第四章酶的来源与筛选

从自然界筛选产酶微生物一般步骤：
1.采样：生物多样性环境；高选择压力环境（针对
与工艺条件相似的环境）。
2.富集培养：取其所好，投其所抗。
3. 分离：稀释涂布、划线分离。
4.筛选 • 初筛：最普通的筛子 —— 快速简单，筛去大部分 非目标株，尽量保留有潜力的候选株。
1）琼脂板涂布法 筛子： • 以底物或底物类似物为唯一的碳、氮原 ； • 底物的转化或产物的形成在琼脂培养皿上产生的 半透明圈。 • 产物的衍生化或络合：衍生化或络合试剂与产物 的某些功能团形成呈色圈。 • 色原性底物：通过酶催化时颜色的变化,对菌群进 行可视的直接鉴定。 • 指示菌株：对产物能显示某种生理变化，如生长、 或不生长。
2. 酶的寻找
获得新酶的方法
⑴筛选新酶：从自然环境中； ⑵发现现有酶的新活力（非自然）； ⑶利用新的反应条件，如改变反介质，或 新的影响因素（如金属离子）； ⑷酶的改造，主要指利用基因工程技术， 突变酶,定向进化；
⑸人工酶。
脂肪酶的催化混杂性
脂肪酶的催化混杂性
3.酶或产酶微生物的筛选 （1）从商品酶库中筛选 （2）从已知菌种来源和菌种保藏中心筛选 （3）从自然界发现和筛选产酶微生物 （4）从基因库筛选
4%
1)不可培养微生物：指在实验室内,采用常 规培养方法培养不出的微生物。（占全 部微生物的99%）
• 绕开菌种分离、纯化的步骤，应用分子 生物学方法，直接从中寻找有开发价值 的、新的微生物酶基因和新的酶种。
2)嗜极端环境微生物 • 嗜热微生物（250～350℃）； • 嗜冷微生物（-10～0℃）； • 嗜酸微生物（pＨ0）； • 嗜碱微生物(pＨ11)； • 嗜盐微生物[饱和食盐溶液（含盐32%或 5 2mol/Ｌ）]； • 耐有机溶剂微生物
第三章 酶的筛选
一、酶的来源与多样性 可以通过两条途径 1 ．化学合成，包括酶的化学全合成、模拟酶的 化学合成。
2．生物合成，从生物中提制。
少数来自于动植物，多数（ 80% 以上）来源于 微生物；
微生物作wenku.baidu.com酶源的优点：
(1)种类繁多，易筛选：凡是动植物体内有的酶几
乎都能从微生物中找到．并可根据应用特点和
• 缺点：只能模拟目标真实底物。
氧化还原酶活性检测
• 基于NAD(P)H生成的比色法 NAD(P)H在340nm的吸光度可用于检测信号。 间接法：四唑氮蓝（NBT）/吩嗪硫酸甲酯 （PMS）法，在PMS存在下，NAD(P)H与 黄色的 NBT反应，可生成蓝紫色甲臜 （formazan），吸收波长：580nm。
水解释放黄色对 硝基苯酚或苯胺 对硝基苯糖苷 水解酶活性检测中最常用的色原性底物-对硝 基苯基衍生物 脂肪酶—对硝基苯酯 蛋白酶—对硝基苯酰胺 糖苷酶—对硝基苯糖苷
其他常用的发光底物 • 试卤灵（resorufin）,1-萘酚衍生物。 • 荧光底物-伞形酮（umbelliferone）作为内置 荧光团的衍生物
• 细胞通过高速流动系统, 排成单行,逐个流经 检测区进行。
• 复筛：特定筛 —— 慢、精确。使用准确的 定量分析方法，确定反应速率、选择性等。 （液、气相色谱、分光光度法等）
• 毛细管电泳法，质谱法，红外热成像法，酶法检 测，酶联免疫等多种现代分析方法逐渐应用于酶
尤其是酶立体选择性的筛选。
5．生产菌的改良 • 诱变、定向突变；代谢调控。
• 重点： 1.产酶微生物筛选的基本流程 2.筛选过程中筛子的设计
• 关注： 酶的分子筛选 1. Genomic Data Mining: An Efficient Way to Find New and Better Enzymes 2. Sequence- and activity-based screening of microbial genomes for novel dehalogenases
二、酶的寻找和发现 1. 反应过程的设计 • 选择合适的合成的反应途径、反应底物 或原料 • 底物：价廉、易合成
• 酶：是否易得、活性、稳定性。
• 资料查阅：是否有已确定的能转化该反应的或相似反
应的酶。
氨基酸生物合成的多条途径
• brenda (http://www.brenda.uni-koeln.de/) • 大量关于酶的信息：包括酶的分类，序列、结 构、功能、特性（稳定性、最佳pH、最佳反应 温度）、底物\产物、催化的反应，代谢途径， 抑制剂、激活剂，辅助因子等 • Ligand 数据库http://www.genome.ad.jp/ligand/ • 包含了化合物（除常规代谢途径的化合物外还 包括其他化合物、如：药物、多糖）、酶、反 应。 • Biocatalysis/biodegradation http://umbbd.ahc.umn.edu • 代谢途径和生物转化，主要包含代谢途径、反 应、化合物、酶。
要求，筛选出最佳的产酶菌株； (2)繁殖快，发酵周期短，培养简便，能通过控制 培养条件大幅度提高酶的产量； (3)微生物具有较强的适应能力，可采用各种遗传
变异手段，培育出新的、更理想菌株。
微生物多样性赋予的酶开发的巨大开发潜力
生物 细菌 古细菌 真菌 病毒 已知种类 4760 ＜500 69000 5000 估计总的种 类 800000 ～ 3000000 50000 500000 1500000 130000 ～ 所占百分率 0.2%-0.6% 0.1%-1% 5%
4）从基因库筛选
分子筛选(molecular screening)
基于序列(sequence-based)的筛选。 数据库挖掘（Database mining） 基于序列的同源性，从已知酶基因（蛋 白）出发，搜索数据库。
PCR筛选 • 根据已知酶蛋白，设计兼并引物，PCR克隆 ，表达，活性检测。
过氧化物酶
• ABTS(2,2’-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑 啉-6-磺酸)二铵盐)检测法 ABTS可被过氧化物酶氧化呈浓绿色 • 邻联茴香胺-氧化呈红色。
2） 微孔板悬浮法
• 需有吸光度的变化，可见，或荧光。 3）微珠细胞固定化法 • Freeman等人设计的微珠固定化方法,通过物 理手段使单个细胞附着在单个聚丙烯酰胺 固体。 .4）流式细胞计数法
基于cDNA文库和基因组库的筛选 • 根据已知酶蛋白，设计兼并引物，PCR克隆 (Southern 杂交)，表达，活性检测。
宏基因组（metagenome)法 宏基因组是特定小生境中全部微小生 物遗传物质的总和。 • 土样 — 分离收集 DNA 片断 — 限制酶剪切 — PCR 扩增 — 克隆到载体内 — 转化（大肠杆 菌）—筛选转化株—功能基因—新酶。