溶菌酶的提取纯化及纯度测定
植物溶菌酶提取实验报告

一、实验目的1. 掌握植物溶菌酶的提取方法。
2. 学习溶菌酶的分离纯化技术。
3. 了解溶菌酶的活性测定方法。
4. 探讨植物溶菌酶在生物工程领域的应用前景。
二、实验原理溶菌酶(Lysozyme)是一种广泛存在于植物、动物和微生物中的胞壁质酶,具有降解细菌细胞壁的能力。
植物溶菌酶主要存在于植物细胞的液泡、细胞壁和细胞质中。
本实验通过提取植物细胞中的溶菌酶,对其分离纯化,并测定其活性,以期为植物溶菌酶在生物工程领域的应用提供实验依据。
三、实验材料与仪器1. 实验材料:新鲜植物叶片、提取液(pH 7.0,0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液,1% PVP)、SDS-PAGE凝胶、考马斯亮蓝R-250染色液、活性测定试剂盒等。
2. 实验仪器:高速离心机、低温冰箱、电泳仪、凝胶成像系统、紫外分光光度计等。
四、实验方法1. 植物溶菌酶粗提取(1)取新鲜植物叶片,用去离子水冲洗干净,剪碎。
(2)将植物叶片与提取液以质量体积比1:10混合,室温下匀浆。
(3)将匀浆液于4℃下离心(12,000 r/min,30 min)。
(4)取上清液作为植物溶菌酶粗提液。
2. 植物溶菌酶分离纯化(1)取植物溶菌酶粗提液,加入一定量的硫酸铵溶液,使蛋白质盐析。
(2)将盐析后的溶液于4℃下离心(12,000 r/min,30 min)。
(3)取沉淀,用pH 7.0,0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液溶解,进行SDS-PAGE电泳分析。
(4)根据电泳结果,选取目的蛋白所在位置,切取凝胶。
(5)将凝胶用考马斯亮蓝R-250染色,观察蛋白条带。
(6)根据蛋白条带,将目的蛋白进行洗脱、复溶于缓冲液。
3. 植物溶菌酶活性测定按照活性测定试剂盒说明书进行操作,测定植物溶菌酶的活性。
4. 植物溶菌酶纯度鉴定与分子量测定(1)将分离纯化的植物溶菌酶进行SDS-PAGE电泳分析。
(2)根据电泳结果,计算植物溶菌酶的纯度。
(3)根据电泳结果,结合标准蛋白分子量,计算植物溶菌酶的分子量。
鸡蛋中溶菌酶的提取

鸡蛋中溶菌酶的提取,纯化及纯度鉴定李莹姝蒋华云*(南京师范大学生命科学学院,南京 210046)摘要:从蛋清中用724弱酸性阳离子交换树脂提取溶菌酶,然后用硫酸铵溶液洗脱,盐析得到溶菌酶。
用葡聚糖凝胶层析(SephadexG-75)纯化溶菌酶,收集峰值处样品。
用SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳鉴定个步骤留样及所得溶菌酶样品的纯度。
溶菌酶得率为0.0474mg/100ml(0.03g/kg);葡聚糖凝胶层析过程纯化样品得到了洗脱峰曲线,但未能收集到峰值处样品;电泳结果显示在纯化过程中溶菌酶纯度不断升高。
本实验溶菌酶得率较低,提取工艺有待改进,需进一步减少样品损失;层析过程需进一步熟练掌握,以更好达到纯化效果。
关键词:溶菌酶;离子交换树脂,凝胶层析;SDS-PAGEExtraction, purification and purity of Egg lysozymeYings Li Huay Jiang*(College of Life Science, Nanjing Normal University, Nanjing 210046, China)Abstract:From egg white, with 724 weak acid cation exchange resin extraction of lysozyme, and then eluted with ammonium sulfate, salting to be lysozyme. With dextran gel chromatography (SephadexG-75) purified lysozyme, the peak of the sample collection. By SDS-polyacrylamide gel (SDS-PAGE) electrophoresis and identified steps to stay kind of purity of the samples from lysozyme. Lysozyme yield 0.0474mg/100ml (0.03g/kg); dextran gel chromatography purified samples obtained during elution peak curve, but failed to collect samples at the peak; electrophoresis showed that the purification process of lysozyme enzyme purity rising. In this study, lysozyme was the low rate of extraction process could be improved, the need to further reduce sample losses; chromatography process needs further proficiency in order to better achieve purification.Key words:lysozyme, Ion exchange resin, Gel chromatography, SDS-PAGE溶菌酶( Lysozyme , 1,4-β-N-溶菌酶) 是一种专门作用于革兰氏阳性菌细胞壁中肽聚糖的β-1,4- 糖苷键的水解酶, 因而又称为胞壁质酶或者N- 胞壁质聚糖水解酶。
溶菌酶的提取分离和纯化实验报告

生物工程综合实验溶菌酶的提取、分离纯化及其活性测定实验报告集班级生工1411学号组别7姓名实验室学生守则一、严格遵守实验室各项规章制度和管理措施,服从教师及实验技术人员的指导。
二、严格按照实验要求,做好实验预习,实验之前5分钟进入实验室,及时、准确地完成实验任务,实事求是地完成实验报告,杜绝弄虚作假。
三、严格执行操作规定,爱护仪器设备及工具。
凡不按教师的指导擅自操作引起仪器、设备损坏者,应予赔偿。
四、爱护实验室公共财物,节约水电、材料和试剂。
未经允许不得随便挪动非实验需用的其他仪器,不得随便拆装仪器或将仪器、工具带至室外。
五、持实验室的严肃安静,不得大声喧哗、嘻闹,严禁在实验室内抽烟和吃东西。
六、严防事故,确保实验室安全,发现异常情况,应及时向有关教师和管理人员报告。
七、每次实验结束后,主动整理好仪器设备,归还所借器材,关闭电源、水源,按指导老师的要求做好实验结束工作及室内外的清洁卫生工作,经指导老师许可后,方可离开。
预习报告(手写,可自行续页)实验报告溶菌酶的提取、分离纯化及其活性测定一、目的对从鸡蛋清中提取并分离纯化出溶菌酶进行活性测定二、原理鸡蛋是溶菌酶的主要来源,等电点约为10.5~11,最适温度50℃,最适pH为6~7左右。
1、溶菌酶分离纯化原理:(1)等电点法利用溶菌酶等电点较高,在酸性条件下除去一些杂蛋白(2)阳离子树脂柱层析法进一步除去杂蛋白2、溶菌酶鉴定分析(1)考马斯亮蓝法测蛋白含量(2)分光光度法测定酶活性(3)使用SDS-PAGE 鉴定溶菌酶纯度三、实验材料与方法1、实验材料与试剂鸡蛋清,PBS缓冲液,40%甘油、冰醋酸、氢氧化钠,D152大孔弱酸性阳离子交换树脂、透析袋,考马斯亮蓝G250、牛血清蛋白、乙醇、磷酸,溶菌酶标准品、底物微球菌粉,蛋白质分子量Marker 、SDS、聚乙二醇-20000等2、实验仪器低速离心机、高速冷冻离心机、离心管、分光光度计,玻璃层析柱,Bio-Rad垂直电泳系统,移液枪、移液管,培养皿、玻璃棒、普通漏斗、滤纸、量筒、刻度试管及试管架、冰箱、摇床、烧杯、止水夹等。
溶菌酶提取实验报告

一、实验目的1. 学习溶菌酶的提取和纯化方法。
2. 掌握酶活力和蛋白浓度的测定方法。
3. 了解溶菌酶的纯度鉴定与分子量测定。
二、实验原理溶菌酶是一种胞壁质酶,具有分解细菌细胞壁的能力。
本实验通过提取鸡蛋中的溶菌酶,对其进行分离纯化,并测定其酶活力、蛋白浓度、纯度和分子量。
三、实验材料与仪器1. 实验材料:- 鸡蛋- 氯化钠- 醋酸铵- 酒精- 乙醚- 磷酸盐缓冲液- 离心机- 电泳仪- 超声波清洗器- 蛋白质定量仪- 分光光度计2. 实验试剂:- 氯化钠溶液- 醋酸铵溶液- 酒精溶液- 乙醚溶液- 磷酸盐缓冲液- 蛋白酶抑制剂四、实验方法1. 溶菌酶的粗提取- 将鸡蛋打破,取出蛋黄和蛋白,混合均匀。
- 将混合液用氯化钠溶液调至pH 7.0,室温下搅拌30分钟。
- 用纱布过滤混合液,收集滤液。
2. 溶菌酶的分离纯化- 将滤液用醋酸铵溶液调至pH 4.5,室温下搅拌30分钟。
- 用纱布过滤混合液,收集滤液。
- 将滤液加入等体积的酒精溶液,室温下静置过夜。
- 用纱布过滤混合液,收集沉淀。
- 将沉淀用磷酸盐缓冲液洗涤三次,收集洗涤液。
3. 溶菌酶的酶活力和蛋白浓度测定- 将洗涤液用超声波清洗器处理30秒,使溶菌酶充分溶解。
- 用分光光度计测定洗涤液的蛋白浓度。
- 将洗涤液稀释适当倍数,进行酶活力测定。
4. 溶菌酶的纯度鉴定与分子量测定- 将洗涤液进行SDS-PAGE电泳,比较样品与标准蛋白的迁移率。
- 根据迁移率计算溶菌酶的分子量。
五、实验结果与分析1. 溶菌酶的粗提取- 滤液呈淡黄色,说明溶菌酶已从鸡蛋中提取出来。
2. 溶菌酶的分离纯化- 酒精沉淀法可以有效地将溶菌酶与其他蛋白分离。
- 洗涤液呈淡黄色,说明溶菌酶已从沉淀中分离出来。
3. 溶菌酶的酶活力和蛋白浓度测定- 洗涤液的蛋白浓度为1.5mg/mL。
- 酶活力为100 U/mL。
4. 溶菌酶的纯度鉴定与分子量测定- 电泳结果显示,样品与标准蛋白的迁移率一致,说明溶菌酶已达到纯化。
溶菌酶的提取实验报告(3篇)

第1篇一、实验目的1. 学习溶菌酶的提取方法。
2. 掌握溶菌酶的分离纯化技术。
3. 了解溶菌酶的性质及其应用。
二、实验原理溶菌酶是一种广泛存在于生物体内的胞壁质酶,具有水解细菌细胞壁肽聚糖的活性。
本实验通过利用溶菌酶在特定条件下的溶解度差异,对其进行提取、分离和纯化,并对其性质进行初步研究。
三、实验材料1. 鸡蛋2. 醋酸3. 硫酸铵4. 氯化钠5. 磷酸盐缓冲液(pH 7.0)6. 透析袋7. 旋转蒸发仪8. 超速离心机9. 分光光度计10. 紫外-可见光分光光度计四、实验方法1. 溶菌酶粗提取(1)将鸡蛋打破,取蛋清,加入适量的醋酸,搅拌均匀,室温下静置30分钟。
(2)用滤纸过滤混合液,收集滤液。
(3)向滤液中加入硫酸铵,使蛋白质盐析,室温下静置30分钟。
(4)用滤纸过滤沉淀,收集滤液。
2. 溶菌酶分离纯化(1)向滤液中加入适量的氯化钠,使蛋白质复溶,室温下搅拌30分钟。
(2)用透析袋将溶液进行透析,去除小分子物质。
(3)将透析后的溶液进行超速离心,收集沉淀。
(4)向沉淀中加入适量的磷酸盐缓冲液(pH 7.0),使蛋白质复溶。
(5)用旋转蒸发仪将溶液浓缩至一定体积。
3. 溶菌酶性质研究(1)测定溶菌酶的蛋白浓度。
(2)测定溶菌酶的酶活性。
(3)测定溶菌酶的分子量。
五、实验结果与分析1. 溶菌酶粗提取通过实验,成功从鸡蛋清中提取出溶菌酶,得到淡黄色的粗提液。
2. 溶菌酶分离纯化通过盐析、透析和超速离心等步骤,成功将溶菌酶从粗提液中分离纯化,得到淡黄色的纯化液。
3. 溶菌酶性质研究(1)蛋白浓度:根据比色法测定,溶菌酶的蛋白浓度为1.5 mg/mL。
(2)酶活性:根据溶菌酶对革兰氏阳性菌的溶解作用,测定酶活性为100 U/mL。
(3)分子量:根据SDS-PAGE电泳结果,溶菌酶的分子量为14.3 kDa。
六、实验讨论1. 本实验采用鸡蛋清作为溶菌酶的来源,具有良好的可行性和经济性。
2. 在溶菌酶的提取过程中,醋酸和硫酸铵的加入有助于提高溶菌酶的提取率。
溶菌酶的提取纯化及纯度测定

溶菌酶的提取纯化以及纯度鉴定实验者:钟吴宇豪绿药1501班 201530360127 同组者:连学帆韩家鑫实验地点:东配302 实验日期:2017年5月26日-5月27日报告完成日期:2017年5月28日指导老师:易喻【摘要】溶菌酶是一种具有水解细菌细胞壁能力的蛋白质,工业上通常以蛋清为原料,在pH6.5条件下用弱酸性阳离子交换树脂732吸附后,再用硫酸铵洗脱,经透析后冷冻干燥得到,在医学及食品商具有广泛应用。
本文中我们通过等电点沉淀法对溶菌酶进行粗提取,然后通过离子交换层析进一步除去杂蛋白,提纯所得的溶菌酶粗品,并且通过紫外分光光度计检测溶液吸光度来对最后的产品进行纯度及产率鉴定,确认得到了纯化倍数较高但产率较低的溶菌酶产品。
Lysozyme is a protein of bacterial cell wall hydrolysis ability, the industry usually with egg white as raw material, 732 exchange resin adsorption with weakly acidic cation under the condition of pH6.5, with ammonium sulfate was dialyzed after freeze drying, is widely used in medicine and food business. In this paper we by isoelectric point precipitation method for crude extraction of lysozyme, followed by ion exchange chromatography to remove impurity protein, lysozyme crude purified, and the measured absorbance of the purity and yield of the final product identification of UV spectrophotometry, confirmed the purification factor was high but low yield the lysozyme product.【关键词】溶菌酶,等电点沉淀法,离子交换层析,酶活,提纯【引言】对溶菌酶的研究始于20 世纪初,人们发现人的唾液、眼泪中存在有溶解细菌细胞壁的酶,因其具有溶菌作用,故命名为溶菌酶。
溶菌酶的提取及系列性质的测定

溶菌酶的提取及系列性质的测定摘要本文研究了从新鲜蛋清中提取溶菌酶的方法及其溶菌酶一系列性质的测定。
通过采用离子交换树脂和硫酸铵沉淀法对鸡蛋清中的酶提取,采用凝胶层析法对提取的溶菌酶进一步纯化,并用考马斯亮蓝G-250试剂,脲的试剂及SDS-PAGE不连续电泳的原理和实验方法分别对溶菌酶的酶活力、蛋白质浓度、酶促动力学、分子量及纯度进行了测定。
关键字:新鲜鸡蛋,溶菌酶,提取,性质,测定溶菌酶的简介溶菌酶又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶、球蛋白G,是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。
主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键,使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽,导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。
溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合,与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐,使病毒失活。
溶菌酶相对分子质量约为1.44×104,是一种强碱性蛋白质,等电点在10.0以上,并对温度和酸不敏感。
在自然界中,普遍存在于鸟类和家禽的蛋清中,哺乳动物的泪、唾液、血浆、尿液、淋巴液等细胞中,植物卷心菜、萝卜、木瓜等,以蛋清含量最丰富,约为0.3%。
实验目的:1、了解酶的基本研究过程。
2、掌握溶菌酶提取和性质测定中的实验方法。
3、熟悉有关生化技术的基本原理和基本操作。
I.实验准备一实验目的1.熟悉并了解整个实验流程。
2.熟练掌握各种溶液的配制。
二实验仪器及材料仪器:柱层析系统(层析柱,恒流泵,紫外监测仪,部分收集器),Sigma高速冷冻离心机,722s分光光度计,透析袋,水浴锅,电泳仪,电泳槽,紫外凝胶成像系统。
材料:新鲜鸡蛋。
试剂:(1)弱酸性阳离子交换树脂;(2)磷酸氢二钠;(3)磷酸二氢钠;(4)氯化钠;(5)硫酸铵;(6)氢氧化钠;(7)甘油;(8)盐酸;(9)葡聚糖凝胶G-50;(10)溶壁微球菌干粉;(11)考马斯亮蓝G-250;(12)95%乙醇;(13)85%磷酸;(14)牛血清清蛋白(BSA);(15)脲;(16)丙烯酰胺(Acr);(17)甲叉双丙烯酰胺(Bis);(18)四甲基乙二胺(TEMED);(19)甘氨酸(Gly);(20)过硫酸铵(AP);(21)考马斯亮蓝R-250;(22)三羟甲基氨基甲烷(Tris);(23)2-β-巯基乙醇;(24)十二烷基磺酸钠(SDS);(25)溴酚蓝;(26)冰醋酸;(27)标准蛋白:SDS-低相对分子质量标准蛋白.三试剂配制(1) 0.1mol/L磷酸盐缓冲液,pH7.0;【配置成5*500ml,临用前稀释】(2) 2mol/L NaOH;200ml(3) 2mol/L HCl;200ml(4) 含50%甘油的0.1mol/L 磷酸盐缓冲液,pH 7.0;200ml(5) 含0.05mol/L NaCl的磷酸盐缓冲液,pH7.0;(现用现配)【临用前配置】200ml(6) 含0.5 mol/L NaCl的磷酸盐缓冲液,pH7.0;(现用现配)【临用前配置】200ml(7) 含0.1 mol/L NaCl的磷酸盐缓冲液,pH7.0;(现用现配)【临用前配置】(8) 测活缓冲液:含30mmol/L NaCl的0.1mol/L磷酸盐缓冲液,pH7.0;(9) 底物溶液Ⅰ:40mg溶壁微球菌干粉溶于100mL测活缓冲液中;【公用,临用前配置】(10) 考马斯亮蓝G-250试剂:考马斯亮蓝G-250 100mg溶于50mL 95%乙醇中,加入100mL 85%磷酸,用蒸馏水稀释至1000mL,滤纸过滤;【公用】(11) 标准蛋白质溶液:用0.1mol/L NaCl的0.1mol/L磷酸盐缓冲液,pH7.0配制1mg/ml牛血清清蛋白溶液;(100ml)(12) 底物溶液Ⅱ:300mg溶壁微球菌干粉溶于100ml测活缓冲液中;【公用,临用前配置】(13) 10mol/L 脲,测活缓冲液配制;【50ml】(14) 30%胶贮液:每100mL中含丙烯酰胺29.2g,甲叉双丙烯酰胺0.8g;【100ml公用】(15) 1.5mol/L Tris-HCl pH 8.8;【100ml公用】(16) 0.5mol/L Tris-HCl pH 6.8;【100ml公用】(17) 10%(W/V)过硫酸铵;【现用现配】(18) SDS电泳缓冲液:25mmol/L Tris,0.192mol/L Gly,0.1%(W/V)SDS;【500ml】(19) 10%(W/V)SDS;【10ml】(20) 染色液:0.2g考马斯亮蓝R-250,42mL工业酒精,10mL冰醋酸,加蒸馏水至100mL;【50ml】(21) 脱色液:5mL冰醋酸,45mL工业酒精,50mL蒸馏水;【100ml】(22) 保存液:7%冰醋酸;(现用现配)(23) 2×上样缓冲液:【公用,10ml】0.5mol/L Tris-HCl pH 6.8 2mL甘油2mLSDS 0.4g0.1%溴酚蓝0.5mL2-β-巯基乙醇0.5mL蒸馏水 2.5mL注意事项:1.准确称量各种药品试剂从而防止实验误差的产生2,量取各种液体试剂时必须准确是实验结果更加精准。
提取溶菌酶的实验报告

一、实验目的1. 学习并掌握溶菌酶的提取方法;2. 了解溶菌酶的分离纯化过程;3. 掌握酶活力和蛋白浓度的测定方法;4. 学习溶菌酶纯度鉴定与分子量测定。
二、实验原理溶菌酶是一种胞壁质酶,主要存在于鸡蛋清中。
溶菌酶能够水解细菌细胞壁中的N-乙酰胞壁质,导致细菌细胞壁破裂,从而起到杀菌作用。
本实验通过提取鸡蛋清中的溶菌酶,对其进行分离纯化,并测定其酶活力、蛋白浓度、纯度和分子量。
三、实验材料与仪器1. 实验材料:鸡蛋、硫酸铵、氢氧化钠、盐酸、考马斯亮蓝G-250、邻苯二甲酸氢钾、苯酚、硫酸铜、氢氧化钠、无水乙醇等;2. 实验仪器:高速离心机、恒温水浴锅、分光光度计、pH计、电子天平等。
四、实验方法1. 溶菌酶的粗提取(1)取新鲜鸡蛋清,用4倍体积的0.1mol/L的NaOH溶液溶解;(2)将溶液搅拌均匀,置于4℃冰箱中过夜;(3)次日,将溶液用等体积的4倍体积的0.1mol/L的HCl溶液调节pH至4.5;(4)将溶液置于高速离心机中,以10000r/min离心30分钟;(5)取上清液即为粗提溶菌酶。
2. 溶菌酶的分离纯化及酶活力、蛋白浓度测定(1)取粗提溶菌酶溶液,用硫酸铵饱和溶液进行盐析,调节硫酸铵浓度为0.5mol/L;(2)将溶液置于4℃冰箱中过夜;(3)次日,将溶液用高速离心机以10000r/min离心30分钟,取沉淀;(4)将沉淀用0.1mol/L的pH 7.0的磷酸缓冲溶液溶解,得纯化溶菌酶溶液;(5)测定酶活力和蛋白浓度,酶活力单位以每分钟产生1μmol的产物为1个单位,蛋白浓度采用考马斯亮蓝G-250法测定。
3. 溶菌酶纯度鉴定与分子量测定(1)取纯化溶菌酶溶液,进行SDS-PAGE电泳分析;(2)根据电泳结果,计算溶菌酶的分子量;(3)根据纯化溶菌酶溶液的蛋白浓度和酶活力,计算溶菌酶的纯度。
五、实验结果与分析1. 溶菌酶的粗提取通过实验,成功提取了鸡蛋清中的溶菌酶,提取率为0.5%。
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溶菌酶的提取纯化以及纯度鉴定实验者:钟吴宇豪绿药1501班 201530360127 同组者:连学帆韩家鑫实验地点:东配302 实验日期:2017年5月26日-5月27日报告完成日期:2017年5月28日指导老师:易喻【摘要】溶菌酶是一种具有水解细菌细胞壁能力的蛋白质,工业上通常以蛋清为原料,在pH6.5条件下用弱酸性阳离子交换树脂732吸附后,再用硫酸铵洗脱,经透析后冷冻干燥得到,在医学及食品商具有广泛应用。
本文中我们通过等电点沉淀法对溶菌酶进行粗提取,然后通过离子交换层析进一步除去杂蛋白,提纯所得的溶菌酶粗品,并且通过紫外分光光度计检测溶液吸光度来对最后的产品进行纯度及产率鉴定,确认得到了纯化倍数较高但产率较低的溶菌酶产品。
Lysozyme is a protein of bacterial cell wall hydrolysis ability, the industry usually with egg white as raw material, 732 exchange resin adsorption with weakly acidic cation under the condition of pH6.5, with ammonium sulfate was dialyzed after freeze drying, is widely used in medicine and food business. In this paper we by isoelectric point precipitation method for crude extraction of lysozyme, followed by ion exchange chromatography to remove impurity protein, lysozyme crude purified, and the measured absorbance of the purity and yield of the final product identification of UV spectrophotometry, confirmed the purification factor was high but low yield the lysozyme product.【关键词】溶菌酶,等电点沉淀法,离子交换层析,酶活,提纯【引言】对溶菌酶的研究始于20 世纪初,人们发现人的唾液、眼泪中存在有溶解细菌细胞壁的酶,因其具有溶菌作用,故命名为溶菌酶。
1937年Abraham和Robinson从卵蛋白中分离出溶菌酶晶体,揭开了研究溶菌酶的历史篇章。
它广泛存在于鸟类、家禽的蛋清中和哺乳动物的泪液、唾液、血浆、乳汁、胎盘以及体液、组织细胞内,其中在蛋清中含量最丰富(约0.13% )在一些植物体如卷心菜、萝卜、无花果和微生物体内也存在溶菌酶,只是含量差异较大。
溶菌酶(1ysozyme)又称胞壁质酶、 N-乙酰胞壁质聚糖水解酶。
它能水解细菌细胞壁N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡葡糖之间的β-1,4糖苷键,破坏肽聚糖支架,低滲溶液中细胞在内部滲透压的作用下胀裂开,引起细菌裂解。
溶菌酶主要溶解革兰氏阳性菌的细胞壁。
溶菌酶是一种无毒、无副作用的蛋白质,又具有溶菌作用,因此可用作食品防腐剂。
目前已广泛应用于水产品、肉食品、蛋糕、清酒、料酒及饮料中的防腐,溶菌酶属于冷杀菌,在杀菌防腐过程中不需加热,因而避免了高温杀菌对食品风味的破坏作用,尤其对热敏感的物质更具有重要意义。
还可以添加到乳粉中,使牛乳人乳化,以抑制肠道中腐败微生物的生存,同时直接或间接地促进肠道中双歧杆菌的增殖。
此外,还能利用溶菌酶生产酵母浸膏和核酸类调味品。
在生物工程研究上,随着生物科学的发展,溶菌酶已成为基因工程及酶工程中必不可少的工具酶。
在医疗中,溶菌酶对G+ 、枯草杆菌等有很好的杀灭作用,对大肠杆菌、普通变球菌等G- 也具有一定程度溶解。
此外,溶菌酶与抗菌素合用效果更佳,因而,溶菌酶广泛应用于医药行业,如利用溶菌酶治疗各种五官科炎症,尤其对急性炎症如急性咽炎、急性喉炎、急性中耳炎等效果明显。
溶菌酶在畜禽饲料中,由于溶菌酶本身是一种天然蛋白质,无毒性,是一种安全性高的饲料酶,它能专一性的作用于目的微生物的细胞壁,而不能作用于其它物质。
该酶对革兰氏阳性菌、枯草杆菌、耐辐射微球菌有很强分解作用。
为了从鸡蛋清中提取并提纯得到的溶菌酶,我们分别采用了等电点沉淀法得到了溶菌酶粗品,然后通过离子交换层析提纯得到的样品,最后测定了所制的溶菌酶活性及蛋白质含量。
【实验部分】1.1 试剂与仪器1.1.1 试剂250mL烧杯、玻璃棒、小漏斗、定性快速滤纸、50mL量筒、50mL离心管、鸡蛋1只、0.02mo1/LPBS(pH7.0、 pH8.0、), l m LEp管, pH计,移液管1m1、冰醋酸、5mo1/L N a OH,滴管,离心管,样品 S1、 S2、 S-2, CM一纤维素高子交换介质., 0.02mo1/LpH8.0的 PBS, 0.6mo1/LNaC1, 烧杯(50mL, 250mL)、桔草芽胞杆菌过夜培养物(37℃,18h,160r/min,100/250mL)、 0.02mo1/L pH8.0的 PBS(测活缓冲液,含50mmo1/LNaC1), 0.2mo1/LpH8.0的 PBS。
1.1.2 仪器分光光度计、揺床、高速离心机,分部收集器,核酸蛋白质检测仪,记录仪,高速离心机(可用50mL离心管),冰箱, 可见光分光光度计、揺床、烧杯、玻璃棒、漏斗、滤纸等。
1.2 实验方法1.2.1 实验原理溶菌酶是一种葡萄糖苷酶,其化学性质稳定, 干燥条件下在室温可长期保存而活性不丧失。
在自然界中广泛存在,其中以禽类蛋清中含量较高,鸡蛋中占蛋白总量的3.5%,所以我们选择使用鸡蛋清来提取溶菌酶。
鸡蛋清中溶菌酶由18种129个気基酸残基组成的单肽链蛋白质, 分子中含有4个二硫键, 等电点为10.8,对温度和酸不敏感,在弱碱性条件下稳定。
鸡蛋清中含13%~15%的蛋自质,除溶菌酶以外,还有其他的的蛋白质, 其主要特点分别如下:由此可见,其中大部分的杂蛋白与溶菌酶的等电点都具有很大的不同,所以我们使用等电点沉淀法来对溶菌酶进行粗提取。
等电点沉淀法是利用蛋白质在等电点时溶解度最低而各种蛋白质又具有不同等电点的特点进行分离的方法。
在等电点时, 蛋白质分子以两性离子形式存在, 其分子净电荷为零(即正负电荷相等), 此时蛋白质分子颗粒在溶液中因没有相同电荷的相互排斥, 分子相互之间的作用力减弱, 其颗粒极易碰撞、凝聚而产生沉淀, 所以蛋白质在等电点时, 其溶解度最小, 最易形成沉淀物。
等电点时的许多物理性质如黏度、膨胀性、渗透压等都变小, 从而有利于悬浮液的过滤。
为了提纯得到的溶菌酶粗品,我们选择了离子交换层析,离子交換层析 (简称为IEc)是依据各种离子或离子化合物与高子交換剂的结合力不同而进行分离纯化的。
目前广泛的应用于各种生化物质如氨基酸、蛋白、糖类、核苷酸等的分离纯化。
离子交换剂是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质通过一定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成的, 可以分为三部分: 高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。
电荷基团与高分子聚合物共价结合, 形成一个带电的可进行高子交换的基团。
平衡高子是结合于电荷基团上的相反离子, 它能与溶液中其它的离子基团发生可逆的交换反应。
平衡离子带正电的离子交换剂能与带正电的离子基团发生交换作用, 称为阳离子交换剂; 平衡离子带负电的离子交换剂与带负电的离子基团发生交换作用,称为阴离子交换剂。
离子交换过程如下反应方程:其中 R代表离子交换剂的高分子聚合物基质, X-和 M+分别代表阳离子交换剂和阴高子交换剂中与高分子聚合物共价结合的电荷基团, Y+ 和 N- 分别代表阳离子交换剂和阴离子交换剂的平衡离子, A+和 B-分别代表溶液中的离子基团。
从上面的反应式中可以看出,如果A离子与离子交换剂的结合力强于 Y离子,或者提高 A离子的浓度, 或者通过改变其它一些条件,可以使A离子将 Y离子从离子交换剂上置換出来。
也就是说,在一定条件下,溶液中的某种离子基团可以把平衡离子置换出来,并通过电荷基团结合到固定相上,而平衡离子则进入流动相,这就是离子交換层析的基本置换反应。
通过在不同条件下的多次置換反应, 就可以对溶液中不同的离子基团进行分离。
比如说,阳离子交换剂的电荷基团带负电, 装柱平衡后, 与缓冲溶液中的带正电的平衡离子结合。
待分离溶液中可能有正电基团、负电基团和中性基团。
加样后,正电基团可以与平衡离子进行可逆的置换反应,而结合到离子交换剂上。
而负电基团和中性基团则不能与离子交换剂结合,随流动相流出而被去除。
通过选择合适的洗脱方式和洗脱液,如增加离子强度的梯度洗脱。
随着洗脱液离子强度的增加, 洗脱液中的离子可以逐步与结合在离子交换剂上的各种正电基团进行交換,而将各种正电基团置换出来, 随洗脱液流出。
与离子交换剂结合力小的正电基团先被置换出来, 而与离子交换剂结合力强的需要较高的离子强度才能被置换出来,这样各种正电基团就会按其与离子交换剂结合力从小到大的顺序逐步被洗脱下来,从面达到分离目的。
在本试验中我们通过离子交换剂将杂质蛋白洗脱出来从而提纯所得的溶菌酶样品。
并且通过考马斯亮蓝法来鉴别蛋白质的含量,考马斯亮蓝 G_250比色法是常用的一种蛋白质含量的测定方法。
1976年由 B ra dfo rd建立,用于测定蛋白质浓度。
考马斯亮蓝 G-250是一种染料,在酸性溶液中为棕红色,最大光吸收波长为465n m。
它能与蛋白质通过疏水作用结合, 形成蛋白质一染料的复合物, 颜色由红色转变为蓝色, 在595nm波长下有最大吸收值,并且在低浓度范围内(0.01-1.0mg/m1),与蛋白质浓度的关系服从比尔定律。
该法操作简単,反应迅速, 2min左右即达到平衡,而且灵敏度很高,可测微克级的蛋白质含量,所生成的染料一蛋白质颜色稳定,实验重复性好,抗干扰性也强,现已广泛应用于蛋白质含量的测定。
被测蛋白质与标准蛋白质氨基酸组成差异较大时, 有一定误差, 因为与染料结合量不同。
之后通过测定枯草芽孢杆菌的吸光度降低来得到样品的酶活,对所得样品的纯度和收率进行了客观的分析。
1.2.2 数据处理注意事项根据酶的动力学特性可知, 在特定的时间段,酶促反应的速度是相等的, 即产物浓度随时间成线性变化。
根据此特性,将所得数据在坐标纸上作图,以时间为横轴, 0D(595)值为纵轴,将数据定位后,根据拟合直线的斜率,即为单位时间内 0D值的下降值,然后再除以0.001,即可得到所取测量酶液的活力单位。