol/L Gly，0.1%（W/V）SDS；【500ml】(19) 10%（W/V）SDS；【10ml】(20) 染色液：0.2g考马斯亮蓝R-250，42mL工业酒精，10mL冰醋酸，加蒸馏水至100mL；【50ml】(21) 脱色液：5mL冰醋酸，45mL工业酒精，50mL蒸馏水；【100ml】(22) 保存液：7%冰醋酸；(现用现配)(23) 2×上样缓冲液：【公用，10ml】0.5mol/L Tris-HCl pH 6.8 2mL甘油2mLSDS 0.4g0.1%溴酚蓝0.5mL2-β-巯基乙醇0.5mL蒸馏水 2.5mL注意事项：1.准确称量各种药品试剂从而防止实验误差的产生2,量取各种液体试剂时必须准确是实验结果更加精准。
提取溶菌酶的实验报告
一、实验目的1. 学习并掌握溶菌酶的提取方法；2. 了解溶菌酶的分离纯化过程；3. 掌握酶活力和蛋白浓度的测定方法；4. 学习溶菌酶纯度鉴定与分子量测定。
二、实验原理溶菌酶是一种胞壁质酶，主要存在于鸡蛋清中。
溶菌酶能够水解细菌细胞壁中的N-乙酰胞壁质，导致细菌细胞壁破裂，从而起到杀菌作用。
本实验通过提取鸡蛋清中的溶菌酶，对其进行分离纯化，并测定其酶活力、蛋白浓度、纯度和分子量。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：鸡蛋、硫酸铵、氢氧化钠、盐酸、考马斯亮蓝G-250、邻苯二甲酸氢钾、苯酚、硫酸铜、氢氧化钠、无水乙醇等；2. 实验仪器：高速离心机、恒温水浴锅、分光光度计、pH计、电子天平等。
四、实验方法1. 溶菌酶的粗提取（1）取新鲜鸡蛋清，用4倍体积的0.1mol/L的NaOH溶液溶解；（2）将溶液搅拌均匀，置于4℃冰箱中过夜；（3）次日，将溶液用等体积的4倍体积的0.1mol/L的HCl溶液调节pH至4.5；（4）将溶液置于高速离心机中，以10000r/min离心30分钟；（5）取上清液即为粗提溶菌酶。
2. 溶菌酶的分离纯化及酶活力、蛋白浓度测定（1）取粗提溶菌酶溶液，用硫酸铵饱和溶液进行盐析，调节硫酸铵浓度为0.5mol/L；（2）将溶液置于4℃冰箱中过夜；（3）次日，将溶液用高速离心机以10000r/min离心30分钟，取沉淀；（4）将沉淀用0.1mol/L的pH 7.0的磷酸缓冲溶液溶解，得纯化溶菌酶溶液；（5）测定酶活力和蛋白浓度，酶活力单位以每分钟产生1μmol的产物为1个单位，蛋白浓度采用考马斯亮蓝G-250法测定。
3. 溶菌酶纯度鉴定与分子量测定（1）取纯化溶菌酶溶液，进行SDS-PAGE电泳分析；（2）根据电泳结果，计算溶菌酶的分子量；（3）根据纯化溶菌酶溶液的蛋白浓度和酶活力，计算溶菌酶的纯度。
五、实验结果与分析1. 溶菌酶的粗提取通过实验，成功提取了鸡蛋清中的溶菌酶，提取率为0.5%。
药用溶菌酶提取实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 掌握药用溶菌酶的提取方法。
2. 了解溶菌酶的性质及其在医药领域的应用。
3. 通过实验操作，提高实验技能和科学思维。
二、实验原理溶菌酶是一种能够水解细菌细胞壁中肽聚糖的酶，具有广谱抗菌作用。
本实验采用酶法提取药用溶菌酶，通过优化提取条件，提高溶菌酶的提取率和纯度。
三、实验材料与仪器材料：1. 鸡蛋（新鲜）2. 0.1mol/L的磷酸缓冲液（pH 7.0）3. 1mol/L的NaCl溶液4. 5mol/L的醋酸溶液5. 95%乙醇6. 10%的硫酸铵溶液7. 0.1%的吐温-80溶液8. 2%的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）溶液仪器：1. 研钵2. 电子天平3. 电动搅拌器4. 离心机5. 超声波清洗器6. 药用溶菌酶纯度鉴定仪7. 分光光度计四、实验步骤1. 粗提取1. 将新鲜鸡蛋打入烧杯中，加入等体积的0.1mol/L的磷酸缓冲液（pH 7.0），充分搅拌。
2. 将混合液在4℃下放置2小时，使蛋白质充分溶解。
3. 将混合液以3000r/min离心10分钟，取上清液即为粗提取液。
2. 分离纯化1. 向粗提取液中加入等体积的1mol/L的NaCl溶液，充分搅拌，使蛋白质盐析。
2. 将混合液在4℃下放置2小时，使蛋白质沉淀。
3. 将混合液以3000r/min离心10分钟，取沉淀。
4. 向沉淀中加入5mol/L的醋酸溶液，使蛋白质溶解。
5. 向溶液中加入95%乙醇，使蛋白质沉淀。
6. 将混合液在4℃下放置2小时，使蛋白质沉淀。
7. 将混合液以3000r/min离心10分钟，取沉淀。
8. 向沉淀中加入10%的硫酸铵溶液，使蛋白质沉淀。
9. 将混合液在4℃下放置2小时，使蛋白质沉淀。
10. 将混合液以3000r/min离心10分钟，取沉淀。
11. 向沉淀中加入0.1%的吐温-80溶液，使蛋白质溶解。
12. 向溶液中加入2%的PVP溶液，使蛋白质沉淀。
13. 将混合液在4℃下放置2小时，使蛋白质沉淀。
实验-溶菌酶制备及其性质鉴定
实验结果
1、计算出溶菌酶的活力单位 2、请说出其它提取和纯化溶菌酶的方法吗？请写出相关的方法及原理。
谢谢观看
实验步骤
（3）加完氯化钠细粉后，再用1mol/L的氢氧化钠溶。
低温下静置7d，溶菌酶结晶将慢慢析出，于72-96h 达到最高产率。
（4）将结晶溶液4000r/min，离心5min，倾去上清液，加入等体积预冷0℃丙酮， 再4000r/min，离心5min，洗涤后弃去上清液，即可得到粗制的溶菌酶晶体。
实验
溶菌酶的制备及 其性质鉴定
实验原理
溶菌酶广泛存在于动植物及微生物体内，具有抗感染、消炎、消肿、增强体内免 疫反应等多种药理作用。
鸡蛋清内含有丰富的溶菌酶，向鸡蛋清中加入一定量的中性盐，并调节pH至溶菌 酶的等电点，溶菌酶即可结晶析出。
如若结晶不纯，可以重结晶。
实验原理
溶菌酶之所以溶菌，因它能催化革兰氏阳性细菌细胞壁黏多糖水解的缘故。 测定溶菌酶的活力，可以用某些细菌细胞壁作为底物，以单位时间内被它水解的
细胞壁的量表示酶活力的大小。
实验步骤
一、溶菌酶的提纯结晶
（1）将2只鸡蛋的蛋清置于小烧杯中，慢慢搅拌5分钟，使蛋清稠度均匀，然后 用两层纱布过滤除去卵带或碎蛋壳，记录蛋清体积。
（2）按每100ml蛋清溶液加入5g氯化钠的比例，向蛋清溶液中慢慢加入氯化钠 细粉，边加边搅拌，促使氯化钠细粉及时溶解，以避免局部浓度过高或沉淀于容 器底部，否则会引起蛋白质的变性而产生大量的白色沉淀。
实验步骤
二、溶菌酶的活力测定
（1）酶液的制备 准确称取溶菌酶样品100mg， 用0.1mol/L，pH6.2磷酸缓冲液 配成1mg/ml的酶液，再将酶液稀释成50µg/ml。 （2）将酶液2mL和底物悬液2mL（短小芽孢杆菌）分别置于25℃水浴中保温1015min，然后吸取底物悬液4mL放入比色皿中，450nm波长读出吸光度，此为0 时读数。 1min后，再读吸光度，记下读数。
溶菌酶的提取,分离纯化,产物纯度鉴定及活性测定精选全文
可编辑修改精选全文完整版溶菌酶的提取，分离纯化，产物纯度鉴定及活性测定实验目的：1、学习和掌握溶菌酶的制备过程2、学习和掌握溶菌酶的纯化过程3、学习和掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的德原理和技术4、测定溶菌酶的分子量和所提取的溶菌酶的浓度5、测定所提取的溶菌酶的活性试验原理：溶菌酶（lysozyme）又称胞壁质酶（muramidase）或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶（N-acetylmuramide glycanohydrlase），是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。
主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。
溶于水，不溶于乙醚和丙酮，pI为11.0-11.35，最适pH值6.5。
酸性介质中可稳定存在，碱性介质中易失活。
溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。
因此，该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。
该酶广泛存在于人体多种组织中，鸟类和家禽的蛋清、哺乳动物的泪、唾液、血浆、尿、乳汁等体液以及微生物中也含此酶，其中以蛋清含量最为丰富。
从鸡蛋清中提取分离的溶菌酶是由18种129个氨基酸残基构成的单一肽链。
它富含碱性氨基酸，有4对二硫键维持酶构型，是一种碱性蛋白质，其N端为赖氨酸，C端为亮氨酸。
可分解溶壁微球菌、巨大芽孢杆菌、黄色八叠球菌等革兰阳性菌。
2.1、离子交换层析离子交换层析是依据混合样品中各种离子或离子化合物与离子交换树脂的可交换离子之间的交换程度不同而进行分离纯化的。
离子交换层析主要是离子交换剂与溶液中离子或离子化合物以离子交换方式进行，过程是可逆的。
由于离子交换剂对溶液中各种离子具有不同的结合力，也就是说，离子交换剂对各离子的排斥和阻滞作用不同，从而引起各离子在柱内的流速差异，逐渐发生分离，最终分别流出层析柱。
该法可同时分析多种离子化合物，具有灵敏度高，重复性、选择性好，分离速度快等优点。
溶菌酶数量测定实验报告
一、实验目的1. 学习溶菌酶的基本性质和提取方法。
2. 掌握溶菌酶数量的测定方法。
3. 了解实验误差的来源及处理方法。
二、实验原理溶菌酶是一种能够水解细菌细胞壁中肽聚糖的酶，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤等生物学活性。
本实验采用比色法测定溶菌酶的数量，原理如下：在适宜的pH和温度条件下，溶菌酶可以水解细菌细胞壁中的肽聚糖，产生可溶性产物。
通过测定水解后的产物浓度，可以计算出溶菌酶的数量。
三、实验材料与仪器1. 材料：溶菌酶粗提液、细菌细胞壁提取物、缓冲液、底物、显色剂等。
2. 仪器：分光光度计、恒温水浴锅、移液器、离心机、试管等。
四、实验步骤1. 配制底物溶液：取一定量的细菌细胞壁提取物，加入适量的缓冲液，充分溶解后备用。
2. 溶菌酶溶液配制：取一定量的溶菌酶粗提液，加入适量的缓冲液，充分溶解后备用。
3. 设置实验组与空白组：a. 实验组：取一定量的底物溶液，加入适量的溶菌酶溶液，混匀后置于恒温水浴锅中，反应一定时间。
b. 空白组：取一定量的底物溶液，加入等量的缓冲液，混匀后置于恒温水浴锅中，反应一定时间。
4. 取出实验组和空白组溶液，加入适量的显色剂，混匀后静置一定时间。
5. 使用分光光度计测定实验组和空白组的吸光度值。
6. 根据标准曲线，计算溶菌酶的数量。
五、结果与分析1. 标准曲线绘制：以溶菌酶浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。
2. 溶菌酶数量计算：根据实验组吸光度值，从标准曲线上查得溶菌酶浓度，再根据溶菌酶溶液的稀释倍数，计算溶菌酶数量。
六、讨论1. 实验误差分析：a. 溶菌酶溶液的配制：在配制溶菌酶溶液时，应严格控制溶液的浓度，避免因浓度过高或过低而影响实验结果。
b. 反应条件：在实验过程中，应严格控制反应条件，如pH、温度等，以确保实验结果的准确性。
c. 仪器误差：分光光度计的准确度、吸光度读数的准确性等因素也会对实验结果产生影响。
2. 实验结果分析：通过本实验，我们成功测定了溶菌酶的数量，并分析了实验误差。
溶菌酶的鉴别实验报告
一、实验目的1. 掌握溶菌酶的基本特性。
2. 学习溶菌酶的提取和分离纯化方法。
3. 通过实验鉴别溶菌酶与其他类似酶的活性差异。
二、实验原理溶菌酶（Lysozyme）是一种广泛存在于动物、植物和微生物细胞中的酶，具有水解细菌细胞壁肽聚糖的作用，从而破坏细菌细胞壁，导致细菌死亡。
本实验通过提取溶菌酶，对其活性进行测定，并与其他类似酶进行对比，以鉴别溶菌酶的特性。
三、实验材料与仪器材料：1. 鸡蛋2. 生理盐水3. 磷酸盐缓冲液（pH 7.0）4. 硫酸铵5. 葡萄糖6. 硫酸铜7. 酚红指示剂8. 酶活性测定试剂盒仪器：1. 电子天平2. 离心机3. 烧杯4. 移液器5. 显微镜6. 恒温水浴锅四、实验方法1. 溶菌酶提取：（1）取鸡蛋，去壳，取蛋黄；（2）将蛋黄放入烧杯中，加入适量的生理盐水，用玻璃棒搅拌；（3）将搅拌好的蛋黄液离心（3000 rpm，10 min）；（4）取上清液，即为溶菌酶粗提液。
2. 溶菌酶分离纯化：（1）将溶菌酶粗提液加入适量的硫酸铵，使蛋白质沉淀；（2）离心（3000 rpm，10 min）；（3）取沉淀，加入适量的磷酸盐缓冲液，溶解蛋白质；（4）重复上述步骤，直至蛋白质纯度达到预期。
3. 酶活性测定：（1）取酶活性测定试剂盒，按照说明书进行操作；（2）分别测定溶菌酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶的酶活性。
4. 溶菌酶与其他酶的鉴别：（1）将溶菌酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶分别制成酶液；（2）在显微镜下观察酶液对细菌细胞壁的破坏情况；（3）根据酶活性测定结果和显微镜观察结果，鉴别溶菌酶与其他酶的差异。
五、实验结果与分析1. 溶菌酶提取：成功提取出溶菌酶粗提液，蛋白质含量约为0.5 mg/mL。
2. 溶菌酶分离纯化：经过多次硫酸铵沉淀和磷酸盐缓冲液溶解，蛋白质纯度达到90%以上。
3. 酶活性测定：溶菌酶的酶活性为50 U/mL，葡萄糖氧化酶的酶活性为30 U/mL，β-半乳糖苷酶的酶活性为20 U/mL。
实验 溶菌酶的粗提取、分离纯化及酶活力、纯度及分子量测定
43
实验3溶菌酶的纯度鉴定与分子量测定
实验目的: 1、通过实验的学习与操作，在实验过程更好的理解SDS-聚丙
烯酰胺凝胶（PAGE）测定蛋白质纯度与分子量的原理与依据；
2、掌握电泳原理以及SDS-PAGE垂直板电泳分析蛋白质技术； 3、熟悉垂直板电泳操作原理和方法，凝胶染色与脱色方法， SDS-PAGE分子量测定图谱的绘制与计算； 4、了解在电泳中分子量标准物的使用。
13
离心机操作
平衡、定温、定速、定时。
14
实验一、 溶菌酶的粗提取——略
15
酶精纯化常用技术
透析
膜分离技术
超滤
凝胶过滤（分子筛/排阻）层析 离子交换层析 疏水层析 吸附层析
柱层析技术
亲和层析
蛋白质结晶
反相层析
16
Principles of Operation for Chromatography Techniques
称为1标准单位。
2.酶的比活力：
每单位酶蛋白所含的活力单位数。
对固体酶：用活力单位 /mg 酶蛋白、或活力单
位/mg酶蛋白氮来表示；
对液体酶：用活力单位/ml酶液来表示。
很明显，比活力越大，酶的活力越大。
37
3.具体测定方法
分光光度法：产物与适当的化学试剂生成有色物质 或产物有紫外吸收的能力可采用此法。
—CH2COO－ —C3H6SO3－
23
化学原料合成 ： sephadex sepharose 载体
天然材料制成： cellulose
如：DEAE-Sepharose， CM-Sepharose
24
实验设计原理
利用不同的蛋白质分子在溶液中所带电 荷不同，因而与离子交换剂有不同吸附力
实验十-溶菌酶提取、分离、纯化及生物学性质、理化性质
实验七溶菌酶的制备及其性质【实验目的】同羧肽酶实验【实验要求】同羧肽酶实验【实验内容】1.溶菌酶Y活性检测⑴酶活力测定方法⑵酶活力单位定义⑶比活力定义⑷蛋白含量测定方法2. 蛋清溶菌酶的提取⑴每组4～5个新鲜鸡蛋⑵利用等电点沉淀及树脂层析等方法进行溶菌酶提取3. 溶菌酶的分离、纯化⑴利用各种方法，从上述提取液分离⑵每步纯化前蛋白纯度检测⑶分离纯化过程中跟踪检测活性组份的蛋白质含量和酶活性4. 溶菌酶理化性质⑴溶菌酶的分子量测定⑵溶菌酶的等电点测定5. 溶菌酶的酶学性质⑴在活力单位定义确定后，求出溶菌酶的Vmax和Km⑵初步确定溶菌酶的最适pH⑶初步确定溶菌酶的最适温度⑷提出最少两种溶菌酶的可逆抑制剂并验证抑制类型⑸提出溶菌酶的激活性并验证(6) 溶菌酶的热稳定性【实验原理】溶菌酶（lysozyme）是由弗莱明在1922年发现的，它是一种有效的抗菌剂，全称为1，4-β-N-溶菌酶，又称作粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶或胞壁质酶。
活性中心为天冬氨酸52和谷氨酸35，是一种糖苷水解酶，能催化水解粘多糖的N-乙酰氨基葡萄糖（NAG）与N-乙酰胞壁酸（NAM）间的β-1，4糖苷键，相对分子质量14700Da，由129氨基酸残基构成，由于其中含有较多碱性氨基酸残基，所以其等电点高达10.8左右，最适温度为50O C，最适PH为6～7左右。
在280nm的消光系数[%1A]1cm 为13.0。
该酶活性可被一些金属离子Cu2+、Fe2+、Zn2+（10-5～10-3M）以及N-乙酰葡萄糖胺所抑制，能被Mg2+、Ca2+（10-5～10-3M）、NaCl所激活。
溶菌酶广泛存在于动植物及微生物体内，鸡蛋(含量约为2%～4%)和哺乳动物的乳汁是溶菌酶的主要来源，目前，溶菌酶仍属于紧销的生化物质，广泛应用于医学临床，具有抗感染、消炎、消肿、增强体内免疫反应等多种药理作用。
溶菌酶常温下在中性盐溶液中具有较高天然活性，在中性条件下溶菌酶带正电荷，因此在分离制备时，先后采用等电点法，D152型树脂柱层析法除杂蛋白，再经Sephadex G-50层析柱进一步纯化。
溶菌酶的提取和活性测定
实验讲义溶菌酶的提取和活性测定南方医科大学药学院I 溶菌酶的提取和部分纯化【试验目的】掌握根据等电点的差异，用离子交换层析方法进行分离纯化蛋白质。
【试验原理】溶菌酶（lysozyme ）又称胞壁质酶，是一种具有抗菌作用的粘多糖酶，相对分子量为1.44×104，可以催化水解细菌细胞壁N－乙酰胞壁酸和N－乙酰氨基葡萄糖的ß－1，4糖苷键，使细胞壁不溶性多糖成份分解成可溶性的糖肽，细菌细胞内容物溢出，使细菌溶解。
溶菌酶广泛存在于动植物中，比如鸡蛋、人的泪液、乳汁等等，其中以鸡蛋清中的含量最高。
下表是鸡蛋清中各种蛋白质的种类、含量和某些特性。
从表中可以看出，蛋清中大部分蛋白质的等电点在6.05以下，只有溶菌酶和卵白素的等电点在10以上，而溶菌酶的含量是卵白素的70倍。
在pH值7.0的缓冲液中，只有溶菌酶和卵白素带正电荷，其他蛋白质带负电荷，因此，可以通过阳离子交换层析，把溶菌酶和其他蛋白质分离，使溶菌酶得到部分纯化。
【仪器、材料和试剂】(一)、仪器分光光度计（二）、材料1、磷酸氢二钠（Na2HPO4）2、磷酸二氢钠（NaH2PO4）3、新鲜鸡蛋4、Amberlite阳离子交换树脂5、氯化钠（三）试剂1、PBS缓冲液：0.10M的磷酸盐缓冲液，pH7.0。
2、杂蛋白洗脱液：NaCl溶于0.10M的磷酸盐缓冲液（pH7.0），浓度0.05M。
3、溶菌酶洗脱液：NaCl溶于0.10M的磷酸盐缓冲液（pH7.0），浓度0.5M。
【实验步骤】（一）树脂的再生Amberlite阳离子交换树脂用0.5mol/L NaOH 浸泡30min，水洗至中性；再用0.5mol/L HCl 浸泡30min，水洗至中性。
在PBS缓冲液平衡12小时以上。
（二）蛋清样品的准备市售新鲜鸡蛋3个，破蛋壳取出蛋清，除去黏稠状物体，加入2倍体积的PBS 缓冲液（pH7.0），搅拌均匀。
八层纱布过滤，取30ml澄清液体，其中取0.5mL 置于EP管中，于-20°C冻存备用，标记为样品1。
溶菌酶试验实验报告
一、实验目的1. 熟悉溶菌酶的提取、分离纯化方法；2. 掌握酶活力和蛋白浓度的测定方法；3. 了解溶菌酶的纯度鉴定与分子量测定方法。
二、实验原理溶菌酶（Lysozyme）是一种广泛存在于动物、植物和微生物中的胞壁质酶，能够特异性地水解细菌细胞壁中的N-乙酰胞壁质，从而破坏细菌细胞壁，导致细菌死亡。
本实验旨在通过提取、分离纯化溶菌酶，并对其酶活力、蛋白浓度、纯度和分子量进行测定。
三、实验材料1. 材料：鸡蛋、牛肉膏蛋白胨培养基、细菌培养液、SDS-PAGE凝胶、考马斯亮蓝G-250染液等；2. 仪器：高速离心机、紫外分光光度计、电泳仪、凝胶成像系统等；3. 试剂：氯化钠、氢氧化钠、醋酸、乙二胺四乙酸（EDTA）、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、考马斯亮蓝G-250、十二烷基硫酸钠（SDS）等。
四、实验方法1. 溶菌酶的粗提取（1）取新鲜鸡蛋，去壳，将蛋白与蛋黄分离；（2）将蛋白放入烧杯中，加入适量的氯化钠溶液，搅拌溶解；（3）将溶液过滤，得到滤液；（4）将滤液用氢氧化钠溶液调节pH值至7.0，室温下放置1小时；（5）将溶液用醋酸溶液调节pH值至5.0，静置沉淀；（6）将沉淀用离心机离心（3000 r/min，10分钟），取上清液作为粗提液。
2. 溶菌酶的分离纯化（1）将粗提液用EDTA溶液处理，去除蛋白中的金属离子；（2）将处理后的溶液用磷酸缓冲液（pH 7.0）调节pH值，静置沉淀；（3）将沉淀用离心机离心（3000 r/min，10分钟），取上清液；（4）将上清液用SDS-PAGE凝胶电泳分离，观察溶菌酶的条带位置；（5）根据电泳结果，收集目标条带，并进行浓缩。
3. 酶活力和蛋白浓度测定（1）酶活力测定：将收集到的浓缩液加入细菌培养液中，在37℃下反应一定时间，测定细菌存活率，根据公式计算酶活力；（2）蛋白浓度测定：采用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白浓度。
4. 溶菌酶纯度鉴定与分子量测定（1）纯度鉴定：将分离纯化的溶菌酶样品进行SDS-PAGE凝胶电泳，观察电泳图谱，判断纯度；（2）分子量测定：将分离纯化的溶菌酶样品进行SDS-PAGE凝胶电泳，根据分子量标准曲线计算溶菌酶的分子量。
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溶菌酶的提取及系列性质的测定摘要本文研究了从新鲜蛋清中提取溶菌酶的方法及其溶菌酶一系列性质的测定。
通过采用离子交换树脂和硫酸铵沉淀法对鸡蛋清中的酶提取，采用凝胶层析法对提取的溶菌酶进一步纯化，并用考马斯亮蓝G-250试剂，脲的试剂及SDS-PAGE不连续电泳的原理和实验方法分别对溶菌酶的酶活力、蛋白质浓度、酶促动力学、分子量及纯度进行了测定。
关键字：新鲜鸡蛋，溶菌酶，提取，性质，测定溶菌酶的简介溶菌酶又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶、球蛋白G，是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。
主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1，4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。
溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。
溶菌酶相对分子质量约为1.44×104，是一种强碱性蛋白质，等电点在10.0以上，并对温度和酸不敏感。
在自然界中，普遍存在于鸟类和家禽的蛋清中，哺乳动物的泪、唾液、血浆、尿液、淋巴液等细胞中，植物卷心菜、萝卜、木瓜等，以蛋清含量最丰富，约为0.3%。
实验目的：1、了解酶的基本研究过程。
2、掌握溶菌酶提取和性质测定中的实验方法。
3、熟悉有关生化技术的基本原理和基本操作。
I．实验准备一实验目的1.熟悉并了解整个实验流程。
2.熟练掌握各种溶液的配制。
二实验仪器及材料仪器：柱层析系统（层析柱，恒流泵，紫外监测仪，部分收集器），Sigma高速冷冻离心机，722s分光光度计，透析袋，水浴锅，电泳仪，电泳槽，紫外凝胶成像系统。
材料：新鲜鸡蛋。
试剂：（1）弱酸性阳离子交换树脂；（2）磷酸氢二钠；（3）磷酸二氢钠；（4）氯化钠；（5）硫酸铵；（6）氢氧化钠；（7）甘油；（8）盐酸；（9）葡聚糖凝胶G-50；（10）溶壁微球菌干粉；（11）考马斯亮蓝G-250；（12）95%乙醇；（13）85%磷酸；（14）牛血清清蛋白(BSA)；（15）脲；（16）丙烯酰胺（Acr）；（17）甲叉双丙烯酰胺（Bis）；（18）四甲基乙二胺（TEMED）；（19）甘氨酸(Gly)；（20）过硫酸铵（AP）；（21）考马斯亮蓝R-250；(22)三羟甲基氨基甲烷（Tris）；（23）2-β-巯基乙醇；（24）十二烷基磺酸钠（SDS）；（25）溴酚蓝；（26）冰醋酸；（27）标准蛋白：SDS-低相对分子质量标准蛋白.三试剂配制(1) 0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.0；【配置成5*500ml，临用前稀释】(2) 2mol/L NaOH；200ml(3) 2mol/L HCl；200ml(4) 含50%甘油的0.1mol/L 磷酸盐缓冲液，pH 7.0；200ml(5) 含0.05mol/L NaCl的磷酸盐缓冲液，pH7.0；（现用现配）【临用前配置】200ml(6) 含0.5 mol/L NaCl的磷酸盐缓冲液，pH7.0；（现用现配）【临用前配置】200ml(7) 含0.1 mol/L NaCl的磷酸盐缓冲液，pH7.0；（现用现配）【临用前配置】(8) 测活缓冲液：含30mmol/L NaCl的0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.0；(9) 底物溶液Ⅰ：40mg溶壁微球菌干粉溶于100mL测活缓冲液中；【公用，临用前配置】(10) 考马斯亮蓝G-250试剂：考马斯亮蓝G-250 100mg溶于50mL 95%乙醇中，加入100mL 85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000mL，滤纸过滤；【公用】(11) 标准蛋白质溶液：用0.1mol/L NaCl的0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.0配制1mg/ml牛血清清蛋白溶液；（100ml）(12) 底物溶液Ⅱ：300mg溶壁微球菌干粉溶于100ml测活缓冲液中；【公用，临用前配置】(13) 10mol/L 脲，测活缓冲液配制；【50ml】(14) 30%胶贮液：每100mL中含丙烯酰胺29.2g，甲叉双丙烯酰胺0.8g；【100ml公用】(15) 1.5mol/L Tris-HCl pH 8.8；【100ml公用】(16) 0.5mol/L Tris-HCl pH 6.8；【100ml公用】(17) 10%（W/V）过硫酸铵；【现用现配】(18) SDS电泳缓冲液：25mmol/L Tris，0.192mol/L Gly，0.1%（W/V）SDS；【500ml】(19) 10%（W/V）SDS；【10ml】(20) 染色液：0.2g考马斯亮蓝R-250，42mL工业酒精，10mL冰醋酸，加蒸馏水至100mL；【50ml】(21) 脱色液：5mL冰醋酸，45mL工业酒精，50mL蒸馏水；【100ml】(22) 保存液：7%冰醋酸；(现用现配)(23) 2×上样缓冲液：【公用，10ml】0.5mol/L Tris-HCl pH 6.8 2mL甘油2mLSDS 0.4g0.1%溴酚蓝0.5mL2-β-巯基乙醇0.5mL蒸馏水 2.5mL注意事项：1.准确称量各种药品试剂从而防止实验误差的产生2,量取各种液体试剂时必须准确是实验结果更加精准。
II．溶菌酶的提取及纯化一、实验原理离子交换树脂是一类具有网状结构的高分子聚合物。
树脂的网状结构的骨架部分一般很稳定，对于酸，碱和一般溶剂都不起作用，且不溶于这些溶剂中。
这种网状结构的骨架上有许多可以被交换的活性基团。
按可以被交换的活性基团的不同，离子交换树脂可分成阳离子交换树脂和阴离子交换树脂。
硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。
高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。
各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。
这种方法称之为盐析。
盐浓度通常用饱和度来表示。
硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。
二、实验步骤及流程图三、实验结果记录蛋清样品制备：鸡蛋两个，破壳取蛋清，加入1.5×0.1mol 磷酸盐缓冲液（PH=7.0），搅拌均匀。
八层纱布过滤两次，取上清液，量取记录体积V 1留取0.4ml 上清液，1：1加50%甘油，装1号管中，-20℃备用阳离子交换树脂再生：50gAmberlite-CG-50 阳离子交换树脂先用2mol/lNaOH 浸泡30分钟，水洗至中性，再用HCl 浸泡30分钟，水洗至中性。
平衡：用0.1mol/l 缓冲液将树脂平衡为PH=7.0吸附：在平衡好的树脂中加入蛋清样品，轻微搅拌，搅拌吸附1h 。
洗涤：倒去其余上清，树脂用100ml0.1M 磷酸盐缓冲液，pH7.0洗涤三遍 留取0.4ml 上清液，1：1加50%甘油，装入2号管中，-20℃保存装柱：将树脂搅拌均匀装入层析柱中，用300mL 含0.05mol/LNaCl 的磷酸盐缓冲液洗涤杂蛋白。
洗脱：用300mL 含0.5mol/LNaCl 的磷酸盐缓冲液以3mL/min 的流速进行洗脱，收集对应最大最高峰的样品，量取体积V 2并记录。
留取0.4ml 上清液，1：1加50%甘油，装入2#管中，-20℃保存沉淀：每100mL 上清液中缓慢加入35克固体硫酸铵，静置30min ，然后用10000rpm/min 转速离心10min ，取沉淀用0.5mol 含0.1mol/L naC 的PBS 缓冲液溶解30-60min ，在用同样转速离心5min ，留取0.05ml 上清液，1：1加50%甘油，装入3#管中，-20℃保存分子筛层析：溶解后硫酸铵沉淀用10000rpm/min 转速离心3min ，用分子筛洗脱，控制流速为15mL 每小时，分部收集洗脱峰。
合并光吸收高峰管。
透析浓缩：将收集到的样品装入透析带中，在含50%甘油的PBS 缓冲液中透析浓缩4小时。
所得样品标号为4#，-20℃保存。
图一阳离子交换树脂洗脱图图二分子筛层析图四．结果分析与思考由阳离子交换树脂洗脱峰观察知只有一个较大的洗脱峰，说明之前一步的除杂蛋白过程进行的是非常好的。
事实上，我们做的也非常认真。
在其他组都赶时间往前做的时候，我们还是保证流速恒定，时间控制在4个小时左右。
但之前由于我的失误，第一次在最大峰出来后没能及时记录，害的全组同学都重头再来了一遍。
好在我们犯错比较早，还有时间补救；同组的同学也都十分宽容，没有抱怨，大家齐心协力，分工明确，第二次也就非常的顺利。
这也教会我团队合作的重要性。
分子筛的洗脱峰也是比较好的。
之前在杂蛋白出峰以后很长时间吸光度值都没有变化，大家都很紧张，担心这就是唯一的峰。
当数据降到很低的时候，大家都有些绝望。
但经过冷静的分析思考，我们觉得既然降到很低，说明它肯定会再次升高，况且王老师说了只要不出现负值都是对的，耐心等待就好，而且我们也仔细回忆了之前的步骤，并没有特别的失误。
所以大家在王老师的安慰下耐心的等等看。
也许是好心有好报，最后终于出峰了！大家都特别的激动。
所以说做实验千万不能急功近利，也不要看别的组都跑完了而自己乱了阵脚。
只要操作规范，一般是不会失误的。
五：注意事项⑴搅拌时一定不能使用磁力搅拌器搅拌，以免将树脂磨碎。
⑵装柱前，先检测层析柱是否洁净，检查是否漏水；将树脂装柱前首先应在柱中加入少量平衡缓冲液。
⑶装柱过程中绝对不可以出现流干现象，流速不得超过3ml/min。
⑷分子筛装柱时，一定要用胶头滴管环壁加入，静置至界面明显后方可洗脱。
⑸加入固体硫酸铵时要缓慢。
⑹过筛前一定要将检测器调0，并且赶走气泡。
⑺制备样品冷冻时不要忘记加等体积的甘油，以防冻裂。
另外解冻后的样品是不能再次冷冻的。
III．活力、蛋白浓度测定一、实验原理棕红色的染料考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合后，形成蓝色复合物，最大吸光度值由465变为595nm，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白和染料的结合符合比尔定律，通过测定595nm处的吸光度值的增加量可对蛋白质浓度进行定量测定。
溶菌酶是一种N-乙酰胞壁质肽聚糖水解酶，可以催化水解细菌细胞壁N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之间的β-1，4糖苷键，使细胞壁不溶性多糖分解成可溶性糖肽，使细菌溶解。
本实验以溶壁微球菌为底物，通过测量细菌悬液浊度的变化来测定溶菌酶的活性。
二,实验仪器及试剂仪器：722s分光光度计试剂：测活缓冲液；底物溶液Ⅰ；考马斯亮蓝G-250试剂；准蛋白质溶液.试剂配制过程见I.实验准备(原始记录纸)三、实验步骤及流程图四：实验内容及步骤1.蛋白浓度的测定(1)标准曲线的制定取14支试管，按下表分两组进行平行操作。
管号 0 1 2 3 4 5 6 标准蛋白质溶液/ml 00.010.020.030.040.050.06测活缓冲液 0.100.090.080.07 0.060.050.04考马斯亮蓝G-2505ml摇匀，1h 内以0号试管为空白对照，在595nm 处比色A 595nm0.1820.0.2420.0.5530.0.6780.8230.995绘制标准曲线：以A 595nm 为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，绘制标准曲线。