中成药上市后再评价基础研究的若干问题

25
2 power of β (μ V )
Control
Model
（1）恢复期评价指标——行为学实验（神经评分）
3 4 0 1
1.8 1.6 ## sham model CTP 15mg/kg CTP 30mg/kg CTP 60mg/kg NBP 70mg/kg BC 7mg/kg ##
1.4
##
神经评分（分）
1.2 1 0.8 *
* *
##
2
* 0.6 0.4 0.2 0
意识及行为觉醒
观察指标
1
对脑损伤大鼠脑电图的影响
2
对脑损伤大鼠皮层锥体细胞 及突触超微结构的影响
3
对脑损伤大鼠脑血管生成 和神经发生的影响
对脑损伤皮层及脑干胆碱神经递质系统的影响 对脑损伤皮层及脑干单胺类神经递质系统的影响 对中枢神经递质作用的共同环节的影响
1
对脑损伤大鼠脑电图的影响
EEG of waking rats
病证结合模型示例2： 证侯人血清药理学研究 方剂的功效是特定方药与特定病证之间相互作用的结果 体外
证侯病人( 血清)
方药(含药 血清)---干 预
刺 激 RAW264.7 细 胞 检 测 Toll样受体（1-9） 细胞因子
一
与“开窍醒神”功效相关 的生物学指标
1.不是中枢兴奋与镇静 2.终点指标:脑功能的改善 促清醒(脑电图)-----模型:感染中毒性脑损伤 缺血或出血性脑损伤等 3.主要作用环节:突触结构、神经细胞保护、神经发生和 血管新生
中药研发和评价技术平台
探索符合中医药特点的研究方法，构建现代新药发现和评
价的技术体系
– 基于中医理论和临床特点的现代中药新药发现模式
– 基于重要整体作用特点和现代生物医学理论和技术
的中药筛选方法研究
– 适合中药多成分和复杂作用特点的中药评价技术研究
中药研制的特点和现状
问题：
• 立项依据不够充分
特点： •有中医医 学理论指导及
（1）急性期评价指标——TTC染色
Sham
Vehicle
Normal
Sham
Vehicl e Infarct size of rats with tMCAO (TTC staining)
（2）急性期评价指标——神经症状评分
0 1 3 4
2
用于恢复期评价指标——以梓醇为例
梓醇
Model
NBP
BC
长期临床应用经验
•临床优势与特色较突出
• 中药功效体现不足
• 临床前药效学研究结果支持 力度不够 • 研究薄弱，多成分，作用靶 点和机理研究尚不充分
筛选
A. 优化 处方
B.筛选药 效指标应 针对主治
针对临床适应症 • 脑缺血急性期用药 ----MCAO 模型72 小时内各项指标 • 脑缺血恢复期期用药（肢体功能障 碍、中风后抑郁、血管性痴呆） ---MCAO 模型造模后 3 天至 3 个月内针 对具体疾病的主要指标。 • 肝纤维化用药 ---- 肝纤维化组织形态 学结果 • • • 不妥善的药效指标举例 脑缺血急性期用药----抗氧化指标 肝纤维化用药----体外溶栓指标 流感用药----体外抗菌指标
病证结合模型示例1： Ⅱ型胶原注射结合寒湿/湿热刺激致类风湿性关节炎大鼠病证结 合模型
模型建立方法：
• 寒湿刺激法复制寒湿型RA大鼠模型：将注射CⅡ大鼠置于动物实验箱中 ，设定温度5℃，湿度95%，模拟寒湿病因。每天刺激8h，连续6周。 • 湿热刺激法复制湿热型RA大鼠模型：将注射CⅡ大鼠置于动物实验箱中 ，设定温度35℃，湿度95%，模拟湿热病因。每天刺激8h，连续6周。 观察指标: • 疾病观察指标：肿胀度、踝关节组织病理学、 IgG、C反应蛋白、炎性细 胞因子等 • 证候观察指标：一般状态（活动度、皮毛、舌色、口唇颜色、心率等） 、体温、饮水量、摄食量、体重、cAMP/cGMP、血流变、神经递质等 • 具差异性的指标：DA、IFN-y、PDGF-AA、CINC-2a、IL-1
* * *
* *
3d
7d
10d
14d
药物对脑缺血损伤大鼠不同时间点神经评分的影响
*p<0.05,**p<0.01 vs model group；##p<0.01 vs sham group
（1）恢复期评价指标——行为学实验（横木行走）
8 7 sham model CTP 15mg/kg CTP 30mg/kg CTP 60mg/kg NBP 70mg/kg BC 7mg/kg * * * * * ## ## ## ## 3 2 1 0 * * *
急性期（坏死期）：6-48 h，病变组织变软、坏死，神经细胞大片 消失，脑损伤进行性加重。
恢复早期（软化期）：3-14 d，病变组织变软液化，星型细胞增生， 血管侧支循环重建及神经组织修复重塑启动。神经功能障碍明显。 恢复期：3-4 w 后，液化坏死组织清除，卒中囊、胶质瘢痕形成。 后遗症：可持续数月至1-2年，可出现由缺血性脑损伤引起的痴呆、 抑郁。
减轻神经功能行为学评分，提高横木行
走能力和抓握力量，缩短揭除胶布潜伏
期，步态行为有改善，说明药物能促进 脑缺血损伤大鼠神经功能的恢复。
血管性痴呆药物评价指标（缺血后遗症期）
研究内容
防治血管 性痴呆的 药效学评 价
防治血管 性痴呆的 机理研究
（1）利用Morris水迷宫检测学习记忆功能的测定
空间参考记忆 空间搜 索实验
工作记忆
隐藏平 台获得 实验
工作记 忆
（1）测试大鼠空间参考记忆能力： ①隐藏平台获得实验：测试大鼠寻找隐藏平台的逃避潜伏期及游泳路径。观察药 物对空间参考学习、记忆获取能力的影响。 ②空间搜索实验: 撤除平台，测试大鼠在原平台象限游泳时间、路程和大鼠在水 池中穿过原平台所在位置的次数。观察药物对空间参考记忆保持能力的影响。 （2）测试大鼠工作记忆能力：将平台的位置改为不固定 ,记录动物寻找移动平台 的时间和路径。观察药物对工作记忆能力的影响。
HE染 色 计数 海马 锥体 细胞
尼氏染色 尼氏体变化
治疗血管性痴呆的机理研究
Glu/GABA学习记忆调节系统
自由基代谢
机理研究
胆碱能神经系统
突触结构蛋白表达
三、注意中药特色特点的药效学设计
加强证候模型的应用，突出方-证的适配性 证候理论研究的基础上，引入先进的研究理念和技术， 探究疾病发生发展的生物学本质，寻找证候产生的主要生 物标志物，解决作用于复杂生命体的具有复杂化学体系的 方、药的干预实质，发挥方、药的临床作用
CTP L
CTP M
CTP H
Sham
行为学检测
抓 握 力 量 步 态 分 析 组 织 特 殊 染 色
形态学检测
免 疫 组 化 染 色
分子生物学检测
神 经 评 分
横 木 行 走
超 微 结 构
PI3K和Akt Bcl-2和Bax NGF和TrKA 、 NGF、BDNF、 VEGF、bFGF BDNF和TrKB
1. 针对疾病模型进行有效性研究
例： 缺血性脑病研究方法 关键问题：临床定位准确
缺血性脑卒中
病理机制
缺血性脑卒中是一种严重威胁 人类特别是中老年人健康的常见 病，即使应用目前最先进、最完 善的治疗手段，仍可有 75 ％的存 活者遗留有不同程度的残疾，是 成人致残的首 要原因。
缺血性脑卒中
病理机制
研究方法与结果
GAS-2检测实时步态行为
5. 背景增强 装置
2. 大/小鼠步 行通道 4. 足迹增 强板 3. 高速摄 像机 1. 视频采集 分析计算机
训练阶段 录像阶段
分析录像
疗效评价
在脑缺血损伤恢复早期（3-14d）， 通过口服给药治疗，大鼠的运动感觉功
能得到f anaesthesia rats
Fig1 Tracing of electrocorticogram in rats
Fig 2 Normal electrocorticogram of awaking rats
Fig 3
Electrocorticogram of focal cerebral ischemia rats
中药新药临床前和上市后再评价 药效学研究的若干问题
药品临床价值评价的目的
1. 指导和规范临床合理用药 ,研究无止境
要用新的科学技术通过评价的方式对一个药品的实 况进行分析评价，使得该药在临床上得以准确的应用。
2. 发挥医学基础研究的桥梁作用，快速有效服务 临床工作
运用医药学的最新学术水平，从药效毒理，有效物 质基础，质量控制等方面，有利于全面提升已上市的药 品的科技含量，提供新的生物科技信息。
复杂过程
脑缺血： • 能量耗竭，酸中毒 • 炎症级联反应 • 细胞凋亡 • 自由损伤 • 内源性保护机制：热休克蛋白、 营养因子、内源性抗氧化剂等 • 兴奋性氨基酸毒性：一氧化氮毒 性
时间窗分期与病理改变 赵建国主编. 脑梗死.北京：人民卫生出版社，2006
• • • • •
超早期：1-6 h，病理改变可逆。
揭除胶布潜伏期（秒）
300
3d
7d
10d
14d
梓醇对脑缺血损伤大鼠不同时间点揭除胶布潜伏期的影响
*p<0.05,**p<0.01 vs model group；##p<0.01 vs sham group
研究方法
二、步态行为
研究方法与结果
Spinal Cord Injury Peripheral nerve injury Traumatic brain injury
脊髓损伤
周围神经损伤 脑外伤
Parkinson’s disease
Cerebral ischemic injury Neuropathic pain
帕金森综合症
脑缺血损伤 神经性疼痛 关节炎 运动肌肉骨骼损伤
Arthritis
Motion musculoskeletal injuries
步态分析结果
1. 痴呆动物有明显的步态行为改变 2. 药物治疗可以逆转部分步态行为改变 3. 老年痴呆动物步态行为改变与认知功能降低有一定 相关性 4. 步态行为检测可以作为AD行为学的评价手段
（2）对血管性痴呆大鼠神经病理学的影响
对MCAO血管性痴 呆大鼠神经病理学 改变的影响
对慢性低灌 注性血管性 痴呆大鼠神 经病理学改 变的影响 海马GFAP表 达 星形胶质细胞 活化及增殖
突触结构
神经发生
机理研究
血管新生
神经细胞保护
与“开窍醒神”功效相关的生 物学指标(安宫牛黄丸)
神经元和突触 结构及形态
胆碱递质系统紊乱 Ach 神经元和突触 结构及形态
脑损伤 (皮层及脑干)
单胺递质系统紊乱 NE,5-HT,DA
意识障碍及昏迷
安宫牛黄丸 EEG慢化 （β ↓δ ↑） EEG激活 （β ↑δ ↓） 安宫牛黄丸
急性期评价指标
（1）脑梗死范围
（2）神经症状 （3）脑血流量（CBF）或区域性脑血流量（ICBF）
（4）脑组织含水量
（5）脑内神经递质 （ 6 ）脑组织生化指标：包括能量代谢和毒性产物，如三磷酸腺苷 （ ATPase ） 、 磷 酸 肌 酸 （ Per ） 、 乳 酸 （ LA ） 、 乳 酸 脱 氢 酶 （LDH）、自由脂肪酸（FFA）、脂质过氧化物（LPO）、兴奋性氨 基酸（EAA）及基因表达等。 （7） 脑电图（EEG）：用于全脑缺血时，确定脑缺血的形成及再灌 脑血流恢复正常的时间。 （8） 神经细胞病变程度：应进行定性、定量组织学观测。
横木行走评分（分）
6 5 4
*
3d
7d
10d
14d
药物对脑缺血损伤大鼠不同时间点横木行走能力的影响
*p<0.05,**p<0.01 vs model group；##p<0.01 vs sham group
（1）恢复期评价指标——行为学实验（抓握力量）
1400 1200 1000 800 ##
sham model CTP 15mg/kg CTP 30mg/kg CTP 60mg/kg NBP 70mg/kg BC 7mg/kg ## ##
** ** ** ** *
##
抓握力量
600 400 200 0
3d
7d
10d
14d
梓醇对脑缺血损伤大鼠不同时间点抓握力量的影响
*p<0.05,**p<0.01 vs model group；##p<0.01 vs sham group
（1）恢复期评价指标——行为学实验（触觉刺激实验）
400 350 ## ## ## * 250 * * 200 150 * ** 100 50 0 * * ## sham model CTP 15mg/kg CTP 30mg/kg CTP 60mg/kg NBP 70mg/kg BC 7mg/kg