胰酶消化贴壁细胞

细胞冻存程序
1．细胞冻存前24-48小时传代培养，使细胞处于 指数生长期 ． 2．经胰酶消化后，加入适量培养基，吹打成细胞 悬液． 3．加入新生牛血清． 4．加入经过除菌过滤的ＤＭＳＯ． 5．混匀
6．将悬液加入灭菌冻管中，1-2 ml/支，严密封 口后，注明细胞名称 ． 7．置4度冰箱中，30分钟后转入-20度冰箱中， 30分钟后转入液氮口，４小时后转入液氮中 30 ４ 保存． 8.复苏一支细胞，检测细胞活力及有无污染
1、 冷冻速率
冷冻速率是指降温的速度，是活细胞能否被 冷冻到一个能永久保存的温度的一个主要因素 。冷冻速率太快或太慢都会造成细胞的损伤， 只有以最适的冷冻速率冷冻细胞，才能获得最 佳的冷冻保存效果。
2、复温速率
复温速率是指细胞复苏时温度升高的速度。 冷冻保存的细胞复苏时，复温速率不当也会降 低冷冻存活率。一般来说复温速度越快越好， 37℃水浴中，1～2分钟内要完成复温。
细胞复苏程序
• 取出贮存细胞，37℃水浴中快速融化 • 直接用完全生长培养基铺板细胞。1ml冻存细 胞使用10~20ml完全生长培养基 . • 24小时细胞贴壁后换液.
注意:
1) 冻存可用10%-90%的血清，一般高浓度血 清有助于维护细胞活力 . 2) 细胞在-15度左右胞内形成结晶对细胞损伤 最大，缓慢降温有助于减少损伤，故放入-20 度冰箱中冻存可实现缓慢降温较为方便，保存 时间过久会影响细胞活力
谢谢
2) EDTA消化液使用注意事项
1. 常用浓度在0.02%左右。 2. 在弱碱性条件下才易溶,配制时应调节好酸 碱度。 3. EDTA能显著影响PH值,且不会被终和,所以 消化下来的细胞要拿PBS洗一遍
3)
适用范围
• 因为EDTA不破坏细胞表面分子，仅与 Ca2+,Mg2+螯合。所以适用于需检测细胞表面 分子的细胞消化。
3、冷冻保护剂
冷冻保护剂是指可以保护细胞免受冷冻损伤的 物质，常被加到一定的溶液中进行配制，作为 冷冻保护液。 常用的冷冻保护剂 ：ＤＭＳＯ
4、冷冻保存温度
冷冻保存温度是指能长久保存细胞的一个深低 温度。在这样的温度下，细胞生化反应极其缓 慢或停止，但经长期保存和复苏后仍能保持正 常的结构和功能。从实际和效益的观点出发， 液氮温度（﹣196℃）是目前最佳冷冻保存温度
常见问题: 用胰蛋白酶消化后，细胞 还是成团，原因可能是什么？
• 消化时间不够； 吹打力度不够； 胰酶消化液浓度不够； 胰酶本身问题； 细胞密度过高;
二、离子螯合剂：（EDTA）
1) EDTA消化 原理:
• EDTA是一种螯合剂，因为细胞表面很多和 培养皿结合的蛋白都带有Ca2+, 或者Mg2+ ， 而EDTA就是螯合Ca2+, 或者Mg2+ 的，从而加 速细胞和培养皿的脱离 。
细胞的保存
• 细胞冻存: 细胞保存的主要方法之一。 利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中 低温保 存，使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性 保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于 实验。 • 细胞复苏：将冻存的细胞解冻，再进行传代培 养。
要获得好的冻存与复苏效果，必须了解以下几个 问题： • 冷冻速率 • 复温速率 • 冷冻保护剂 • 冷冻保存温度
• 有经验后，可肉眼对光观察贴壁半透明的细胞 层，判断消化程度。 • 如消化过头，会见到许多细胞脱落随弃去的胰 酶溶液流失,甚至造成细胞破碎。也可以在倒 数第二、三步时弃去胰酶，用瓶中残留的胰酶 继续作用至最后一步的消化程度，这样略有点 过也影响不大
注意事项
• 1．在溶解的一周内使用贮存在4℃冰箱中的 液体胰蛋白酶溶液。胰蛋白酶在4℃就可能开 始降解，如果在室温下放置超过30分钟，就 会变得不稳定 。 • 2. 在使用胰酶细胞消化液的过程中要特别注 意避免消化液被细菌污染。
图示：
• CHO贴壁细胞
• 经过48小时培养 成为致密单层
• 加入0.25%胰酶后 细胞逐渐皱缩变圆， 细胞间隙增大不再致密
• 细胞明显皱缩变小， 细胞间隙增大不再致密， 部分细胞维持正常形态， 部分细胞皱缩变圆。
• 细胞基本皱缩变圆 此时细胞吹打可下
• 细胞完全皱缩变圆 此时应弃去胰酶， 加入培养基后轻摇 可将细胞从细胞瓶 壁上洗下，将细胞 悬液用吸管吹散后 传代
贴壁细胞的消化处理 及注意事项
• 贴壁细胞: 在体外培养条件来自百度文库，必须贴附于支 持物表面才能生长的细胞。如CHO细胞。
• 消化：使经过分散的组织或贴壁的培养物相互 或与介质解离，形成单细胞或小的细胞团的操 作。
贴壁细胞的消化
• 贴壁细胞在培养瓶中长成致密单层后，继续生 长的空间不足，培养基中的营养成份也消耗较 多，同时代谢废物也有较多堆积，需要分瓶培 养，扩增、传代 。 • 贴壁较紧的细胞如Hela，HepG2，CHO等， 则需要以细胞消化液消化后，才能脱落和分散， 扩瓶 。常用的消化液为胰蛋白酶，EDTA等
• 3. 胰酶细胞消化液消化细胞时间不宜过长， 否则细胞铺板后生长状况会较差。消化不足 则细胞难于从瓶壁上吹下，反复吹打同样也 会损伤细胞活性。
• 4. 在37℃时,胰酶活性最强。
• 5. 溶液中的Ca2+、Mg2+和血清中的非特异性 胰蛋白酶抑制剂会降低胰酶活力消化过头，所 以加入有血清培养基可以终止反应
主要消化方式
• 一、酶消化法 ( 胰酶Trypsin ) • 二、离子螯合剂 ( EDTA )
一、酶消化法 ( 胰酶Trypsin )
1 ) 胰酶消化原理:
• 胰酶是一种蛋白酶。通过在特定位置上降解蛋 白，使细胞膜上和培养皿壁结合处蛋白降解， 使两者分离。这时细胞由于自身内部细胞骨架 的张力以及培养液表面张力作用下成为球形。 • 细胞消化用胰蛋白酶常用的工作浓度为0.25％， pH为7.2-7.4之间。
ＤＭＳＯ：是一种渗透性保护剂，可迅速透 ＤＭＳＯ 入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点 ，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前 透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰 晶，从而减少冰晶对细胞的损伤 。 ＤＭＳＯ的浓度必须<=10%,大于这个浓度即 ＤＭＳＯ 使在低温对细胞也有毒性作用。 有些细胞不能用DMSO，可用甘油。
2) 酶消化法操作过程：
（以下操作均必须严格按无菌操作的要求进行） •
将长成致密单层细胞的细胞瓶中原来的培养 液弃去；
•
加入0.25％胰酶溶液，视细胞瓶的大小加入 体积为0.5ml或更多（依培养器皿的大小而 定），以使充分浸润；
• 一般消化时间约为1至3分钟，肉眼观察瓶底由 半透明（细胞单层连接成片）转为点状透明 （出现细小空隙）时，弃去胰酶，并加入适量 的有血清培养液终止消化，吹打分散。