菌种鉴定实验过程

菌种鉴定实验过程
一、仪器与试剂
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仪器名称仪器来源型号
测序仪Applied Biosystems 3730XL DNA电泳槽北京六一仪器厂DYCP-31DN
稳压电泳仪北京六一仪器厂DYY-5
电热恒温水槽上海一恒科学仪器有限公司DK-8D
凝胶成像仪上海复日科技仪器有限公司FR980
恒温培养箱太仓市科教器材厂DHP-9162
恒温摇床太仓市实验设备厂TH2-C
PCR仪Applied Biosystems 2720 thermal cycler 冷冻高速离心机BBI HC-2518R Surf系列精密单道可调移液器生工SP10-1000 1.
试剂名称试剂来源cat. No.
Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒生工SK8255
Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒生工SK8259
Ezup柱式酵母基因组DNA抽提试剂盒生工SK8257
DreamTaq-TM DNA Polymerase MBI EP0702
dNTP 生工D0056
琼脂糖BBI AB0014
SanPrep柱式DNAJ胶回收试剂盒生工SK8131
DNA Ladder Mix maker 生工SM0337
引物生工合成部合成
枪头、PCR管、离心管等生工铸塑部生产
克隆测序用
pMD®18-T Vector 连接试剂盒Takara D101A
SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒生工SK8191
二、实验过程
1、基因组DNA提取
按SK8255（细菌）、SK8259（真菌）、SK8257（酵母）试剂盒操作。

2、PCR扩增
所属类别名称序列5'→3'扩增序列PCR长度/bp
细菌
7F
1540R
CAGAGTTTGATCCTGGCT
AGGAGGTGATCCAGCCGCA
16S rDNA 1500bp左右27F
1492R
AGTTTGATCMTGGCTCAG
GGTTACCTTGTTACGACTT
16S rDNA 1500bp左右
真菌ITS1
ITS4
TCCGTAGGTGAACCTGCGG
TCCTCCGCTTATTGA TA TGC
内转录间
隔区1和2
600bp左右NS1
NS6
GTAGTCATATGCTTGTCTC
GCATCACAGACCTGTTA TTGCCTC
18S rDNA 1300bp左右
酵母菌NL1
NL4
GCATA TCAATAAGCGGAGGAAAAG
GGTCCGTGTTTCAAGACGG
26S rDNA
D1/D2区
500bp左右
2.2 PCR反应体系：
试剂体积（μl）
Template（基因组DNA 20-50ng/μl）0.5
10×Buffer（with Mg2+） 2.5
dNTP （各2.5mM） 1
酶0.2
F（10uM）0.5
R（10uM）0.5
加双蒸H2O 至25
2.3 PCR循环条件：
温度时间程序
94℃4min 预变性
94℃45 sec
30 cycle
55℃45sec
72℃ 1 min
72℃10 min 修复延伸
4℃∞终止反应
3、凝胶电泳
1％琼脂糖电泳，150V、100mA 20min电泳观察（见电泳图DNA Ladder Mix make）。

16SrDNA 18SrDNA ITS 26S
4、纯化回收
PCR产物电泳条带切割所需DNA目的条带，纯化方式见附见说明书（SK8131 ），PCR 产物用PCR引物直接测序。

如需要做克隆测序需要进行下面的步骤：
5、连接
按Takara pMD®18-T Vector 连接试剂盒操作。

6、感受态细胞的制备：（氯化钙法）
6.1 从于37℃培养16小时的新鲜平板中挑取一个单菌落，转到一个含有100 ml LB培养基的1
L烧瓶中。

于37℃剧烈振摇培养3小时(旋转摇床，300转／分)。

6.2 在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50 ml 聚丙烯管中，在
冰上放置10分钟，使培养物冷却至0℃。

6.3 于4 ℃, 以4000转／分离心10分钟，回收细胞。

6.4 倒出培养液，将管倒置1分钟,使最后残留的痕量培养液流尽。

6.5 以10 ml用冰预冷的0.1 mol／L CaCl2重悬每份沉淀，放置于冰浴上。

6.6 于4℃,，以4000 转／分离心10分钟，回收细胞。

6.7 倒出培养液，将管倒置1分钟,使最后残留的痕量培养液流尽。

6.8 每50ml 初始培养物用2 ml 用冰预冷的0.1 mol/L CaCl2(含20%甘油)重悬每份细胞沉淀。

6.9 将细胞分装成小份(100µl/支)，放于-70℃冻存。

7、连接产物转化
7.1 取100μl感受态细胞，置于冰上，完全解冻后轻轻将细胞均匀悬浮。

7.2 加入10μl连接液，轻轻混匀。

冰上放置30分钟。

7.3 42℃水浴热激90秒。

冰上放置15~20分钟。

7.4 加400μl LB培养基，37℃ 200～250 rpm振荡培养1小时。

7.5 用枪头吸取200μl培养菌液，涂布在预先用20μl 100 mM IPTG和100μl 20 mg/ml X-gal
涂布的氨苄青霉素平板上。

7.6 平板在37℃下正向放置1小时以吸收过多的液体，然后倒置培养过夜。

8、蓝白斑筛选
当外源DNA片段插入到pUC57中后，由于外源DNA的核酸序列存在改变了LacZ基因的
编码，从而影响了其产物β-半乳糖苷酶α-片段的活性，因此重组克隆在X-gal/IPTG平板上
呈现为白色，而非重组克隆呈蓝色，选择在IPTG/X-gal平板上生长的白色菌落，
9、质粒提取与测序
用M13+_引物扩增（体系如上）。

.M13+/-引物测序
三、测序结果分析
16SrDNA 序列在核糖体数据库/index.jsp上比对；
比对结果范例：
domain Bacteria (0/20/1186838) （界）
phylum "Actinobacteria" (0/20/176308)（门）
class Actinobacteria (0/20/176308) （纲）
subclass Actinobacteridae (0/20/167455) （亚纲）
order Actinomycetales (0/20/166237) （目）
suborder Streptomycineae (0/20/10027) （亚目）
family Streptomycetaceae (0/20/10027)（科）
genus Streptomyces (0/20/9681) （属）
S000691624 not_calculated 0.995 1242 Streptomyces sp. a16; DQ513513
匹配程度被匹配菌登录序列长度NCBI上登录号
访问
18SrDNA、ITS、26S在NCBI 上blast比对；结果解释：/p-545514843.html。