布鲁氏菌病实验室诊断技术及其适用性评析

布鲁氏菌病实验室诊断技术及其适用性评析高明春1,2，王君伟 1,2（1.东北农业大学动物医学学院微生物与免疫学教研室，哈尔滨 150030；2.国家奶牛产业技术体系疾病控制功能室，北京 100193）摘 要：布鲁氏菌病严重阻碍我国养牛业的健康发展，控制乃至根除布病是世界范围内各布病负担国的共识。

本文就各种布鲁氏菌病实验室诊断技术及其在布病净化程序中的适用性加以客观评述，谨供布病防控工作者参考。

关键词：布鲁氏菌病；实验室诊断技术；奶牛；肉牛布鲁氏菌病（布病）是一种公认的人畜共患传染病，人、畜布病均归因于6个陆生动物布鲁氏菌经典种中的5个种所致的感染，即人间布病全部源于动物布病，并且各国的研究表明消灭动物布病能够有效地从根本上减少人间布病。

近年，我国家畜布鲁氏菌病（布病）与人间布病暴发频繁，给畜牧业与人民健康带来了巨大损失，而控制及消除布病影响的一个前提是能够对布病动物进行有效的诊断。

国内外对布病系统性的研究有近150年的历史，期间开发了许多布病体外和体内诊断方法，这些诊断方法服务于不同的应用目的，例如：证实疫情发生、全国性普查、确诊、国际贸易检测以及“无布病”地区的布病监测等等，如何选择诊断策略取决于布病的流行状况及检测的目的[1～5]。

本文对新近探讨各种布病诊断方法的文献进行回顾，并评价其在净化程序中的适用性。

1 布鲁氏菌病概述布鲁氏菌病主要通过消化道、呼吸道、生殖道传播，也可通过损伤的皮肤、黏膜等感染，造成以生殖系统为主的多器官损伤。

牛群中暴发布病会导致大量怀孕母牛流产和奶产量降低，如发生流行，则会严重影响整个产业链。

布病还是公认危害最为严重的人畜共患病之一，人感染后反复发作，难以根治。

因此，世界上绝大多数“布病国家”积极开展了本国的布病根除计划，并且北美、中欧的几个国家及加拿大、日本、澳大利亚和新西兰等已确认根除了布病，取得“无布病国家”称号[6-8]。

布病最重要的临床表现是患畜在第一次怀孕期间流产，虽然通常怀孕母畜只流产一次，但在这些动物的生命周期中依然会保持感染状态。

仅根据临床流产症状无法确诊动物是否感染布病，因为许多致病菌都能引起流产，因而实验室检测手段是不可缺少的。

2 布鲁氏菌病实验室诊断方法布鲁氏菌实验室诊断方法分为直接检测法（检测病原）与推断性检测法（通过抗体检测或变态反应来推测感染）。

直接法有微生物学分析和利用聚合酶链式反应（PCR）进行DNA检测；推断法又分为应用于体外（主要包括奶和血液中的抗体）和应用于体内（变态反应测试）的检测方法。

…2.1 直接诊断法只有通过分离到布鲁氏菌或通过PCR检测布鲁氏菌DNA才能确定布鲁氏菌感染，指纹分析方法则能够提供更多的分子流行病学信息。

2.1.1…病料染色…布鲁氏菌是一种革兰氏阴性细菌，可以抵抗弱酸性处理，并在复染之后显示为红色。

但由于其他致流产性病原，例如流产衣原体以及贝氏立克次氏体也能够被染成红色，因而此法缺乏特异性。

但由于收稿日期：2011-08-12基金项目：本文由现代农业产业技术体系专项资金资助（CARS-37）。

作者简介：高明春（1977-），男，主要从事奶牛传染病防控与免疫机理研究。

通讯作者：王君伟，教授。

中图分类号：S858.23 文献标识码：A 文章编号： 1004-4264（2012）04-0035-03DAIRY HEALTH该方法可以在第一时间分析流产材料，因此在生产实践中依然经常使用。

2.1.2…分离培养鉴定细菌分离是布鲁氏菌检测的金标准，通常是生物型鉴定所必需的，但其敏感性很低。

分离培养样品的选择取决于所观察到的临床现象，有效样品包括流产胎儿（胃、脾、肺）、胎衣、阴道分泌物、初乳、奶、精子以及从关节炎及肿瘤中收集到的液体。

在屠宰厂，为证实布鲁氏菌疑似病例，可采集生殖道与咽喉淋巴结、脾、乳腺及其相关淋巴结进行检测。

鉴定布鲁氏菌可结合以下测试：革兰氏染色、菌落形态、生长特性、尿酶活性、氧化酶活性以及抗布鲁氏菌光滑型或粗糙型因子血清的凝集测试等等。

除以上指标外，其他分型依据还有噬菌体裂解试验、初代生长时是否需要CO2、H2S试验、在含有复红、硫堇染料的培养基的生长表现以及吖啶黄测试等等，PCR方法也可用于鉴定与分型。

2.1.3…核酸检测方法已有多种基于PCR的检测方法，其中最有效的方法是通过检测布鲁氏菌属的特异性序列，例如16S-23S…基因、IS711…插入序列或bcsp31基因等序列基础上开展的，这些技术最初发明时需要进行细菌分离，现已可用于直接检测临床样品。

一般来说，临床样品PCR检测的敏感性低于培养法，但特异性高达100%，因此有学者研究出了一种将细菌培养与PCR相结合的快速检测技术，可有效检测临床样品。

多种多重P CR法可用于布鲁氏菌检测与分型，A M O S…P C R(因其经常检测的4个种的布鲁氏菌…Abortus、…Melitensis、Ovis、Suis而得名)可以将布鲁氏菌种、疫苗株及野生型菌株加以区分，但不能分辨到生物型。

而“Bruce…ladder”多重PCR法是第一个能够在一次测试中就鉴定和区分所有已知布鲁氏菌种和疫苗株的方法。

近年发展起来的几种新颖而实用的指纹分析方法具有区分给定布鲁氏菌种中的各生物型以及同一生物型的不同分离株能力，这些方法都是基于对可变数目串联重复序列（VNTR）的分析[9-12]。

2.2 推断性诊断法实用性的推断性诊断方法很多，分血清学、奶样检测、体内检测等多种方法。

血清学检测包括试管凝集反应（SAT）、补体结合反应（CFT）、平板凝集反应（BAT）、间接ELISA（iELISA）、竞争ELISA （cELISA）、荧光偏振检测（FPA）等；奶液检测方法包括全乳环状测试（MRT）、FPA、奶液间接ELISA （iELISA）等；体内检测包括皮肤变态反应测试等。

这些方法的建立大多来自对牛布病诊断的研究，但经过验证，除全乳环状检测以外，其他方法均只适用于对绵羊和山羊的检测，因为其应用于牛会产生大量假阳性结果。

这些方法的特异性、敏感性各不相同。

已发表文献中各种牛布鲁氏菌病推断性诊断方法的敏感性、特异性数据如表1所示。

2.2.1…血清学检测方法B.…ovis和B.…canis种的抗体检测需要使用粗糙型布鲁氏菌制备的抗原，对其他种检测均使用光滑型布鲁氏菌制备的抗原。

2.2.1.1…试管凝集试验（慢凝集试验）SAT可检测的布鲁氏菌特异性抗体主要为IgM类，当检测阳性样品时，检测抗原与被检抗体形成肉眼可见的凝集片（抗原抗体复合物）附着在试管的底部，同时上部液体变得清亮。

相对于快速凝集反应，SAT需要22～24h才能完成，因而称为慢凝集试验。

SAT也可在微量板中以100μL体系进行反应，这时可以加入染料从而使反应的判定更为简便。

敏感性与特异性均不高是SAT的主要缺陷，但它是一种标准化方法，在几个已宣称为“无布病”国家的布病根除运动中都得到了良好的应用。

虽然SAT不再是OIE检测牛布病的推荐方法，但SAT依然广泛应用于人类布病感染检测[13-16]。

2.2.1.2…平板凝集试验这类方法包括众所周知的虎红平板凝集试验（RB）和缓冲平板凝集试验（BA），RB与BA是快速凝集反应，可在pH值为3.65…±…0.05的环境内4min内完成反应。

由于其操作非常简单以及考虑到相对于SAT具有更高的敏感性，RB与BA已被多个国家引进作为标准筛选方法。

OIE规定其为“贸易适用”方法。

2.2.1.3…补体结合试验CFT检测的是能够激活补体反应的免疫球蛋白，对牛来说为IgM、IgG。

据文献描述该方法敏感性不高但特异性很高。

虽然CFT也是OIE规定的“贸易适用”方法，但由于该方法难于标准化，正逐渐被ELISA所取代。

2.2.1.4…ELISAELISA分为两大类，即间接ELISA（iELISA）和竞争ELISA（cELISA）。

大部分iELISA使用纯化的光滑型LPS作为诊断抗原，但iELISA中抗牛免疫球蛋白结合物的使用却多种多样。

大多数iELISA检测的是IgG类免疫球蛋白，iELISA敏感性极高，但同时非特异性反应（假阳性）也较多，这些假阳性结果大多是由小肠结肠耶尔森O9(YO9)的类属抗原成分所致，iELISA可能引入的假阳性可由cELISA所排除。

光滑型布鲁氏菌LPS与YO9…LPS在O多糖侧链上存在不同的抗原表位，因而有可能开发出更加特异的cELISA。

OIE认定上述ELISA为“贸易适用”方法。

2.2.1.5…荧光偏振测试荧光偏振分析（FPA）是一种利用物质分子在溶液中旋转速度与分子量大小呈反比的特点，定量检测抗原或抗体的一种分析方法。

FPA非常易于自动化，可以快速准确地对布鲁氏菌病进行诊断，虽然敏感性稍低于iELISA、特异性稍低于cELISA，但具有方便、成本低且检测速度快的优点，可大量节省检测时间，减少设备、材料和试剂的消耗，是具有发展前景的牛种布鲁氏菌检测方法之一。

FPA已用于北美和欧洲的布病根除运动，其是OIE规定的“贸易适用”方法。

2.2.2…奶液检测方法MRT（全乳环状试验）、ELISA和FPA（荧光偏振试验）都是奶样检测方法，它们被OIE规定为控制与根除布病运动可采用的方法，但不推荐其用于国际贸易检测。

2.2.2.1…全乳环状试验MRT以染色的布鲁氏菌全菌作为诊断抗原，可用其检测混合奶样，当存在布鲁氏菌抗体时，红色的抗原抗体复合物转移到乳脂层，形成有色乳脂环（红色为紫红色）。

MRT被认为缺乏敏感性，但由于检测成本低廉，这种缺陷可通过反复检测来加以弥补。

OIE规定MRT只能用于奶牛检测。

2.2.2.2…ELISA与荧光偏振测试上文提到的用于检测血清样本的ELISA与FPA，优化改进后也适用于对奶样检测，但用于奶样检测时的敏感性低于血清样，因此当其用检测奶缸样品时，需要预先测定其对于混合奶样的检测敏感性。

同样，奶样ELISA与奶样FPA的敏感性也可通过提高检测频率予以弥补。

上述方法被OIE规定可用于奶牛、小反刍兽的布病检测。

2.2.3…皮肤测试皮肤测试本质上是一种超敏反应，检测由布鲁氏菌引起的特异性细胞免疫反应。

在皮肤上注射由粗糙型布鲁氏菌提取的布氏菌素后，会在注射部位发生局限性的炎性反应，表现为红、肿、热、痛等。

此法不能区分疫苗免疫与自然感染，但在区分真正的布鲁氏菌动物与血清学假阳性动物上有较高的效率。

较高的特异性与较低的敏感性决定了该法更适用于整群检测而不适用于个体检测。

皮肤检测被OIE规定为可选的方法。

3 总结布鲁氏菌病的各种诊断技术具有不同的适用范围，并且各自都存在着一些缺点和局限性，因而不能相互取代。

血清学方法仍然是动物布病检测的常规方法，但存在以下不足，例如，检测依赖于体内抗体水平；测试会因为抗体交叉反应而出现假阳性；血清学阳性只能推断感染，不能确定感染状态是持续感染还是耐过状态。