荧光分光光度法解析PPT教学课件

• 用于增白洗衣粉中的增白剂，
• 指示信号用的各种荧光路标漆，
• 荧光标志服等。
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荧光增白剂
• 它的特性是能激发入射光线产生荧光， 使所染物质获得类似荧石的闪闪发光的 效应，使肉眼看到的物质很白，达到增 白的效果。
• 其作用是把制品吸收的不可见的紫外线 辐射转变成紫蓝色的荧光辐射，与原有 的黄光辐射互为补色成为白光，提高产 品在日光下的白度。
旋方向不会立刻改变，分子仍处于单重态。
三重态：有两个电子的自旋不配对而平行的状态。
10-14-10-12S
S2
10-13-10-11S
内转移
10-2-10-4S
振动弛豫 内转移 系间窜跃
S1
能 量
吸 收
10-9-10-7S
发
射
外转移
荧
光
S0
l3
l1
l 2 l 2

T1 T2
发 10-4-10S 射 磷 振动弛豫 光
• 2. 荧光光谱：选择λex作激发光源，用另一单色器将 物质发射的荧光分光，记录不同发射波长时的I，作 Iλ光谱图称为荧光光谱。
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图6－8 蒽在乙醇溶液中的镜像光谱
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3.荧光光谱的特点：
①斯托克斯位移（Stokes shift)。与激发光谱相比，
• 分子被激发的能量是由化学反应释放的能 量所提供，其发光现象称为化学发光。
•由生物体内化学反应所引起的发光现象，被称 为生物发光。
• 荧光棒
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• 荧光棒内主要由过氧化物、酯类化合物 和荧光染料三种化学成分构成。荧光棒 发光原理是过氧化物和酯类化合物发生 反应后，能量传递至荧光染料，再由染 料发出荧光。
4.磷光发射：第一电子三线激发态最低振动能级(亚稳态) 的分子以发射辐射（光子）的形式回到基态的不同振 动能级，此过程称为 “磷光发射”。
荧光和磷光的根本区别: 荧光是由单重跃迁-单重引起的， 磷光则由三重跃迁-单重产生的。
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6.2.2.4 分子荧光的类型
• 分子因吸收光能而被激发，所产生的次级 光发射现象称为光致发光；
分子去活化过程及荧光的发生
1. 振动弛豫：在溶液中，处于激发态的溶质分子与溶剂 分子间发生碰撞，把一部分能量以热的形式迅速传递 给溶剂分子（环境），在10-11～10-13 秒时间回到同 一电子激发态的最低振动能级，这一过程称为振动弛 豫。
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2. 内转移：当激发态S2的较低振动能级与S1的较 高振动能级的能量相当或重叠时，分子有可能 从S2的振动能级以无辐射方式过渡到S1的能量 相等的振动能级上，这一无辐射过程称为“内 转换”。（“内转换”过程同样也发生在三线 激发态的电子能级间）
第6章.荧光分光光度法
6.1 概述 6.2 方法原理 6.3 荧光分析法 6.4 荧光分光光度法在生物工程分析中的应用
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6.1 概述
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荧光蛋白质
• 在2008年10月8日，诺贝尔奖委员会将化学 奖授予日本化学家下村修（Osamu Shimomura）、美国科学家马丁•沙尔菲（ Martin Chalfie）和美籍华裔科学家钱永健 （Roger Y. Tsien）三人，以表彰他们“发 现和发展了绿色荧光蛋白质（Green Fluorescent Protein, GFP）”技术。
荧光光谱的波长总是出现在更长的波长处；
②荧光光谱与激发波长无关。无论用λ=250和350nm
作激发光源，所得荧光光谱形状和峰的位置都是相同；
③吸收光谱与发射光谱大致成镜像对称。
6.2.4 荧光量子产率与分子结构
6.2.2.3 激发态→基态的能量传递途径
电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射 跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量。
传递途径
辐射跃迁
无辐射跃迁
荧光 延迟荧光 磷光
系间窜跃 内转移 外转移 振动弛豫
激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大，发 光强度相对大。 荧光：时间较短,第一激发单重态的最低振动能级→基态。 磷光：自旋禁阻，时间较长，第一激发三重态的最低振动能级 →基态。
萤火虫、水母、深海鱼类
发光机制是两种物质——荧光素和荧光素
酶——合作产生的结果
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6.2.3 激发光谱与荧光光谱
• 1. 激发光谱：将激发荧光的光源用单色器分光，连续 改变激发光波长，固定荧光发射波长，测定不同波长激
发光下物质溶液发射的荧光强度(I)，作I—λ光谱图称
激发光谱。
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3.荧光发射：当激发态的分子通过振动驰豫—内转移— 振动驰豫到达第一单线激发态的最低振动能级时，第 一单线激发态最低振动能级的电子可通过发射辐射 （光子）跃回到基态的不同振动能级，此过程称 为 “荧光发射”。如果荧光几率较高，则发射过程较
快，需10-9 ～10-7秒。（它代表荧光的寿命）
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• 用绿色荧光蛋白标记的细胞
• 用这种能自己发光的荧光分子来作为生 物体(细胞、细胞器)的标记。
• 将这种荧光分子通过化学方法挂在其他 不可见的分子上，原来不可见的部分就 变得可见了。
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荧光染料
• 能发出荧光的染料。在吸收可见光和紫 外光后，能把紫外光转变为波长较长的 可见光波而反射出来，呈闪亮的鲜艳色 彩。
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6.2 方法原理
6.2.1荧光（磷光）产生机理
6.2.2.1 分子能级与跃迁
分子能级比原子能级复杂； 在每个电子能级上，都存在振动、转动能级；
基态(S0)→激发态(S1、S2、激发态振动能级)：吸收特定频
率的辐射； 激发态→基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快、激
发态寿命最短的途径占优势；
第一、第二、…电子激发单重态 S1 、S2… ； 第一、第二、…电子激发三重态 T1 、 T2 … 。
M 能 量 M M + 热 量 M +hv'+热 量
荧光F 寿命10-7-10-9 S
磷光P 寿命10-4-10S
6.2.2.2 电子激发态的多重态
单重态 • 所有电子自旋都配对的分子的电子状态。 • 大多数有机物分子的基态是单重态。 • 当基态一对电子中的一个被激发到较高能级，其自