生物药物质量检测技术无菌检查法及其验证

培养基的适用性检查
• 灵敏度检查 ①菌种 • 硫乙醇酸盐流体培养基
金黄色葡萄球菌 生孢梭菌 铜绿假单胞菌 枯草芽孢杆菌
• 改良马丁培养基 白色念珠菌 黑曲霉
培养基的适用性检查
②百度文库种选择的原则
• 代表性、普遍性、易存活、低或非致病性、标准菌株 (或该药品中常见的污染菌)。
• 金黄色葡萄球菌（代表革兰氏阳性菌）、铜绿色假单 胞菌（代表革兰氏阴性菌）、枯草芽孢杆菌（代表药 品中最常见或最易污染的菌）、生孢梭菌（代表厌氧 菌）、白色念珠菌（代表酵母菌）、黑曲霉（代表霉 菌）。
• 使用隔离系统的优点：它能创造一个持续高效的高度无菌空间,保 护产品免受外源性污染，包括操作人员、操作环境及外包装等的 污染，确保操作环境及实验物品表面能达到无菌要求，防止出现 假阳性结果,保证无菌实验结果的可靠性，从而实现一次检出的要 求；保护操作人员免受实验过程中的有害物质带来的污染；放置 隔离器的环境洁净度不需要特殊要求，移动方便等优点 。
培养时间 18-24
24-48 5-7天
培养基的适用性检查
④培养基接种
试验菌
培养基 每管装量 接种管数 接种量 培养时间
金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌 枯草芽孢杆菌 生孢梭菌
硫乙醇酸盐 12 ml
白色念珠球菌 改良马丁培养基 9 ml 黑曲霉
2 支 1 ml 3天
2支
1 ml 5天
※其中硫乙醇酸盐及改良马丁培养基均有 1支不接种作为空白 ※接种量 ＜100cfu（不能多）
• 供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每 张滤膜每次冲洗量为100ml，且冲洗量不超过 1000ml，以避免滤膜上的微生物受损伤。
※应结合实际情况进行验证，以确定培养基 有效期。
培养基的适用性检查
本检查可在供试品的无菌检查前或与供试 品的无菌检查同时进行。 • 无菌性检查
①重要性：培养基无菌不合格将导致实验 的假阳性结果。
②检查：每批培养基随机抽取不少于5支 或5瓶，硫乙醇酸盐流体培养基置3035℃培养，改良马丁培养基置23-28℃ 培养，培养14天，应无菌生长。
HTY无菌隔离系统
无菌检查用培养基的种类及用途
• 硫乙醇酸盐流体培养基--培养好氧菌、 厌氧菌
• 改良马丁培养基--培养真菌及好氧细菌 • 选择性培养基--按硫乙醇酸盐流体培养
基或改良马丁培养基的处方及制法，在 培养基灭菌或使用前加入适量的中和剂 或表面活性剂。
培养基的制备及装量
• 培养基可按处方制备，亦可使用按该处方生产 的符合规定的脱水培养基。
• 规定应定期按《医药工业洁净室（区） 悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》 的现行国家标准进行洁净度的验证。
• 日常检验还需对试验环境进行监控。
无菌检查的设施、环境、人员
• 无菌检查人员必须具备微生物专业知识， 并经过无菌技术的培训。
无菌隔离系统
• 无菌隔离系统是一个不受外界环境影响的、可进行无菌操作的独 立环境系统。
培养基的适用性检查
⑤结果判断
• 空白对照应无菌生长，若加菌的培 养基管均生长良好，判该培养基的 灵敏度检查符合规定。
• 试验同时应做空白对照
培养基说明
• 无菌检验培养基所能支持生长的微生物 是有限的。
• 微生物种类繁多，这些微生物有广泛的 生长要求，如：营养、温度和氧等。
• 无菌检验培养基不可能支持所有微生物 的生长，选择了支持那些最有可能污染 药品和在药品中生长的微生物的营养的 培养基。
• 原理：薄膜过滤法是将供试品通过滤膜，微生物截留 于滤膜上，若有抑菌作用的药品同时使用冲洗液冲洗 滤膜上残留的供试品（如有残留会抑制微生物生长）， 然后，培养滤膜看其是否有微生物生长。
• 选择滤膜材质时应考虑供试品及其溶剂的特性，水溶 性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。 油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。 使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。
无菌检查法概念
• 指用于检查药典要求无菌的药品、医疗 器具、原料、辅料及其他品种是否无菌 的一种方法。
• 若供试品符合无菌检查法的规定，仅表 明了供试品在该检验条件下未发现被微 生物污染。
无菌检查法概念
• 无菌检查是通过目检微生物在培养基中 的生长来判断结果。
• 无菌检验只能给出该批产品受污染的程 度。
• 菌种的要求：不得超过5代。采用适宜的菌种保藏方法 保存，以保证菌种的生物学特性。
• 加菌量:＜100cfu。
培养基的适用性检查
③ 菌液制备
试验菌
培养基
培养温度
金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌 枯草芽孢杆菌
营养肉汤
生孢梭菌
硫乙醇酸盐流体
白色念珠球菌 改良马丁培养基
黑曲霉
改良马丁琼脂斜面
30-35 23-28
供试品的无菌检查法
• 无菌检查法包括直接接种法和薄膜过滤法。只 要供试品性状允许，应优先采用薄膜过滤法。
• 进行供试品无菌检查时，所采用的检查方法和 检验条件应与验证的方法相同。
• 薄膜过滤法可以提高无菌检验的检出率，特别 是抑菌性供试品，采用薄膜过滤法可以有效消 除供试品的抑菌性，提高检出率。
供试品的无菌检查法--直接接种法
• 样品直接移入无菌培养基中。 • 每个容器中培养基的用量应符合接种的供试品
体积不得大于培养基体积的10%。 • 同时硫乙醇酸盐流体培养基每管装量不少于
15ml，改良马丁培养基每管装量不少于10ml。 培养基的用量和高度同方法验证试验。 • 每种培养基接种的管数同供试品的检验数量。
供试品的无菌检查法--薄膜过滤法
• 硫乙醇酸盐流体培养基的装量与容器高度的比 例应符合培养结束后培养基氧化层（粉红色） 不超过培养基深度1/2。供试品接种前，培养 基氧化层颜色不得超过培养基深度的1/5，否 则，须经100℃水浴加热至粉红色消失（不超 过20分钟），迅速冷却，只限加热一次。
培养基的储存
• 制备好的培养基应该保存在2-25℃、避光 的环境，若保存于非密闭容器中，一般在3 周内使用；若保存于密闭容器中，一般可在 1年内使用。
• 无菌检验合格只能说明被测样品无菌， 不能证明整批样品无菌。
无菌检查的设施、环境、人员
• 检查环境应在洁净度10000级下的局部 洁净度100级的单项流空气区域内或隔 离系统中进行，其全过程必须严格遵守 无菌操作。
• 隔离系统按相关的要求进行验证，其内 部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。
无菌检查的设施、环境、人员