实验四 细菌的划线分离与培养

实验四细菌的划线分离与培养

一、实验前要说明的几点问题

点名,查看学生出勤情况。总结上次作业，提出作业中出现的问题并讲解。

二、板书部分

（一）目的要求

1.掌握需氧菌分离培养的基本要领。

2.了解厌氧菌的分离培养原则及方法。

（二）实验内容

1.用普通琼脂平板做一次划线分离培养。

2.用普通肉汤做一管大肠杆菌的移植培养。

3.用普通琼脂斜面做一管金黄葡萄球菌的移植培养。

4.用划线法进行真菌的分离培养（示教）

（三）作业

1.为什么要进行细菌的分离培养

2.进行分离培养应注意哪些事项

3.细菌分离培养的方法有哪些（重点叙述平板划线法）

4.叙述真菌的划线分离方法。

三、实验内容

主要内容有分离培养及目的、注意事项、分离培养的方法、真菌的培养方法、患病动物病料中分离培养、钓菌、移植。

1.什么是分离培养及目的：分离培养是细菌学检验的基本技术之一。分离培养之目的，在于从被检材料中由多种细菌里分离出一种细菌。

2.注意事项：

1）分离培养前应考虑所分离的细菌的特性，选择适合其生长需要的培养基（需氧还是厌氧、营养的要求高还是不高、培养温度等）等。例如：链球菌在普通琼脂不长，要加血清或血液。大肠杆菌和葡萄球菌要求较低，普通的培养基即

可生长。

2）防止污染。分离培养的整个过程要严格无菌操作。培养基和一切用具必须彻底灭菌；操作时必须靠近火焰；操作完毕后，禁止再让培养基接触外界空气。

3）防止接种器械过热，很容易杀死分离培养的细菌，如接种环在烧灼灭菌后，不能立即钓取细菌材料，应在酒精灯旁凉凉；另外还应注意防止已钓取菌料的接种环，不慎通过火焰而将细菌杀死。

4）初代分离时发现有多种细菌，观察找到目的菌落，再拿一肉汤培养基纯化培养。然后在接种实验动物，作成凝集抗原，做血清学鉴定，。还可以反过来做抹片染色观察。

3.分离培养的方法：

主要分需氧菌的分离培养方法、厌氧菌的分离培养方法和需要CO菌的培养分离方法。

1）需氧菌的分离培养法

（1）平板划线法：划线后有单个菌落，便于观察菌落的形态、溶血性等。方法左手拿琼脂平板，使其与水平面成45。角；右手拿铂金耳，使之与水平面平行，靠近酒精灯火焰操作。将接种环于酒精灯火焰中灼烧灭菌，待其冷却后，蘸取欲检材料少许，注意不要划破琼脂，不要划得太疏，以免造成浪费，不要重复划线，以免形成菌苔。划线方法：方格划线、蛇形划线、区域划线、交叉划线，选择其中一种进行划线。划毕，将接种环烧灼灭菌，于皿底用蜡笔标记被检材料名称及日期，倒转置恒温箱中培养。

思考题：方格划线哪个地方会长出单个菌落比较多

（2）倾注法：不常用，这里不做介绍

2）厌氧菌的分离培养方法

厌氧菌生长繁殖的环境不能有游离氧的存在。故在培养厌氧菌时，必须创造一个厌氧环境，一般以降低氧的张力或保持减低的氧张力为原则。目前应用于厌氧菌的分离方法颇多，现就其中较简便且常用的几种方法介绍如下：（1）焦性没食子酸法利用焦性没食子酸在碱性溶液内能大量地吸收氧的

原理进行厌氧培养。通常100cm3空间用焦性没食子酸1g，10%氢氧化钠或氢氧化钾10ml。具体方法有下列有平板培养法、干燥器培养法。平板培养法是将厌氧菌划线接种于适宜的琼脂平板，取一小团直径约2cm的脱脂棉，置于平皿盖的内面中央，其上滴加10%氢氧化钠溶液约5ml；在靠近脱脂棉的一侧放置焦性没食子酸约0.5g,注意暂勿使两者接触，立即将已接种好的平板覆盖于平皿盖上，迅速用融化的石蜡密封平皿边缘周围。封毕，轻轻摇动平皿，使被氢氧化钠溶液浸湿的脱脂棉与焦性没食子酸接触，然后置37℃恒温箱中培养之。干燥器培养法是于干燥器底部放入氢氧化钠溶液适量，然后再放入2-3个略高于液面的玻璃圆柱（如链霉素小瓶），将适量焦性没食子酸用纸或纱布包好，放置于圆柱上面，使暂勿与氢氧化钠接触，然后放下隔板，将已接种的培养皿或试管置于隔板上，待一切准备好后，将盖盖好密封，并轻轻摇动干燥器，使焦性没食子酸落入氢氧化钠溶液中。

（2）高层琼脂柱摇震培养分离法

取长约15cm，直径约5mm的玻璃棒一支，一端塞以小木塞，另一端塞以棉花塞，高压灭菌备用；加热融化一管适合分离厌氧菌用的琼脂培养基，待冷却至50℃左右，接入少许经适当稀释的待分离的培养物或含菌材料，充分摇震均匀；在琼脂凝固前，迅速以无菌滴管吸取上述已接种的琼脂培养基，注入上述（1）准备好的玻璃管内，置恒温箱中培养。

（3）连二亚硫酸钠法

将已接种的平板或斜面培养基，置于一玻璃干燥器内（预先测出体积），按每1000ml容积称取连二亚硫酸钠（又称保险粉）和无水碳酸钠各4g，并分别研细均匀，临用前混合置于一平皿内，放在培养基上层，然后将盖盖严，用凡士林密封，置37℃恒温箱中培养。

2）二氧化碳培养法

少数细菌如布氏杆菌（牛型），在含有10%二氧化碳的环境下生长良好。要创造这样的环境，常用的方法为烛缸法。将接种的培养基置玻璃干燥器或其他可以密闭的玻璃缸内，于其内点燃一小段蜡烛，加上盖（盖边涂凡士林以防漏气），约

一分钟左右蜡烛熄灭，此时缸内氧气已被耗尽，缸内所含二氧化碳约10%。

注意蜡烛勿太长，而且不宜靠近缸壁，以免因局部玻璃过热而破裂。凡士林不能太多也不能太少，多了盖子滑落，少了则封口不严。

4.真菌的分离培养法（简单介绍）

应用细菌的平板分离法（划线、倾注），能容易而满意地得到真菌的纯培养。

划线法：2-5天长霉菌。

1）取琼脂培养基熔化，冷却至45℃，注入无菌平皿中，每皿15-20ml，作成平板待用。

2）取要分离的材料（如田土、混杂的或污染的真菌培养物、真菌）少许，投入盛无菌水之试管中，摇振，使分离菌悬浮水中。

3）将接种环经火焰灭菌并冷却后，蘸取上述悬浮液，进行平板划线。

4）划线完毕，置温箱中培养2-5天，待形成子实器官后，钓取单个菌落的部分，制片检查。若只有一种菌生长，即得纯种。另外，亦可在放大镜的观察下，用无菌镊子夹取一段待分离的真菌菌丝，直接放在平板上作分离培养，即可获得该种真菌的纯培养。

5.自患病动物病料中分离病原菌方法（简单介绍）

1）琼脂斜面分离法取琼脂斜面三管，用接种环蘸取欲检病料少许（如为脏器，现将表面灼烧后，用灭菌解剖刀切开，以接种环由切面钓取组织），混合于第一管的凝集水中，再做斜面划线；然后取出接种环，不经烧灼，继续在第二管、第三管斜面上作同样的划线。划毕，置温箱中培养。经此法分离培养后，第二管的菌落较第一管为少，第三管的菌落更少，如此较易得到单个菌落，达到纯培养之目的。

2）琼脂平板涂布分离法液体被检病料如血液、腹水等，可用灭菌毛细吸管或吸管吸取，置1-2滴于平板中央，用L形玻棒或玻璃刮铲作均匀涂布。如为脏器病料，可先做成乳剂再行涂布；或取其一小块，用镊子夹住，表面烧烙后，用灭菌刀切开，以其切面直接进行涂布。此法适用于含菌量较少的病料的分离。

3）通过试验动物分离法被检材料中疑有某种病原菌存在，可将病料接种于有