亲和色谱
9 亲和色谱
然后把含有目的物质的混合液作为流动相，在 有利于固定相配基与目的物质形成络合物的条 件下进入层析柱。
16
这时，混合液中只
有能与配基发生结合反
应形成络合物的目的物
质（图中· 分子）被吸附。
不能发生结合反应
的杂质分子（图中△分 子）直接流出。
17
经清洗后，选择适当的洗脱液或 改变洗脱条件进行洗脱（图中c），
22
配体的选择：
一对可逆结合的生物分子中与载体相偶 联的一方称配体。如抑制剂，底物，抗体， 辅酶等。
优良配体须具备的条件：
1）与待纯化的物质有较强的亲和力。 2）具有与基质共价结合的基团。
23
目的产物与相应的配基
所要分离的目 的产物
酶 抗体 凝集素 激素
相应的配基
底物、抑制剂、辅酶（辅因子） 抗原、病毒、细胞 多糖、糖蛋白、细胞受体 受体、载体蛋白
亲和配基选择（很困难）：
组合化学肽库：小肽亲和配基。
噬菌体展示技术筛选：目标蛋白与噬菌体结合。
SELEX技术筛选：：与蛋白质相匹配的寡核苷酸 6
9.1 生物亲和作用
9.1.2 影响亲和作用的因素
离子强度 pH值
抑制氢键形成的物质
温度 螯合剂
7
9.1 生物亲和作用
9.1.3 亲和作用体系
8
9.2 亲和色谱原理
使被分离物质与固定相配基解离，
即可将目标产物分离纯化。
18
9.3 亲和色谱介质
一般情况下，需根据目标产物选择合适 的亲和配基来修饰固体粒子，以制备所需的
亲和吸附介质（固定相）。 固体粒子称为配基的载体。
19
作为载体的物质应具有（6点）： ①不溶性的多孔网状结构，渗透性好； ②物理和化学稳定性高，有较高的机械强度， 使用寿命长； ③具有亲水性，无非特异性吸附； ④含有可活化的反应基团，利于亲和配基的固
亲和色谱洗脱步骤-概述说明以及解释
亲和色谱洗脱步骤-概述说明以及解释1.引言1.1 概述亲和色谱是一种分离和纯化生物大分子的常用技术，它通过利用生物大分子与其配体之间的特异性相互作用来实现分离。
配体可以是一种蛋白质、抗体、寡核苷酸或其他具有亲和性的分子。
亲和色谱的洗脱步骤是整个分离过程中非常重要的一环。
洗脱步骤通常是在样品与亲和色谱介质之间相互作用的基础上进行的，旨在以一种控制的方式解离目标分子与亲和介质之间的相互作用，从而实现目标分子的高效纯化。
在洗脱步骤中，通常会使用适当的洗脱缓冲液来改变样品与亲和介质之间的物理、化学条件，从而打破它们之间的亲和作用。
这样一来，目标分子会从亲和介质上解离出来，进而被洗脱出来。
洗脱缓冲液的选择具有很大的灵活性，可以根据目标分子与亲和介质之间的相互作用类型进行优化。
常用的洗脱策略包括改变pH值、离子强度或离子种类、添加竞争性配体等。
通过这些手段调控洗脱缓冲液的条件，可以实现对目标分子的高效洗脱。
同时，洗脱步骤的优化也需要考虑目标分子的稳定性和纯化效率等因素。
总之，亲和色谱的洗脱步骤是亲和色谱技术中至关重要的一环。
它通过改变样品与亲和介质之间的相互作用条件，实现了目标分子的高效纯化。
洗脱策略的选择和优化对于获取高纯度的目标分子至关重要，因此需要充分考虑各种因素的影响并进行实验验证。
文章结构部分的内容可以包括以下几个方面：1.2 文章结构本文共分为三个部分：引言、正文和结论。
引言部分介绍了亲和色谱洗脱步骤的背景和意义，包括亲和色谱的定义和作用。
接着介绍了本文的目的，即详细讨论亲和色谱的洗脱步骤。
正文部分分为两个小节。
第一个小节是亲和色谱的原理，详细介绍了亲和色谱的基本原理和工作机制，包括亲和剂与目标分子的特异性结合、固定相和流动相的选择等内容。
第二个小节是亲和色谱的洗脱步骤，将详细讨论亲和色谱洗脱的各个步骤，包括样品的加载、洗脱剂的选择和优化、梯度洗脱的条件等。
结论部分对亲和色谱洗脱步骤进行总结，归纳了各个步骤的重要性和影响因素。
亲和色谱
聚丙烯酰胺-琼脂糖 多孔玻璃
1,6-己二胺, 6-氨基己酸 氨基丙基, 氨基己基
第四节 亲和吸附剂的制备
一、要求 ㈠. ㈡. 结 L与基质结合，对L-S结合无干扰； L为小分子有的需“手臂”，使L-S
合更有效； ㈢. 非专一吸附不大，以免吸附杂质； L与基质结合稳定（吸附、洗脱、再生）。
二、
偶联用Gel的选择 需考虑： ㈠. L上可供偶联的基团 ㈡. “手臂” ㈢. L的稳定pH
第二节 亲和色谱配基 (ligand L) ㈠ 作为配体的条件
亲和力大;具有解离平衡;与载体偶联不失活
㈡常用系统
酶: 底物或类似物、辅助因子、可逆抑制剂、效应物 核酸: 互补顺序、组蛋白、结合蛋白、核酸多聚物 激素: 受体、运载蛋白 抗体: 抗原、病毒、细胞 外源凝集素: 多糖、糖蛋白、细胞
亲和层析常用配体
连接臂先偶联至载体后接配体
四、由氨基-Sep或羧基- Sep制备 Sep-(CH2)6-NH2 L-COOH AH-Sep Sep-(CH2)6-COOH L-NH2 CH-Sep 碳二亚胺法（配基偶联的一种方法）：
第三节 亲和层析载体
一、作为载体的条件 1.亲水 2.惰性 3.具有活化基团 4.大网孔 5.机械性能好
二、载体的选择
1.琼脂糖凝胶： 亲水性强，理化性质稳定 （商品名：Sepharose） 2.聚丙烯酰胺凝胶： 理化性质稳定，耐有机溶剂及去污 剂， 抗微生物能力强， 特别适应用配基与提取物亲和力 比较弱的物质。 3.葡聚糖凝胶： 有良好的化学及物理性质，孔径小。 4.纤维素： 非特异吸附严重，廉价，易得。 5.多孔玻璃 ：物理性能好，有非特异性吸附。
4.3
亲和色谱(层析)
Affinity Chromatography, AC 第一节 概述
亲和色谱PPT
免疫亲和色谱 固定化金属离子亲和色谱 其他亲和色谱
免疫亲和色谱
免疫亲和色谱(Immunoaffinity Chromatography, IAC)是 利用生物体内存在的抗原、抗体之间高度特异性的亲和 力进行分离的方法。
IAC的特点
1. 2. 3.
专一 高效 灵敏 ……
IAC的应用
1. 2.
抗体的分离纯化——Protein A亲和色谱 快速诊断测试 ……
固定化金属离子亲和色谱
固定化金属离子亲和色谱(Immobilized Metal ion Affinity Chromatography, IMAC) 主要根据蛋白质中组氨酸、色氨酸或半胱氨酸等氨基酸 残基与色谱柱上的金属离子螯合作用形成络合物，从而 实现分离 产物变性 • 渗漏
谢谢
亲和色谱 Affinity Chromatography
黄岳
生研1502
亲和色谱概述
概念：利用生物分子间专一的亲和力而进行分离的一种色谱技术
原理和基本过程
原理：将具有亲和力的两个分子中一个固定在不溶性基质 上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子 进行分离纯化。
亲和色谱的类型
1. 2. 3.
配基稳定性高 ，不易脱落 金属离子配基价格低廉 ，再生成本低 省去了脱盐的预处理步骤 容易洗脱目标蛋白
IMAC的应用——Ni-Agarose His标签蛋白纯化技术
其他亲和色谱技术
生物亲和色谱 拟生物亲和色谱 分子对亲和色谱 共价亲和色谱 凝集素亲和色谱 ……
亲和色谱需要考虑的问题
亲和色谱
Chitin
Trypsin
A
B
C&D
以凝胶电泳检验亲和色谱 操作过程各步骤样品→
Ate 吸附剂：
羟基磷灰石
(Ca5(PO4)3OH)2
可选择 NaCl 或 磷酸 等不同洗脱条件
Bio-Rad CHT
●疏水性层析法：
●●●●● ●●●
-NH2
●● ● ●
硫醇基 -SH
X
■ 可与各种配体基团反应的载体：
配体基团 親 和 性 载体
CNBr-activated Sepharose 4B
Pharmacia
反应方式
直接反应 加 EDC*
反应基团
-C≡N -COOH N-OH-succinimide Oxirane环氧己烷
■ Hydrophobic interaction 色析法：
Ammonium sulfate (% sat.) 25
0 10
Protein concentration
20
15
20
10
5
30
40
50
100
200
300
400
Elution volume (mL)
Pharmacia HIC
Ethylene glycol (%)
亲和色谱(AC)
（Affinity chromatograph）
原理：利用生物大分子和固定相表面存在的 某种特异性亲和力，进行选择性分离。 先在载体表面键合上一种具有一般反应 性能的所谓间隔臂(环氧、联胺等)，再连接 上配基(酶、抗原等)，这种固载化的配基将 只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作 用而被保留。改变淋洗液后洗脱。 亲和洗提 酶与其它化合物一起吸附到一种离子交换剂 上，然后用适当的底物特异地洗提。
亲和色谱分离
中等盐浓度的缓冲液能稳定溶液中蛋白质并
防止由于离子交换所引起的非特异性相互作 用。
5 操作方法
3. 柱操作
柱的大小取决于吸附剂的容量和所需纯
化的蛋白质的量。一般地说，高的容量
② 流速控制
不能太快
延长时间可促进吸附
③ 吸附时间的控制
④ 进样量的大小
减少进样量，可提高吸附效果。
4 亲和色谱操作条件的选择
2. 清洗条件的选择
洗涤缓冲液的强度应介于目的分子吸附
条件与目的分子洗脱条件之间
4 亲和色谱操作条件的选择
3. 洗脱条件的选择
在实际操作过程中，应该在洗脱强度和 耐受程度之间做好平衡。
1. 载体的选择
常用的亲和色谱载体主要有多孔玻璃载
体、聚丙稀酰胺载体、纤维素载体、葡
聚糖凝胶载体、琼脂糖凝胶和交联琼脂
糖凝胶载体等。
2. 配基的选择
根据配基应用和性质，可将其分为两
类：特殊配基和通用配基。亲和层析
中常用的特殊配基有某一抗原的抗体、
某一酶的专用抑制剂、某一激素的受
体等。通用配基可适用于一类物质的
分离提纯，如用NADH作脱氢酶类亲和
层析的通用配基。
2. 配基的选择
首先，应当仅仅识别被纯化的目的物(配 体)。其次，配体与配基应该有足够大的亲 和力。再次，配基与相应目的物之间的结
合应具有可逆性。第四，配体具有足够的
稳定性，能够耐受反应条件以及清洗合再 生等条件。最后，配基的分子大小必须合 适。
3. 载体的活化与偶联
载体由于其相对的惰性，往往不能直接与配基
亲和层析色谱法
亲和层析色谱法
亲和层析色谱法（Affinity chromatography）是一种利用生物分子的特异性相互作用进行分离和纯化的技术方法。
它基于目标分子与固定相上的亲和配体之间的特异性结合，通过这种结合来实现分离和富集目标分子。
亲和层析色谱法的原理是在固定相上引入亲和配体，这些配体可以选择性地与目标分子结合。
固定相通常是一种多孔的或者具有大表面积的材料，如琼脂糖凝胶、硅胶、聚合物等。
亲和配体可以是抗体、酶、亲和标记物等，它们能够与目标分子发生特异性的结合。
在进行亲和层析色谱时，目标分子溶液会通过固定相，处于非特异性结合的状态下，不与固定相上的亲和配体结合。
然后，通过洗涤步骤去除非特异性结合物。
最后，通过改变溶液条件（如pH、温度等），使得目标分子与亲和配体之间的结合解离。
这样，目标分子就可以从固定相上洗脱出来。
这种方法能够实现对目标分子的高效纯化和富集。
亲和层析色谱法广泛应用于生物化学、生物技术和制药工业中，用于分离和纯化蛋白质、抗体、核酸等生物分子。
它具有选择性高、纯化效果好、操作简
便等特点，已成为分离和纯化生物分子的重要方法之一。
《亲和色谱》课件
生物工程技术
利用生物工程技术改造蛋白质 或酶，提高亲和色谱的特异性
。
光学检测技术
结合光学检测技术，实现高灵 敏度、高分辨率的亲和色谱分
析。
亲和色谱在各领域的应用前景
生物医药领域
用于蛋白质、细胞、病毒等生物分子 的分离和纯化，为药物研发和疾病诊 断提供支持。
环境监测领域
用于水体、土壤、空气等环境样品中 污染物的分离和检测，为环境治理和 保护提供依据。
农药残留检测
亲和色谱可用于农药残留的检测，通过与农药分 子的特异性结合，实现对农药残留的高灵敏度检 测。
食品营养成分分析
亲和色谱可用于食品营养成分的分析，如维生素 、矿物质等，通过与特定配基的结合，实现对营 养成分的高效分离和检测。
亲和色谱在环境监测领域的应用案例
有毒有害物质检测
亲和色谱可用于有毒有害物质的检测，如重金属、有机污染物等， 通过与特定配基的结合，实现对有毒有害物质的高灵敏度检测。
食品安全领域
用于食品中农药残留、添加剂、毒素 等有害物质的检测和分离，保障食品 安全。
农业领域
用于植物生长调节物质、农药残留等 的分离和检测，促进农业可持续发展 。
亲和色谱的发展趋势和未来展望
智能化发展
通过自动化、智能化技术，提高亲和色谱的 分离效率和准确性。
高通量、高分辨率
开发高通量、高分辨率的亲和色谱技术，满 足大规模样品分析的需求。
稳定性差
亲和色谱的配体和载体在某些条件下可能不稳定，影 响实验结果。
适用范围有限
亲和色谱的适用范围相对较窄，仅适用于具有特异性 相互作用的目标分子。
亲和色谱的改进方向
开发通用型配体
通过研究不同类型分子间的相互作用，开发 出适用于多种目标分子的通用型配体，降低 实验成本。
sepharose 亲和色谱法
sepharose 亲和色谱法Sephadex亲和色谱法亲和色谱法是现代生物分离工艺中常用的一种方法，广泛应用于制药、生命科学等领域。
Sephadex亲和色谱法是其中一种常见的亲和色谱法技术，以Sephadex吸附材料为基础，通过静电作用或化学键等特定相互作用，使目标生物分子选择性地与吸附材料结合，实现其分离纯化。
本文将从Sephadex亲和色谱法的基本原理、操作步骤、应用前景等方面进行介绍。
一、Sephadex亲和色谱法的基本原理Sephadex亲和色谱法的基本原理是基于分子间的亲和作用，即生物分子与亲和基质之间的特异性结合。
在Sephadex亲和色谱法中，一般会选择合适的亲和基质作为吸附材料，如金属离子、抗体、蛋白质等。
这些亲和基质能与目标生物分子通过静电作用、亲水作用、疏水作用等相互作用形成稳定的复合物，从而实现目标生物分子的分离纯化。
二、Sephadex亲和色谱法的操作步骤1. 样品制备：将待分离的混合样品经过必要的前处理，如细胞破碎、蛋白质沉淀等，得到纯化后的目标生物分子。
2. 亲和色谱柱填充：选取适合的Sephadex材料填充色谱柱，可以根据目标生物分子的特性选择合适的亲和基质，并将其与Sephadex材料结合。
3. 样品上样：将纯化后的目标生物分子与填充好的色谱柱接触，通过静电作用或化学键等相互作用，使目标生物分子选择性地与亲和基质结合。
4. 洗脱分离：通过适当的洗脱缓冲液，改变色谱柱内部的条件，破坏目标生物分子与亲和基质间的结合力，实现目标生物分子的洗脱。
5. 分析纯化：收集洗脱出的目标生物分子样品，并使用合适的分析方法进行检测和定量，评估纯化效果。
三、Sephadex亲和色谱法的应用前景Sephadex亲和色谱法由于其简单易行、操作灵活等特点，在生物制药、疾病诊断、蛋白质研究等领域具有广泛的应用前景。
首先，Sephadex亲和色谱法可以用于制备药物中的目标分子。
比如，在药物开发过程中，通过亲和色谱法可以高效纯化药物的活性成分，减少其他有害成分的干扰，提高药物的纯度和活性，从而增强药物的效果和安全性。
亲和色谱法
2 间隔臂 在亲和色谱固定相中，需通过间隔臂将配位体连 接在基体上，由于间隔臂占据一定的机动空间。当配 位体与被测定的生物分子（尤其是生物大分子）产生 亲和作用时，有利于克服空间阻碍作用。 通式：
NH2 (CH2 )n R
R可为羧基、胺基或配位体自身
3 配位体 （1）染料配位体 大多是三嗪染料，主要用于蛋白质的分离与纯 化。 （2）定位金属离子配位体 它是将具有鳌合作用的有机官能团键合在间隔 壁的机体上，然后与Cu2+ ， Ni2+ ， Fe2+ ， Fe3+ 等金属离子生成稳定鳌合物，利用螯合物中的定 位金属离子与生物分子的特效亲和作用实现生物 分子的分离与纯化。
（6）共价配位体 主要用于含硫蛋白质分离。
三、亲和色谱的流动相 需使用pH值接近中性稀缓冲溶液，以保持其 生物活性。
亲和色谱使用的流动相：由磷酸盐、硼酸盐、乙酸 盐、柠檬酸盐具有不同pH值的缓冲溶液体系，有机碱三 羟甲基甲烷与盐酸顺丁烯二酸构成的缓冲溶液体系也有 较多应用。 此外，在生物大分子亲和色谱中，还广泛使用生物 研究中常用的非离子缓冲物。 如：N-(2-) 乙基-N-（2-磺化乙基）-哌嗪 （HEPES）、N,N,N',N'-四乙基乙二胺（TEEN）。
• 在载体（无机填料）上键合间隔臂（如环 氧，联氨等），再连接上配基（酶，抗原 等）。与和配基之间有亲和力的生物大分 子作用，对其进行分离。
一 、分离原理（生成锁匙结构络合物） 亲和色谱固定相上键合的配体与被分离的生物活 性分子间的相互作用，可用锁匙结构合物的生成来 表示：
二、 亲和色谱法的分类
（3）包合配合物配位体 包合配合物配位体是由主体分子与客体分子 间的特殊亲和作用而形成的。常用的主体分子为 β-环糊精、冠醚等。
凝胶色谱、亲和色谱(研究进展及案例)
食品工业领域
凝胶色谱和亲和色谱在食品 工业中的应用将有助于食品 安全监控、营养成分分析以 及食品添加剂检测等方面的 发展。
THANKS FOR WATCHING
感谢您的观看
02
03
环境污染物治理
通过凝胶色谱和亲和色谱技术，可以 研究污染物与吸附剂之间的相互作用， 为环境污染治理提供理论支持。
05 挑战与展望
当前面临的主要挑战
选择性挑战
凝胶色谱和亲和色谱在复杂样品分析中，选择性仍是一个重要挑战， 需要进一步提高分离效果和特异性。
灵敏度挑战
对于低丰度目标物，提高检测灵敏度是凝胶色谱和亲和色谱亟待解 决的问题。
样品进入色谱柱后，大分子物质由于体积较大，无法进入凝胶孔道，只能从凝胶颗粒间隙流过，路径 较短，因此较早流出色谱柱；而小分子物质可以进入凝胶孔道，路径较长，因此较晚流出色谱柱。
凝胶类型与特性
凝Байду номын сангаас类型
01
聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶等。
特性
02
不同类型的凝胶具有不同的孔径大小和分布范围，适用于分离
02 亲和色谱概述
亲和色谱原理
特异性相互作用
亲和色谱利用生物分子之间的特异性相互作用，如抗原抗体、酶-底物等，实现目标分子的分离和纯化。
固定相与流动相
在亲和色谱中，具有识别功能的配体被固定在固相载体上， 构成固定相；待分离样品溶解在流动相中，通过色谱柱时 与固定相发生相互作用。
分离过程
目标分子与固定相上的配体发生特异性结合，而其他分子 则随流动相流出色谱柱，从而实现目标分子的分离。
蛋白质鉴定
结合质谱技术，凝胶色谱和亲和色谱可用于蛋白质鉴定，揭示蛋白 质的结构和功能。
色谱聚焦亲和色谱.PPT
.
66
.
67
.
68
四、有机染料亲和色谱 (p158)
原理 有机染料如蒽酮化合物和偶氮化合物具 类似于NAD+的结构。一些需核苷酸类物质 为辅酶的酶，对这些染料具一定亲和力。
.
69
L的类似物L′，S的类似物S′ *采用酶促反应的多元专一性洗脱 ㈣. 表面活性剂
减少疏水作用、范德华力
种类常有：曲通X100 1%（V/V）、乙二醇等
.
58
㈤. 解离试剂
主要破坏氢键，如尿素、盐酸胍等
㈥. 降低温度t
较高t吸附、较低t洗脱、减少疏水力
㈦. 电泳解吸
+
在柱两端连上电极进行电泳
四、脱盐
㈠. L上可供偶联的基团 ㈡. “手臂” ㈢. L的稳定pH
三、 由CNBr活化型Sep.4B制备
商品名：CNBr-Sepharose
.
47
一般步骤：
冻干粉 溶胀洗涤 溶解L ①
混合反应 ②
掩蔽 ③
洗去L（未结合）
成品
.
48
亲和吸附剂的制备过程
.
49
㈠. 溶胀和洗涤 用1mol/L HCl 溶胀洗涤除细碎粒子
硅胶和多孔玻璃载体的亲和吸附剂最常用 的修饰方法就是进行硅烷化处理,从而给载 体引入氨基或环氧基团.
.
53
第五节 一般实验方法
是否有类专一吸附剂 有 溶胀Gel 无
选L 选偶联Gel
偶联L 装柱
.
54
安装仪器
平衡（2～3Vt） 加样吸附
洗去非吸附物
亲和柱
洗脱液
再生
脱盐
.
色谱分离技术—亲和色谱分离技术
亲和层析介质
亲和配基
常用的亲和配基： 辅酶和磷酸腺苷
某些酶需要在辅酶存在的情况下才能表现出催化活性，即辅酶能与脱氢酶 和激酶之间通过亲和作用相互结合，因此这些辅酶可用作脱氢酶和激酶的亲和 配基。
主要的辅酶有NAD、NADP、ATP。
亲和层析介质
亲和配基
常用的亲和配基： 过度金属离子
铜、镍、锌等可与氮、硫、氧等供电原子产生配位键，因此可与蛋白质表 面的组氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巯基和色氨酸吲哚基发生亲和结合作用。
的亲和能力有决定性影响。
亲和色谱法的操作方法
1.配基固相化（样品制备、装柱、平衡） 2.亲和吸附 3.解吸附 4.色谱柱再生
亲和色谱法的操作方法
1.配基固相化 将与纯化对象有专一结合作用的物质，连接在水不溶性载体上，制成亲和
吸附剂后装柱（称亲和柱），用一定pH和离子强度的缓冲液对柱子进行平衡。 2.亲和吸附
即进料和杂质清洗。将含有目标产物的料液连续通入亲和柱，目标产物吸 附在柱上，之后用缓冲液淋洗色谱柱除去未被吸附的杂蛋白。
亲和色谱法的操作方法
3.解吸附 解吸附即目标产物洗脱。用某种缓冲液或溶液通过亲和柱，把吸附在亲和
柱上的目的产物洗脱出来。
亲和色谱法的操作方法
4.色谱柱再生 用几倍体积的起始缓冲液进行再平衡，一般足以使亲和柱再生，但一些未
亲和层析介质
亲和层析介质由载体和配基组成
亲和载体
载体应具备的条件： 1.载体必须具有较好的理化稳定性和生物惰性，非专业吸附小。 2.具有大量可供活化和配基结合的化学基团，以供与配基共价连接之用。 3.载体必须具有高度的水不溶性和亲水性。 4.载体必须有稀松的网状结构使大分子能自由进入。 5.载体要有良好的机械性能，颗粒均匀。
亲和色谱名词解释
亲和色谱名词解释
亲和色谱（Affinity chromatography）是一种基于生物分子之间特异性相互作用的层析技术，用于分离和纯化特定的生物大分子，如蛋白质、核酸、糖等。
亲和色谱依赖于亲和剂（affinity ligand）与目标分子之间的特异性相互作用。
亲和剂通常是一种高度特异性结合到目标分子的物质，可以是抗体、酶、亲和标靶蛋白等。
这种特异性相互作用可以是通过离子交换、亲水性、金属离子的配位、疏水性等作用机制实现的。
亲和色谱的原理是将亲和剂固定在固定相上，并将混合物溶液通过柱床进行层析分离。
由于亲和剂与目标分子之间的特异性相互作用，目标分子可以选择性地结合到亲和剂上，而其他非目标分子则通过柱床被洗脱。
最后，目标分子可以通过改变缓冲条件、温度或添加特定的竞争性配体等方式进行洗脱。
亲和色谱具有选择性高、纯度好、操作简单等优点。
它广泛应用于生物医学研究、药物开发、生物制药等领域，特别适用于从复杂的混合物中高效分离纯化目标分子。
亲和色谱法的特点
亲和色谱法的特点
亲和色谱法: 亲和色谱法是利用生物分子间具有专一性亲和力的生物分子对而设计的色谱技术。
如酶的活性中心能与专一的底物、抑制剂、辅助因子以及效应剂通过次级键可逆地结合。
其他如抗体与抗原、RNA与DNA、激素与其受体、外源凝集素与细胞膜等体系均有类似特性。
因此选择好亲和物就可将某一生物分子有选择性地与其他物质分离,所以又称生物选择性吸附法。
操作时一般先将亲和物(配基)以共价键结合于一种不溶性的聚合物(载体)上,填充在色谱柱内,常用载体有葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、纤维素、聚丙烯酰胺凝胶等。
为减小空间障碍、提高吸附效率,有时需在配基与载体之间连入有一定长度的烃基,称为“手臂”,使配基可伸出,以有较大的活动余地。
制备好的这种固定相填充在色谱柱内,使被分离的蛋白质通过色谱柱,由于蛋白质分子上的活性中心与亲和物相结合而被滞留,其他蛋白质分子无阻滞地流出得到分离。
然后改变洗脱剂的pH值、离子强度等,即可使被分离的蛋白质分子释出,达到分离纯化的目的。
此法在制备高纯度生化制剂中得到较多应用。
免疫亲和色谱PPT课件
3
生物工程技术
利用基因工程和蛋白质工程技术，开发具有高亲 和力和选择性的免疫亲和色谱配体，提高分离效 果。
提高免疫亲和色谱的特异性、灵敏度与重现性
优化免疫亲和色谱配体
通过蛋白质工程和基因工程技术，对免疫亲和色谱配体进行改造 和优化，提高其亲和力和选择性。
信号放大技术
结合酶促反应、化学放大等技术，提高检测信号的强度和灵敏度， 降低检测限。
免疫亲和色谱ppt课件
• 免疫亲和色谱简介 • 免疫亲和色谱的制备 • 免疫亲和色谱的操作流程 • 免疫亲和色谱的实际应用案例 • 免疫亲和色谱的未来发展与挑战
01
免疫亲和色谱简介
定义与原理
定义
免疫亲和色谱是一种基于抗原-抗 体特异性结合的分离分析技术。
原理
利用抗体或抗原与固定相上的配 基进行特异性结合，达到分离目 标物质的目的。
免疫亲和色谱的应用领域
01
02
03
04
生物药物分离纯化
用于分离纯化抗体、蛋白质、 酶等生物药物。
临床诊断
用于检测生物样本中的抗原、 抗体，辅助疾病诊断。
环境监测
用于检测环境中的有害物质， 如毒素、重金属等。
食品安全
用于检测食品中的有害物质、 农药残留等。
免疫亲和色谱的优势与局限性
优势
高特异性、高纯度分离、操作简便、 可重复使用等。
准确性。
样品纯化
去除样品中的杂质，提高样品的纯 度，以便更好地进行后续分析。
样品标记
对样品进行标记，以便在免疫亲和 色谱分离过程中进行追踪和检测。
免疫亲和色谱分离
抗体选择
选择针对目标分子的特 异性抗体，确保分离的
准确性和高效性。
亲 和 色 谱
亲和色谱中两个进行专一结合的分子互称 对方为配基。如抗原和抗体，抗原可认为是 抗体的配基，反之抗体也可认为是抗原的配 基。将一个水溶性配基在不伤害其生物学功 能的情况下与水不溶性载体结合称为配基的 固相化。亲和色谱法的基本过程是： 1.配基 固相化。将与纯化对象有专一结合作用的物 质，连接在水不溶性载体上，制成亲和吸附 剂后装柱（称亲和性）。
亲和色谱分离的方法随每种分离物质的不同 而有不同。一般推荐使用的程序如下： 1.选 择配基；2.选择偶联凝胶；3.偶联配基；4. 装填合适的柱；5.平衡（2-3倍体积缓液）； 6.应用样品；7.洗涤未结合物质；8.洗 脱结合物质→除盐；9.再生
解离常数 ：
• 药物与结合位点(受体)的结合反应中，药物
与结合位点复合物解离的平衡常数，与药 物和结合位点间的亲和力成反比。
亲 和 色 谱
一、基本理论 二、实验方法
一、基本理论
（一）原理
在生物体内，许多大分子具有与某些相对 应的专一分子可逆结合的特性。例如抗原 和抗体、酶和底物及辅酶、激素和受体、 RNA和其互补的DNA等，都具有这种特性。 生物分子之间这种特异的结合能力称为亲 和力，根据生物分子间亲和吸附和解离的 原理，建立起来的色谱法称亲和色谱法。
选择配基有两条标准：第一是蛋白质和配基之间 必须有强的亲和力，解离常数在5mM以上不是好 配基； 相反亲和力太高也是有害的，因为在解离 蛋白质──配基复合物时所需的条件就要强烈， 这样可能使蛋白质变性。例如用抗生物素蛋白作 配基纯化含生物素的羧化酶时，生物素──抗生 物素蛋白复合物的解离常数达10-15M，解离时需 要pH1.5，6M盐酸胍，在这种条件中羧化酶大多 数已经变性；第二是，配基必须具有适当的化学 基团，这种基团不参与配基与蛋白质之间特异结 合，但可用于活化和载体相连接，同时又不和吸附。将含有纯化对象的混合物通 过亲和柱，纯化对象吸附在柱上，其他物 质流出色谱柱。 3.解吸附。用某种缓冲液 或溶液通过亲和柱，把吸附在亲和柱上的 欲纯化物质洗脱出来。
9 亲和色谱
疏水色谱 在载体表面连接上疏水的直链碳链或其 他疏水基团，如苯基，可以与蛋白质的 某些疏水基团相互作用，从而实现多组 分的分离。 操作要点 蛋白质的局部变性 洗脱采用逐步降低盐浓度的方法进行
离子交换色谱是最常用的蛋白质分离手段 操作要点： 由于蛋白质是两性电解质，在不同的pH值 下，其解离程度是不同的，因此既可以采 用阳离子交换，也可以用阴离子交换，可 视具体情况而定 由于蛋白质的极性基团很多，为了避免洗 脱困难，通常采用弱阳或弱阴离子交换剂 适当调节缓冲溶液的pH值，使蛋白质适当 解离，通常采用的pH值靠近其等电点（不 是等电点）
应用举例 利用高温杀死的酵母细胞为亲和过滤介质进行 亲和过滤纯化con A的研究。 酵母细胞（直径约5 μm）表面含有多糖残基， 因此可亲和吸附con A。
亲和双水相萃取
亲和双水相萃取即在PEG或Dextran上接上 一定的亲和配基，这样使体系具有双水相处 理量大和亲和色谱专一性高的优点。
柱子：BSA-Sepharose 4B
洗脱方式：逐次降低洗脱液pH值
分离组分：BSA血清不同的抗体组分。
应用举例
组织纤溶酶原激活剂（tPA）的纯化
干扰素（IFN）的纯化 重组人白细胞干扰素，经 一步单抗免疫亲和层析， rhIFN-α比活提高了1150 倍，收率达95%。
柱子：精氨酸-Sepharose 4B亲和柱 洗脱液：盐酸胍（GuCl) 猪心组织t-PA :活性提高7 倍，收率为56%
色谱法的基本原理
色谱法是利用混合物中各组分物理化学性质的差 异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、 分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的， 称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相） 中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度 移动而达到分离的目的。
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亲和作用
亲和作用：生物分 特异性
亲和体系
子能够区分结构和 性质非常接近的其
高特异性
抗原-单克隆抗体 荷尔蒙－受体蛋白 核酸－互补碱基链段、核酸结合蛋白
他分子，选择性地
酶－底物、产物、抑制剂
与其中某一种分子
相结合，生物分子
群特异性
免疫球蛋白－A蛋白、G蛋白 酶－辅酶
间的这种特异性相
凝集素－糖、糖蛋白、细胞、细胞表面
分类
名称
作用原理
应用
免疫亲和色谱
抗原与抗体专一性识别
抗原或抗体
固定化金属亲和色谱 锌、镍离子与蛋白表面组氨酸特异性识别 含有组氨酸的蛋白
染料亲和色谱
染料与蛋白之间的特异性识别
激酶、脱氢酶
核苷酸亲和色谱
核苷酸与蛋白之间的特异性识别
激酶、脱氢酶
凝集素亲和色谱
凝集素与糖之间转移性可逆结合
糖蛋白
蛋白亲和色谱
对 类似的抗体的转移性
免疫蛋白等
操作流程
❖ 找与底物专一可逆结合 的配基；
❖ 将配基通过共价键偶联 到基质；
❖ 配基与底物吸附； ❖ 洗脱目标物。
例子
免疫亲和色谱
❖ 抗原和抗体的作用具有高度的专一性, 并且它 们的结合亲和力极强。因此用适当的方法将 抗原或抗体结合到吸附剂上, 便可有效地分离 和纯化免疫物质。
条件； 3、在洗脱中，交联在层析介质上的配基可能脱落并进入产品
中，从而造成不良影响，如抗体、染料等配基。
影响因素
❖ 上样体积---若目标产物与配基的结合作用较强，上 样体积对亲和色谱效果影响较小。若二者间结合力 较弱，样品浓度要高一些，上样量不要超过色谱柱 载量的5%~10%。
❖ 柱长------亲和柱的长度需要根据亲和介质的性质确 定。如果亲和介质的载量高，与目标产物的作用力 强，可以选择较短的珠子；相反，则应该增加柱子 的长度，保证目标产物与亲和介质有充分的作用时 间。
互作用。
受体 酶、蛋白质-肝素
酶、蛋白质-活性色素（染料）
酶、蛋白质-过渡金属离子（铜、锌等）
酶、蛋白质－氨基酸（组氨酸等）
基本特点
优点： 1、纯化过程简单、迅速，且分离效率高； 2、特别适用于分离纯化一些含量低、稳定性差的生物大分子 3、纯化倍数大，产物纯度高。 缺点： 1、价格相对较昂贵； 2、必须针对某一分离对象制备专一的配基及寻求稳定的层析
基因重组融合蛋白的纯化
❖ 流速---亲和吸附时目标产物与配基之间达到结合反应平 衡需要一个缓慢的过程。因此，样品上柱的流速应尽量 的慢，保证目标产物与配基之间有充分的时间结合，尤 其是二者间结合力弱和样品浓度过高时。
❖ 温度---温度效应在亲和色谱中比较重要，亲和介质的吸 附能力受温度影响，可以利用不同的温度进行吸附和洗 脱。一般情况下亲和介质的吸附能力随温度的升高而下 降，因此在上样时可选择较低的温度，使待分离物质与 配基有较大的亲和力，充分地结合；而在洗脱时刻采用 较高的温度，使待分离物质与配基的亲和力下降，便于 待分离物质从配基上脱落。一般选择在4℃进行吸附， 25℃下进行洗脱。
原理
将一对能可逆结合和解离生物分子的一方作为配基 （也称为配体），与具有大孔径、亲水性的固相载 体相偶联、制成专一的亲和吸附剂，再用此亲和吸 附剂填充色谱柱，当含有被分离物质的混合物随着 流动相流经色谱柱时，亲和吸附剂上的配基就有选 择地吸附能与其结合的物质，而其他的蛋白质及杂 质不被吸附，从色谱柱中流出，使用适当的缓冲液 使被分离物质与配基解吸附，即可获得纯化的目的 产物。
❖ 特点：分离效率高，成本高，而且蛋白质亲 Βιβλιοθήκη 配基不稳定，容易降解。解析方式
❖ 特异性解吸——半抗原置换
❖ 非特异性解吸——调节pH值、加入试剂破坏 氢键、引入离子对、加入表面活性剂、冷蒸馏 水洗涤。
纯化血小板第4 因子(PF4)
❖ 用单克隆抗体亲和色谱从人血小板破碎液中 纯化血小板第4 因子(PF4)。将单克隆抗体Sz95- LgG 与溴化氰活化的Spharose 4B 凝胶连 接成亲和色谱柱, 人血小板破碎液经此亲和色 谱柱上样后, 经洗脱获得PF4。结果表明, Sz95- Sepharose 4B 亲和色谱柱的偶联率为72%, 每1mL血小板破碎液中可以纯化到PF4 18 μg 。
高效液相色谱——亲和色谱
定义
亲和色谱也称为亲和层析，是一种利用固定 相的结合特性来分离分子的色谱方法。亲和 色谱在凝胶过滤色谱柱上连接与待分离的物 质有一定结合能力的分子，并且它们的结合 是可逆的，在改变流动相条件时二者还能相 互分离。亲和色普可以用来从混合物中纯化 或浓缩某一分子，也可以用来去处或减少混 合物中某一分子的含量。