实验六 定磷法测核酸浓度
核酸成分实验报告
一、实验目的1. 学习核酸的提取方法。
2. 鉴定核酸的组成成分，包括戊糖、磷酸和碱基。
3. 掌握比色法测定核酸含量的原理和方法。
二、实验原理核酸是生物体内的重要生物大分子，包括核糖核酸（RNA）和脱氧核糖核酸（DNA）。
核酸的组成成分主要包括戊糖、磷酸和碱基。
本实验通过提取动物组织中的核酸，鉴定其组成成分，并测定核酸含量。
1. 核酸提取：利用组织匀浆和酚-氯仿法提取动物组织中的核酸。
2. 组成成分鉴定：通过酸水解法使核酸水解，然后利用比色法分别测定戊糖、磷酸和碱基的含量。
3. 核酸含量测定：利用定磷法测定核酸中的磷含量，进而推算出核酸含量。
三、实验器材与试剂1. 实验器材：组织匀浆器、离心机、分光光度计、电炉、水浴锅、试管、吸管、刻度管、容量瓶等。
2. 实验试剂：动物组织匀浆剂、酚、氯仿、异丙醇、NaCl、NaOH、HCl、磷酸二氢钾、钼酸铵、硫酸等。
四、实验步骤1. 核酸提取：（1）取动物组织匀浆剂，加入动物组织匀浆，匀浆后加入酚-氯仿混合液（1:1），充分振荡，静置分层。
（2）将上层含核酸的酚相转移至新试管中，加入等体积的氯仿，充分振荡，静置分层。
（3）将上层含核酸的氯仿相转移至新试管中，加入等体积的异丙醇，充分振荡，静置沉淀。
（4）弃去上清液，将沉淀用少量70%乙醇洗涤，弃去洗涤液，真空干燥，得到核酸粗制品。
2. 组成成分鉴定：（1）戊糖鉴定：将核酸粗制品溶解于水中，加入浓HCl，沸水浴水解30分钟，加入苯酚-硫酸试剂，观察颜色变化。
（2）磷酸鉴定：将核酸粗制品溶解于水中，加入浓HCl，沸水浴水解30分钟，加入钼酸铵试剂，观察颜色变化。
（3）碱基鉴定：将核酸粗制品溶解于水中，加入浓HCl，沸水浴水解30分钟，加入硝酸钠试剂，观察颜色变化。
3. 核酸含量测定：（1）标准曲线绘制：配制一系列不同浓度的标准磷溶液，测定其在特定波长下的吸光度，绘制标准曲线。
（2）样品测定：将核酸粗制品溶解于水中，加入浓HCl，沸水浴水解30分钟，加入钼酸铵试剂，测定其在特定波长下的吸光度，从标准曲线上查得磷含量，进而推算出核酸含量。
核酸定量测定实验报告
一、实验目的1. 掌握核酸定量测定的原理和方法。
2. 熟悉紫外分光光度法和定磷法在核酸定量中的应用。
3. 提高实验操作技能，培养科学思维和实验数据分析能力。
二、实验原理核酸（DNA和RNA）是生物体内重要的生物大分子，其含量与生物体的生命活动密切相关。
核酸定量测定是生物学、医学和分子生物学等领域的重要研究手段。
1. 紫外分光光度法：核酸、核苷酸及其衍生物具有共轭双键系统，能吸收紫外光。
DNA和RNA在260 nm波长处的紫外吸收峰较强，可用于定量测定核酸含量。
2. 定磷法：核酸分子中含有一定比例的磷，DNA和RNA的含磷量分别为9.2%和9.0%。
通过测定核酸中磷的含量，可间接计算出核酸的量。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：粗核酸、DNA标准品、RNA标准品、样品待测液、蒸馏水等。
2. 仪器：紫外分光光度计、电子天平、恒温水浴锅、移液器、试管、吸管等。
四、实验步骤1. 紫外分光光度法测定核酸含量（1）配制核酸标准溶液：准确称取一定量的DNA和RNA标准品，用蒸馏水配制成一定浓度的标准溶液。
（2）测定样品核酸含量：将样品待测液稀释至一定浓度，取适量样品溶液，在260 nm波长处测定其吸光度。
（3）绘制标准曲线：以DNA或RNA标准溶液的浓度为横坐标，对应的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
（4）计算样品核酸含量：根据样品溶液的吸光度，从标准曲线上查得相应的核酸浓度，计算样品中核酸的量。
2. 定磷法测定核酸含量（1）配制标准磷溶液：准确称取一定量的磷酸二氢钾，用蒸馏水配制成一定浓度的标准磷溶液。
（2）测定样品核酸中磷含量：将样品待测液加入强酸，使核酸分子中的有机磷转化为无机磷，与钼酸铵反应生成磷钼酸铵。
在还原剂存在下，磷钼酸铵被还原生成钼蓝，用分光光度法测定其在660 nm处的吸光度。
（3）绘制标准曲线：以标准磷溶液的浓度为横坐标，对应的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
（4）计算样品核酸含量：根据样品溶液的吸光度，从标准曲线上查得相应的磷浓度，乘以核酸的含磷量，计算样品中核酸的量。
生化大实验
目录
实验一 蛋白质含量的测定 实验二 离子交换法血清纯化IgG 实验三 离子交换层析法分离血清白蛋白 实验四 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量 实验五 等电聚焦法测定样品的等电点 实验六 质粒的分离与纯化 实验七 PCR扩增目的基因片段 实验八 酶联免疫吸附实验
实验一 蛋白质含量的测定
（一）考马斯亮蓝法
表1-2 紫外分光光度法测定蛋白质浓度---标准曲线的绘制
项目 标准蛋白液/ml
蒸馏水/ml 蛋白质浓度/ml
A280
1 2 3 4 5 6 78 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 4.0 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0 0 0.125 0.25 0.375 0.50 0.625 0.75 1.0
《生化大实验》
实验课程简介
生化大实验是一门综合性的实验课程， 教学的目的在于通过对生命物质的分离制 备，纯化，分析等综合性实验，在已掌握 的基础生物化学理论知识和生化实验常用 方法的基本原理、基本操作技术（如滴定、 比色、层析、电泳等）的基础上，训练学 生的综合实践动手能力，掌握蛋白质、酶、 核酸等重要物质的分离、纯化等的测定技 术。
【试 剂 和 器 材】 1. 2.0mg/mL牛血清白蛋白溶液 2. 容量瓶10ml（×6） 3. 试管1.5cm×15cm（×8） 4. 双缩脲试剂：溶解0.175g硫酸铜（CuSO4
5H2O）溶于15ml水中，在100ml容量瓶中加入30ml 浓氨水、30ml冷蒸馏水和20ml饱和氢氧化钠，摇匀， 室温1-2h定容100ml，摇匀备用。在搅拌下加入 300ml 10%氢氧化钠溶液，用水稀释到1000ml， 贮存在内壁涂以石腊的瓶中。此试剂可长期保存。若 贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。
核酸浓度检测实验报告
一、实验目的本实验旨在掌握核酸浓度检测的原理和方法，通过学习并操作核酸浓度检测实验，了解核酸浓度的定量测定，以及相关仪器的使用方法。
二、实验原理核酸浓度检测是通过测定溶液中核酸的量来反映样品中核酸的含量。
本实验采用比色法进行核酸浓度检测，其原理如下：1. 核酸分子中含有一定比例的磷，因此通过测定核酸中磷的含量，可以推算出核酸的浓度。
2. 将核酸溶液中的磷元素转化为无机磷，使其与钼酸铵反应生成磷钼酸铵。
3. 在还原剂的作用下，磷钼酸铵中的钼元素被还原成钼蓝，其颜色深浅与磷含量成正比。
4. 通过比色法测定钼蓝的吸光度，从而计算出核酸的浓度。
三、实验器材与试剂1. 实验器材：核酸样品、克氏烧瓶、容量瓶、吸管、试管、722型分光光度计、电炉、水浴锅。
2. 实验试剂：标准磷溶液、定磷试剂（17%硫酸、钼酸铵）。
四、实验步骤1. 准备工作：将核酸样品用蒸馏水稀释至一定浓度，取适量溶液于克氏烧瓶中。
2. 消化：向克氏烧瓶中加入适量的17%硫酸和钼酸铵，混合均匀，置于电炉上加热至沸腾，保持沸腾状态约5分钟。
3. 冷却：将消化后的溶液冷却至室温。
4. 定容：将消化后的溶液转移至容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。
5. 比色：用722型分光光度计测定定容后的溶液在660nm处的吸光度。
6. 计算结果：根据标准曲线计算核酸浓度。
五、实验结果与分析1. 标准曲线绘制：将已知浓度的标准磷溶液进行比色，绘制标准曲线。
2. 样品浓度计算：根据样品溶液的吸光度，从标准曲线中查找对应的核酸浓度。
3. 结果分析：比较实验结果与理论值，分析误差产生的原因。
六、实验结论通过本实验，掌握了核酸浓度检测的原理和方法，成功进行了核酸浓度测定。
实验结果表明，本实验方法准确可靠，可用于实际样品的核酸浓度检测。
七、注意事项1. 实验过程中，注意操作规范，防止污染。
2. 样品处理过程中，避免强酸、强碱等对核酸的破坏。
3. 消化过程中，注意控制加热温度和时间，避免过度加热。
生物化学实验
Q3：在测酶活力时应注意哪些反应条件？为什么？
A3： （1）保持最适温度。因为随着温度的升高，酶促反应速率 加快；但当温度过高时，又会使酶变性失活，酶促反应速率 反而会下降。只有在最适温度时反应速率最大。 （ 2 ）选择最适 pH 。在此 pH 时酶活性最大，过高或过低， 酶活力会降低。 （3）底物浓度应足够大，保证酶可以完全被底物饱和结合。 （4）酶量应小于底物浓度，否则反应体系底物不足，发生 有的酶分子尚不能发挥作用，酶浓度与酶促反应速率不成正 比。 （5）添加激活剂。有些酶需要激活剂，有激活剂条件下酶 才体现有活力。 （6）去除抑制剂。抑制剂会抑制酶活性，使酶活力偏低。
Q5：举例说明为什么一般不用质量单位表示酶量？ A5：催化活性是酶的一个独特属性，酶蛋白质再多，纯度 再高，如果没有活性，则是毫无意义的。因此在表示酶量 时，一般不用质量单位，而是用活力单位表示。如有一种 酶制剂，在最适条件下，每分钟能催化1微摩尔底物转化为 产物所需要的酶量是 0.5 微克那么 5 微克酶制剂含有 10U ， 用“10U/5微克酶”比用5微克酶更能反映酶量。
实验六 酵母RNA的提取及组份鉴定
2.5g鉬酸铵溶于100mL水中；
10％抗坏血酸溶液：10g抗坏血酸溶于100mL水，棕色并保存溶液；
临用时将三种溶液和水按下列比例混合：
17％硫酸：
2.5％鉬酸铵：10％抗坏血酸：
水＝1：1：1：2（V/V）。
二、材料
干酵母粉。
三、器材
移液管
2.0mL（×1）,1mL（×4）；移液枪；量筒10mL（×1）,50mL（×1）；滴管；水浴锅；低速离心机；研钵；天平。操作方法
二、RNA组份鉴定
将所提取的核酸转移到试管中，加入
1.5M硫酸5mL,沸水浴加热10分钟制成水解液，然后进行组份鉴定。
1．嘌呤碱：
取水解液1mL加入过量浓氨水。然后加入1mL
0.1M硝酸银溶液，观察有无嘌呤碱银化合物沉淀。
2．核糖：
取水解液1mL，三氯化铁浓盐酸溶液2mL和苔黑酚乙醇溶液
0.2mL。放沸水浴中10min。注意观察核糖是否变成绿色。
一、酵母RNA提取
称5g干酵母粉悬浮于30mL
0.04M NaOH溶液中并在研钵中研磨均匀。悬浮液转入大试管，沸水浴加热30min，冷却，转入离心管。3000r/min，离心10分钟后，将上清慢慢倾入10mL酸性乙醇，边加边搅动。加毕，静置，待RNA沉淀完全后，3000r/min离心5min。弃去上清液。用95％乙醇洗涤沉淀两次，第一次洗涤后3000r/min离心5min，第二次洗涤后过滤，将沉淀转移到滤纸上，沉淀在空气中干燥。称量所得RNA粗品的重量，计算：
实验六酵母
目的要求
（1）了解并掌握稀碱法提取RNA的原理和方法。
（2）了解核酸的组分并掌握其鉴定方法。
实验原理
由于RNA的来源和种类很多，因而提取制备方法也很各异。一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。其中苯酚法又是实验是最常用的。组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在酚层中。向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出，此法能较好的除去DNA和蛋白质。上述方法提取的RNA具有生物活性。工业上常用稀碱法和浓盐法提取RNA，用这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备核苷酸的原料，其工艺比较简单。浓盐法使用10%左右氯化钠溶液，90℃提取3-4h，迅速冷却，提取液经离心后,上清液用乙醇沉淀RNA。稀碱法使用稀碱使酵母细胞裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA或调pH
《生物化学实验》教学大纲
《生物化学实验》教学大纲一．实验目的二．实验内容三．实验学时安排四．考试方法五．参考教材一．实验目的生物化学是一门实验性学科，其所有知识均来自于实验。
本课程着眼于学生学习和掌握生物化学课程的基本理论、基本知识以及实验技能，培养学生具有初步分析问题和解决问题的能力。
生物化学实验课通过学习滴定、比色、纸层析、电泳、生化制备等基本实验技术，分析研究糖、脂、蛋白质、核酸、酶、维生素等生化物质及某些代谢过程，培养学生具有初步的科学实验能力及严格的科学作风，同时验证生物化学的某些基本理论知识，加深感性认识，并锻炼初步的综合实验能力。
返回顶部二．实验内容•实验一糖的呈色反应及还原糖的检验一．实验目的学习鉴定糖类及区分酮糖和醛糖的方法；了解鉴定还原糖的方法及其原理。
二．实验内容Molish反应、蒽酮反应、Seliwanoff反应、Bial反应、Fehling 反应。
三.实验过程1.呈色反应（1） Molish 反应（2）蒽酮反应（3） Seliwanoff反应（4） Bial反应2.还原糖的检验（1） Fehling反应（2） Benedict反应（3） Barfoed反应四.作业与思考1.列表总结和比较本实验7种颜色反应的原理及其应用.2.应用Molish反应和Seliwanoff反应分析未知样品时，应注意些什么问题？3.举例说明那些糖属于还原糖.•实验二脂类组成对脂类单分子层通透性的影响一、实验目的学习制作脂类单分子层和鉴定它的原理及方法，比较不同脂类所形成的脂类单分子层通透性的差异。
二、实验内容以脂类单分子层作为模式膜，用甲烯蓝为指示剂，观察不同脂类单分子层通透性的影响。
三.实验过程1.溶液准备2.分光光度计测样四.作业与思考1.试述生物膜的基本结构与功能2.解释下列名词：双亲媒性分子、脂类单分子层、磷脂双分子层、膜的内在蛋白质和外在蛋白质.•实验三蛋白质浓度的测定（1）——Folin-酚法一、实验目的学习Folin-酚法的原理及方法，制备标准曲线，测定未知样品中蛋白质含量。
《生物化学实验》课程的教学改革与实践
式１３ ２１ ，。本文授课小 组获福州大学 《 生物化 学实
验 》精 品课程建 设的资助 ，在近３ 的时间里 ， 年
５ 项基础实验强调对最基本的四类有机物质 ： 糖 、脂肪 、蛋 白质和核酸 的认识 。糖 、脂肪 、蛋
对生物化学实验课 从教学体系 、教学方式 、考核
不是单纯 的验证实验 。学生通过实验不仅掌握了
综合实验强化了学生对于原理的理解能力 、 仪器设备安装使用的操作能力 、数据处理和分析 能力 。在综合实验结束后’ ，学生对于综合实验普 遍 反映 “ 虽然工作量大 、内容多 ，ｆ 艮 昏 充实 ，过
程充满乐趣和期待” 。
实验原理和操作技能 ，实验结果也有助于学生对
酶” 、 “ 淀粉酶活力测定 ” “ 淀粉酶 蛋白质含量
实验课程分为两部分 ，首先 ，在 同学们进行 预 习的基础上 ，指导教师进行实验理论和实验操 作指导 ；接着 ，学生进入实验室分组进行实验 。 在学生预 习和教师指导 的环节 ，有效 的多媒体运
用 ，极大提 高了教学 的效率和实验效果 。
选一种感兴趣的食品完成 “ 白质含量测定” 、 蛋
验的严谨态度 ，有利提高学生的实验能力、分析
问题 和解 决 问题 的能 力 ，且不容 易导 致思 维定
势 、机械操作 。
“ 脂肪含量测定 ”和 “ 总糖 含量测定 ”等３ 项基 础性实验 。这种实验课教学的特点 ，一是将 分散 的小实验变为一个小型综合实验 ，有助于学生对 理论 知识 的系统理解 和 尝试对 数据 进行 系统 分 析 ；二是选材来源于生活 ，数据不再一成不变 ，
２２加 强 多媒 体 教 学 ．
理 论和实践 教学 的比例 达到 １１ ：，即各具有 ５ 学 ４
核酸浓度测定
核酸的定量与纯度的测定在分子生物学实验中，核酸提取需要进行其纯度和浓度的测定。
目前实验室常用的测定方法主要有分光光度法、荧光染料法、PCR法和杂交定量法等。
分光光度法分光光度法主要包括紫外分光光度法、定糖定磷法及基于酶催化的核酸定量方法等。
（1）紫外分光光度法紫外分光光度法基于DNA链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强吸收，DNA/RNA在260nm处有最大的吸收峰，蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm 处。
因此，可以用260nm波长进行分光测定核酸浓度，OD值为1相当于大约50μg/ml双链DNA，单链DNA浓度约为33µg / ml，RNA约为40μg/ml，寡核苷酸约为35μg/ml。
如用1cm 光径，用H2O稀释DNA/RNA样品n倍并以H2O为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度：DNA（mg/ml）=50×OD260读数×稀释倍数/1000RNA（mg/ml）=40×OD260读数×稀释倍数/1000。
A280nm是蛋白和酚类物质最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估：纯DNA的A260/A280比值为1.8，纯RNA为2.0。
假如比值低，表示受到蛋白（芳香族）或分类物质的污染，需要纯化样品。
比值=1.5相当于50%蛋白质/DNA溶液。
A230nm是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估：纯DNA 和RNA的A260/A230比值为2.5。
若比值小于2.0标明样品被碳水化合物（糖类）、盐类或有机溶剂污染，需要纯化样品。
A320nm或A340nm为检测溶液样品的浊度，该值应该接近0.0。
假如不足，标明溶液中有悬浮物，需要纯化样品。
实验步骤1、将制备的DNA悬浮溶解于TE缓冲液中pH8.0，10mmo1/L的Tris缓冲液，内含(1mmol/L EDTA)或悬浮溶解在灭菌水中(依据DNA含量加水)。
实验四 植物DNA的提取
实验四植物DNA的提取一、实验目的掌握CTAB法从植物叶片提取DNA的原理和方法。
采用CTAB法从植物叶片中提取基因组DNA，并进行纯度分析。
二、实验原理1、核酸提取的基本原理核酸是生物有机体中的重要成分，在生物体中核酸常与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在。
核酸分为脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)两大类，在真核细胞中，前者主要存在于细胞核中，后者主要存在于细胞质及核仁里。
在制备核酸时，通过研磨破坏细胞壁和细胞膜，使核蛋白被释放出来。
在浓氯化钠溶液(1～2 mol／L)中，DNA核蛋白的溶解度很大，RNA核蛋白的溶解度很小；而在稀氯化钠溶液(0.14 mol／L)中，DNA核蛋白的溶解度很小，RNA核蛋白的溶解度很大。
因此，可利用不同浓度的氯化钠溶液将DNA核蛋白和RNA核蛋白从样品中分别抽提出来。
分离得到核蛋白后，需进一步将蛋白等杂质除去，常采用的去除蛋白的方法有3种：①用含异戊醇的氯仿振荡核蛋白溶液，使其乳化，然后离心除去变性蛋白质，此时蛋白质凝胶停留在水相和氯仿相中间，而DNA溶于上层水相。
用两倍体积的无水乙醇溶液将DNA钠盐沉淀出来。
如果用酸性乙醇或冰乙酸来沉淀，得到的是游离的DNA。
②用十二烷基硫酸钠(SDS)等去污剂使蛋白质变性，与核酸分离，从而从材料中直接提取出DNA。
③用苯酚处理，然后离心分层，DNA溶于上层水相，蛋白变性后则停留在酚层内。
吸出上面水层，加两倍体积的无水乙醇溶液，得到白色纤维状DNA沉淀。
反复使用上述方法多次处理DNA核蛋白溶液，就能将蛋白等杂质较彻底地除去，得到较纯的DNA制品。
为了彻底除去DNA制品中混杂的RNA，可用RNA酶处理。
生物材料中含有的脂肪物质和大部分的多糖，在用盐溶液分离核蛋白和用乙醇或异丙醇分级沉淀时即被除去。
在DNA提取、制备的过程中，核酸极不稳定，许多因素可破坏其完整结构：①化学因素，核酸的结构在pH值4.0～11.0间较稳定，pH值在此范围外就会使核酸变性降解，故制备过程应避免过酸过碱。
核酸分离鉴定_实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 掌握核酸分离与鉴定的原理和方法。
2. 了解核酸的组成和结构。
3. 学会使用实验仪器和试剂，进行核酸的分离与鉴定。
二、实验原理核酸是生物体内重要的生物大分子，包括DNA和RNA。
DNA主要存在于细胞核中，负责遗传信息的存储和传递；RNA主要存在于细胞质中，参与蛋白质的合成和调控。
核酸的分离与鉴定是分子生物学研究的基础。
核酸分离与鉴定主要包括以下步骤：1. 核酸提取：利用细胞破碎技术，将细胞内的核酸释放出来。
2. 核酸纯化：去除杂质，得到纯净的核酸。
3. 核酸鉴定：通过物理、化学或生物学方法，鉴定核酸的种类和结构。
本实验以酵母细胞为实验材料，采用碱法提取RNA，并通过紫外分光光度法、琼脂糖凝胶电泳法进行鉴定。
三、实验材料与试剂1. 实验材料：酵母细胞2. 试剂：0.04mol/L NaOH溶液、酸性乙醇溶液、琼脂糖凝胶、缓冲液、核酸染料、DNA/RNA Marker等四、实验步骤1. 核酸提取（1）称取1g干酵母细胞，加入2ml 0.04mol/L NaOH溶液，研磨至匀浆状。
（2）加入4ml 0.04mol/L NaOH溶液，混匀，转移至离心管中。
（3）沸水浴加热30min，冷却后离心（2000r/min，15min）。
（4）取上清液，加入等体积的酸性乙醇溶液，混匀，静置2h。
（5）离心（2000r/min，15min），弃去上清液。
（6）加入70%乙醇洗涤沉淀，离心（2000r/min，15min），弃去上清液。
2. 核酸鉴定（1）紫外分光光度法：取适量RNA溶液，在260nm和280nm波长下测定吸光度值，计算RNA浓度。
（2）琼脂糖凝胶电泳：将提取的RNA与DNA/RNA Marker混合，加样至琼脂糖凝胶孔中，电泳（100V，30min）。
观察电泳结果，判断RNA的纯度和完整性。
五、实验结果与分析1. 紫外分光光度法测定结果显示，RNA浓度为0.5mg/ml。
2. 琼脂糖凝胶电泳结果显示，RNA条带清晰，无杂质带，表明RNA纯度和完整性良好。
实验五 定磷法测核酸浓度
六、思考题
1. 为什么实验中需要做空白对照，为什么需要考虑消化 的回收率？对我们今后在做实验中有什么启示？
2. 本实验中反应体系中的还原剂是什么？ 3. 定磷试剂中抗坏血酸溶液在保存过程中发生颜色变化
的原因是什么？
1
-
-
-
-
10mol/L H2SO4/mL
4
4
4
4
4
168-200℃消化30min，溶液呈黄褐色，冷却
30％H2O2（滴）
2
2
2
2
2
168-200℃继续消化至溶液透明，冷却
H2O/mL
2
2
2
2
2
沸水浴中加热10min（分解焦磷酸），冷却
用水定容/mL
100
100
100
100
100
显色方法P19
3. 注意事项
3
2）无机磷的测定（另外1组同学做总磷测定和无机磷测定）
试剂
0
1
2
RNA样品/ml
－
3.0
3.0
蒸馏水
3.0
0
0
定磷试剂
3.0
3.0
3.0
A660nm
滤纸过滤
3）反应条件： 45℃，25min
3）总磷样品的准备（八人一组）
管号 步骤
0
1
2
3
4
RNA/mL
-
2
2
-
-
标准磷原液 /mL
-
-
-
2
2
H2O/mL
RNA消化的目的？
为什么将原液消化算回收率？
消化回收率
总磷
测定值
酵母RNA的提取、组分鉴定和含量测定
定磷试剂含有还原剂抗坏血酸，抗坏血 酸很容易被空气中的氧所氧化，使定磷 试剂失效。因此可以改用钼酸铵试剂定 磷。核酸分子中的有机磷经强酸消化后 形成无机磷，在酸性条件下,无机磷与 钼酸铵结合形成黄色磷钼酸铵沉淀。
【思考题】
01 如何得到高产量RNA粗制品？ 02 验证RNA中核糖的办法，可否用以检验脱氧核糖，为什么？ 03 用你所学过的化学知识,分析3种催化剂：
【操作步骤】
RNA的提取：将5g酵母悬浮30mL0.04mol/L氢氧化钠 溶液中，并在乳钵中研磨均匀。将悬浮液转移至100毫 升锥形瓶中。在沸水浴上加热30分钟后，冷却。离心 (3000r/min)15分钟，将上清液缓缓倾入15 mL酸性乙 醇溶液中。注意要一边搅拌一边缓缓倾入。待核糖核酸 沉淀完全后，离心(3000r/min)3分钟。弃去清液。用 95％乙醇洗涤沉淀两次，乙醚洗涤沉淀一次后，再用乙 醚将沉淀转移至布氏漏斗中抽滤。沉淀可在空气中干燥。
标准曲线的制作
按上表编号及加入试剂。加毕，摇匀，置沸 水浴加热25min，取出后冷水冷却，以零号 管作对照,于670nm波长处测定各管光吸收 值。取测定的平均值,以RNA浓度为横坐标, 光吸收为纵坐标作图,绘制标准曲线。
样品的测定
取两支试管,各加入2.0mL样品注液,再加 2.0mL地衣酚-Cu2+试剂，如前述进行 测定.
RNA含量的计算
根据测得的光吸收值,从标准曲线上查出 相当该光吸收的RNA含量，计算出制品 中RNA的百分含量。
第一步
第二步
【注意事项】
01 样 品 中 蛋 白 质 含 量 较 高 时 , 应 先 用 5 % 三 氯 乙 酸 溶 液 沉 淀 蛋白质后再测定。
02 本 法 特 异 性 较 差 , 凡 属 戊 糖 均 有 反 应. 微 量 D NA 无 影 响 , 较 多DNA存在时,亦有干扰作用。如在试剂中加入适量 CuCl2 .2H2O可减少DNA的干扰。此外,利用RNA和 DNA显色复合物的最大光吸收不同,且在不同时间显示 最大色度加以区分。反应2min后,DNA在600nm呈现 最大光吸收,而RNA则在反应15min后,在670nm下呈 现最大光吸收。
动物组织中核酸的提取与鉴定(DNA&RNA)
实验一动物组织和细胞中核酸的提取和测定第一部分动物组织和细胞中DNA和RNA的提取【实验目的】学习从组织和细胞中提取DNA和RNA的方法【实验原理】1.从动物组织和细胞中提取DNADNA存在于细胞核中。
提取DNA的方法首先需要温和裂解细胞及溶解DNA的技术，接着需采用化学和酶学方法，除去杂蛋白、RNA及其他的大分子。
本实验在EDTA（螯合二价阳离子以抑制Dnase）存在的情况下，用蛋白酶K消化真核细胞和组织，用去垢剂（如SDS，十二烷基磺酸钠）溶解细胞膜并使蛋白质变性。
核酸通过有机溶剂抽提得以纯化，污染的RNA通过RNase消化清除。
这个方法可产生十微克至数百微克的DNA，适用于标准琼脂糖凝胶上的Southern分析，可用作PCR 反应的模板，以及用于构建基因组DNA文库。
2.从动物组织和细胞中提取RNARNA存在于细胞质及核中，是一种极易降解的核酸分子。
为了快速从细胞中分离完整的RNA，许多方法都用到了高浓度的强变性剂硫氰酸胍使细胞破裂。
高浓度的硫氰酸胍还使细胞内的各种RNA酶失活，使释放出的RNA不被降解。
细胞裂解后存在于裂解溶液内的有RNA，核DNA，蛋白质和细胞残片，通过酚，氯仿等有机溶剂处理，离心，使RNA最终与其它细胞组分分离开来。
【实验材料】1.实验器材材料：小牛胸腺或动物肝脏；研钵和研棒，匀浆机，橡胶刮棒，低温冷冻离心机，恒温水浴，宽口移液管，锤子，塑料袋，涡旋等。
2.实验试剂(1)裂解缓冲液：10mmol/L Tris-Cl (PH8.0)，0.1mol/L EDTA (PH8.0)，0.5%(m/V) SDS，20µg/mg无Dnase的胰RNase，裂解缓冲液的前三种成分可预先混合并于室温保存。
RNase在用前适量加入。
(2)溶液D(变性液)：4 mol/L 硫氰酸胍，25mmol/L 柠檬酸钠. 2H20，0.5%(m/V)月桂基肌酸钠，0.1mol/L β-巯基乙醇，将250g硫氰酸胍、0.75mol/L(PH7.0)柠檬酸钠17.6ml和26.4ml10%(m/V )月桂基肌酸钠溶于293 ml水中.加入搅拌子于磁力搅拌器上65℃混匀,直至完全溶解。
实验5_苔黑酚法测定酵母中RNA的含量
实验5_苔黑酚法测定酵母中RNA的含量一，实验目的1.掌握稀碱法提取酵母RNA的原理和方法。
2.掌握用苔黑酚法测定RNA含量的原理和方法。
二.实验原理1.RNA的提取核酸(RNA)都是由核苷酸组成的多聚核苷酸化合物，而核苷酸是由糖、碱基和磷酸以等分子比例构成的，故测定组成核苷酸的任意一种组分即可以测定生物体内核酸的含量或者是提取出来的核酸的含量。
提取RNA的方法很多，在工业生产上常用的是稀碱法和浓盐法。
前者是利用碱使细菌细胞壁溶解，是RNA释放出来，后者是在加热的条件下，利用高浓度的盐改变细胞膜的通透性，使RNA释放出来。
使用浓盐法提取RNA的时候应该注意掌握温度，直接至90~100℃浸提，避免在20~70℃的时间过长，因为这是磷酸二酯酶和磷酸单酯酶的作用活跃的温度范围，会使RNA降解而降低提取率。
这两种方法是从废弃的啤酒酵母中提取RNA的一般方法。
但是这两种方法各有利弊，如浓盐法提取的RNA纯度高，而稀碱法提取的时间短，提取率高，更利于工业化生产。
本实验采取浓盐法。
酵母核酸中RNA的含量较多,DNA则少于2%。
RNA可溶于碱性溶液，当碱液被中和后，可加乙醇使其沉淀，由此即可得到粗RNA粗品。
2.RNA的鉴定目前测定核酸含量的方法主要有以下四种:定磷法(RNA/DNA)、戊糖测定法(RNA)、脱氧戊糖测定法(DNA)和紫外吸收法(DNA/RNA)。
定磷比色法是有准确，微量，快速的特点，是测定核酸含量的最好方法，戊糖测定法和脱氧戊糖测定法是通过糖的颜色反应来测定RNA和DNA的，方法简单，快速，但是当样品中含有粘多糖和蛋白质存在的时候对测定会有干扰。
在酸性条件下，RNA分子中的核算基转变为a-呋喃甲醛，后者与苔黑酚(3,5-二羟甲苯)作用生成绿色复合物，可用比色法鉴定。
三.实验器材RNA的提取:RNA的含量测定:1.干酵母粉(市售)。
1.试管1.5cmX1.5cm(X7)。
2.PH试纸。
2.吸管5ml。
实验三酵母核糖核酸的提取及测定（实验报告）
生物化学实验报告实验三酵母核糖核酸的提取及测定一、研究背景及目的RNA（核糖核酸）属酸性高分子化合物，是遗传信息的载体，由数量不等的核糖核苷酸通过磷酸二酯键连接而成。
由于RNA在细胞内能够行使各种各样的生物功能，参与蛋白质生物合成、调控基因表达、作为核酶催化生化反应活性等，对维持生物体的正常发育有着重要作用。
RNA制剂是以RNA及其衍生物为材料，经加工制成的产品，主要包括从富含RNA的生物体中的提取物、自溶物或者降解产物加工制成的各种商品。
核糖核苷酸与其衍生物作为一大类R NA制剂，在生物体内有着诸多的功能，例如：ATP是细胞内的能量通用货币，cAMP作为第二信使传递胞外信号，CoⅠ、CoⅡ、CoA、FAD作为酶的辅因子在催化反应中起重要作用，UDP等作为单糖载体在糖代谢中起着重要作用等。
此外，鸟苷酸（GMP）和肌苷酸（IMP）是强力助鲜剂，胞苷酸（CMP）和尿苷酸（UMP）可作为生产治疗癌症、肝炎及冠心病等药物的原料；在化妆品中加入核酸或其水解物，可促进皮肤蛋白合成，达到养护皮肤的作用；在农业上，RNA降解物具有促进作物生长增产的作用，因此RNA制剂被广泛应用于医药、食品、农业、日化、环境保护等各产业，具有广阔的商业前景，形成了一大新兴产业。
[1]可见，无论是科研工作还是商业产品的生产过程，都需要大量的纯品RNA作为原料。
但是RNA的活化能较高，不易直接合成，而天然材料中的RNA往往与细胞内的其他化合物混在一起，故采用廉价、合适的手段分离纯化得到R NA就显得至关重要。
目前，人们已经摸索出来了多种多样的方法，这些方法各有特点，但其基本的思路和程序大致相似，基本战略也是有规律可循的。
本实验中，我们需要了解R NA制剂开发应用的前景和基本思路，掌握RNA分离纯化的设计思想及主要的操作细节，并以酵母为材料学习RN A提取和测定的基本操作方法。
定磷法的实验报告
一、实验目的1. 掌握定磷法测定核酸含量的原理与方法。
2. 熟悉实验器材和试剂的使用。
3. 培养实验操作技能，提高实验数据处理和分析能力。
二、实验原理核酸分子中含有一定比例的磷，RNA中含磷量为5%，DNA中含磷量为5.6%。
通过测定核酸中磷的含量，可以计算出核酸的量。
实验中，利用强酸使核酸分子中的有机磷消化成为无机磷，无机磷与钼酸铵结合成磷钼酸铵。
在还原剂的作用下，磷钼酸铵被还原成钼蓝，通过比色法测定蓝色的深浅，即可计算出磷的含量，从而推算出核酸的量。
三、实验器材与试剂1. 实验器材：- 粗核酸- 克氏烧瓶（50ml）- 小漏斗（4cm）- 容量瓶（100ml、50ml）- 吸管- 试管（18cm）- 722型或XX型分光光度计- 电炉- 水浴锅2. 实验试剂：- 标准磷溶液：将磷酸二氢钾于100℃烘至恒重，准确称取溶于少量蒸馏水中，转移至500ml容量瓶中，加入5ml 5mol/L硫酸溶液及氯仿数滴，用蒸馏水稀释至刻度，此溶液每毫升含磷400g。
临用时准确稀释20倍。
- 定磷试剂：17%硫酸、钼酸铵四、实验步骤1. 准备标准磷溶液：将磷酸二氢钾烘至恒重，准确称取溶于少量蒸馏水中，转移至500ml容量瓶中，加入5ml 5mol/L硫酸溶液及氯仿数滴，用蒸馏水稀释至刻度。
临用时准确稀释20倍。
2. 准备定磷试剂：将17%硫酸和钼酸铵按照比例混合。
3. 样品处理：取一定量的粗核酸，加入适量蒸馏水，充分溶解。
用滤纸过滤，取滤液备用。
4. 测定无机磷含量：取适量样品滤液，加入硫酸和钼酸铵，按照定磷试剂的比例混合。
在分光光度计上，以蒸馏水为空白，测定其在660nm处的吸光度值。
5. 测定总磷含量：取适量样品滤液，加入硫酸和钼酸铵，按照定磷试剂的比例混合。
在分光光度计上，以蒸馏水为空白，测定其在660nm处的吸光度值。
6. 计算磷含量：根据标准磷溶液的浓度和吸光度值，计算出样品中磷的含量。
7. 计算核酸含量：根据核酸与磷的换算关系，计算出样品中核酸的含量。
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四、操作步骤
1）标准曲线样品的准备（4组同学，测三条标准曲线）
管号 步骤 标准磷溶液 /mL H2O/mL 定磷试剂/mL 1 0 3 3 2 0.4 2.6 3 3 0.8 2.2 3 4 1.0 2.0 3 5 1.2 1.8 3 6 1.4 1.6 3 7 1.6 1.4 3 8 2.0 1.0 3
A660nm
磷含量（g）
RNA消化的目的？ RNA消化的目的？ 为什么将原液消化算回收率？
消化回收率 总磷 测定值 根据标准磷 原液计算回 收率
无机磷
RNA磷 核酸
DNA磷 由总磷量和无机磷量计算可得
直接用钼蓝法进行测定
三、试剂和器材
试剂与器材 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 钼蓝显色剂 标准磷试剂、标准磷原液 分光光度计 烧杯、搅拌棒、滴管、容量瓶 凯氏烧瓶 试管 水浴锅 * 本实验配置试剂所用的水指的是蒸馏水
管号 步骤 标准磷溶液 /mL H2O/mL 定磷试剂/mL 定磷试剂/mL 1 0 3 3 2 0.4 2.6 3 3 0.8 2.2 3 4 1.0 2.0 3 5 1.2 1.8 3 6 1.4 1.6 3 7 1.6 1.4 3 8 2.0 1.0 3
反应条件： 45℃，25min 660nm测定吸收值 反应条件： ℃ 测定吸收值
五、结果及数据处理
1） 标准曲线 ） 2） 总磷量计算 ） 回收率的计算 样品总磷浓度（ ug/ml）计算：P真实＝P测定/回收率 3） 有机磷 ） 有机磷＝总磷－无机磷 4） 核酸含量计算 ）
计算得知有机磷的浓度（ug/mL），由于配制时取0.210g定 容至100mL，便可求得该RNA样品中磷的含量（ug），因核酸中 含磷酸量为9％左右，1ug磷相当于11ug核酸，进一步计算出样品 中RNA的含量（％）。
168-200℃消化30min，溶液呈黄褐色，冷却 2 1 100 2 1 100 2 1 100 2 1 100 2 1 100 168-200℃继续消化至溶液透明，冷却 沸水浴中加热10min（分解焦磷酸），冷却
显色方法P19 显色方法
3. 注意事项
1）清洗实验用容器不要用含磷清洗剂
2）消化过程注意防止爆沸和溅出内容物
实验六 定磷法测定核酸浓度
1.学习掌握钼蓝法测定磷含量的原理 1.学习掌握钼蓝法测定磷含量的原理 和方法。 和方法。 2.学习掌握核酸中有机磷的消化和测 2.学习掌握核酸中有机磷的消化和测 并由此计算核酸的量。 定，并由此计算核酸的量。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
实验原理
钼蓝法比色定磷的原理
1）钼蓝显色剂+ 无机磷 钼蓝复合物
六、思考题
1. 为什么实验中需要做空白对照，为什么需要考虑消化 的回收率？对我们今后在做实验中有什么启示？ 2. 本实验中反应体系中的还原剂是什么？ 3. 定磷试剂中抗坏血酸溶液在保存过程中发生颜色变化 的原因是什么？
2）在一定范围内，蓝色的深浅和磷的量成正比,可用 比色法测定
实验内容
标准磷溶液定磷曲线的制作； RNA消化； RNA消化； 测定RNA消化液总磷含量； 测定RNA消化液总磷含量； 计算RNA溶液中RNA的浓度。 计算RNA溶液中RNA的浓度。
1、标准曲线（定磷曲线）的用途 、标准曲线（定磷曲线）
2）无机磷的测定（另外一组同学做总磷测定和无机磷测定）
试剂 RNA样品/ml RNA样品/ml 蒸馏水 定磷试剂 A660nm 0 － 3.0 3.0 1 3.0 0 3.0 2 3.0 0 3.0
滤纸过滤
3）反应条件： 45℃，25min
3）总磷样品的准备（八人一组） （八人一组）
管号 步骤 RNA/mL 标准磷原液 /mL H2O/mL 10mol/L H2SO4/mL 30％H2O2（滴） H2O/mL 用水定容/mL 0 1 4 1 2 4 2 2 4 3 2 4 4 2 4