溶菌酶的提取及系列性质的测定

溶菌酶的提取及系列性质的测定

摘要

本文研究了从新鲜蛋清中提取溶菌酶的方法及其溶菌酶一系列性质的测定。通过采用离子交换树脂和硫酸铵沉淀法对鸡蛋清中的酶提取，采用凝胶层析法对提取的溶菌酶进一步纯化，并用考马斯亮蓝G-250试剂，脲的试剂及SDS-PAGE不连续电泳的原理和实验方法分别对溶菌酶的酶活力、蛋白质浓度、酶促动力学、分子量及纯度进行了测定。

关键字：新鲜鸡蛋，溶菌酶，提取，性质，测定

溶菌酶的简介

溶菌酶又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶、球蛋白G，是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1，4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。溶菌酶相对分子质量约为1.44×104，是一种强碱性蛋白质，等电点在10.0以上，并对温度和酸不敏感。在自然界中，普遍存在于鸟类和家禽的蛋清中，哺乳动物的泪、唾液、血浆、尿液、淋巴液等细胞中，植物卷心菜、萝卜、木瓜等，以蛋清含量最丰富，约为0.3%。实验目的：

1、了解酶的基本研究过程。

2、掌握溶菌酶提取和性质测定中的实验方法。

3、熟悉有关生化技术的基本原理和基本操作。

I．实验准备

一实验目的

1.熟悉并了解整个实验流程。

2.熟练掌握各种溶液的配制。

二实验仪器及材料

仪器：柱层析系统（层析柱，恒流泵，紫外监测仪，部分收集器），Sigma高速冷冻

离心机，722s分光光度计，透析袋，水浴锅，电泳仪，电泳槽，紫外凝胶成像系统。

材料：新鲜鸡蛋。

试剂：（1）弱酸性阳离子交换树脂；（2）磷酸氢二钠；（3）磷酸二氢钠；（4）氯化钠；（5）硫酸铵；（6）氢氧化钠；（7）甘油；（8）盐酸；（9）葡聚糖凝胶G-50；（10）溶壁微球菌干粉；（11）考马斯亮蓝G-250；（12）95%乙醇；（13）85%磷酸；（14）牛血清清蛋白(BSA)；（15）脲；（16）丙烯酰胺（Acr）；（17）甲叉双丙烯酰胺（Bis）；（18）四甲基乙二胺（TEMED）；（19）甘氨酸(Gly)；（20）过硫酸铵（AP）；（21）考马斯亮蓝R-250；(22)三羟甲基氨基甲烷（Tris）；（23）2-β-巯基乙醇；（24）十二烷基磺酸钠（SDS）；

（25）溴酚蓝；（26）冰醋酸；（27）标准蛋白：SDS-低相对分子质量标准蛋白.

三试剂配制

(1) 0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.0；【配置成5*500ml，临用前稀释】

(2) 2mol/L NaOH；200ml

(3) 2mol/L HCl；200ml

(4) 含50%甘油的0.1mol/L 磷酸盐缓冲液，pH 7.0；200ml

(5) 含0.05mol/L NaCl的磷酸盐缓冲液，pH7.0；（现用现配）【临用前配置】200ml

(6) 含0.5 mol/L NaCl的磷酸盐缓冲液，pH7.0；（现用现配）【临用前配置】200ml

(7) 含0.1 mol/L NaCl的磷酸盐缓冲液，pH7.0；（现用现配）【临用前配置】

(8) 测活缓冲液：含30mmol/L NaCl的0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.0；

(9) 底物溶液Ⅰ：40mg溶壁微球菌干粉溶于100mL测活缓冲液中；【公用，临用前

配置】

(10) 考马斯亮蓝G-250试剂：考马斯亮蓝G-250 100mg溶于50mL 95%乙醇中，加入100mL 85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000mL，滤纸过滤；【公用】

(11) 标准蛋白质溶液：用0.1mol/L NaCl的0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.0配制1mg/ml

牛血清清蛋白溶液；（100ml）

(12) 底物溶液Ⅱ：300mg溶壁微球菌干粉溶于100ml测活缓冲液中；【公用，临用

前配置】

(13) 10mol/L 脲，测活缓冲液配制；【50ml】

(14) 30%胶贮液：每100mL中含丙烯酰胺29.2g，甲叉双丙烯酰胺0.8g；【100ml公

用】

(15) 1.5mol/L Tris-HCl pH 8.8；【100ml公用】

(16) 0.5mol/L Tris-HCl pH 6.8；【100ml公用】

(17) 10%（W/V）过硫酸铵；【现用现配】

(18) SDS电泳缓冲液：25mmol/L Tris，0.192mol/L Gly，0.1%（W/V）SDS；【500ml】

(19) 10%（W/V）SDS；【10ml】

(20) 染色液：0.2g考马斯亮蓝R-250，42mL工业酒精，10mL冰醋酸，加蒸馏水至

100mL；【50ml】

(21) 脱色液：5mL冰醋酸，45mL工业酒精，50mL蒸馏水；【100ml】

(22) 保存液：7%冰醋酸；(现用现配)

(23) 2×上样缓冲液：【公用，10ml】

0.5mol/L Tris-HCl pH 6.8 2mL

甘油2mL

SDS 0.4g

0.1%溴酚蓝0.5mL

2-β-巯基乙醇0.5mL

蒸馏水 2.5mL

注意事项：1.准确称量各种药品试剂从而防止实验误差的产生

2,量取各种液体试剂时必须准确是实验结果更加精准。

II．溶菌酶的提取及纯化

一、实验原理

离子交换树脂是一类具有网状结构的高分子聚合物。树脂的网状结构的骨架部分一般很稳定，对于酸，碱和一般溶剂都不起作用，且不溶于这些溶剂中。这种网状结构的骨架上有许多可以被交换的活性基团。按可以被交换的活性基团的不同，离子交换树脂可分成阳离子交换树脂和阴离子交换树脂。

硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。