化学发光磁酶免疫..

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化学发光免疫分析

糖尿病
Albumin C-peptide Insulin
唐氏筛查
PAPP-A free βHCG HCG＋β AFP
心肌标志
骨标志
肝纤维
CK-MB
ß-Crosslaps
LN
Digoxin
25-(OH) Vit. D
HA
Digitoxin
Intact PTH
PIIINP
Myoglobin
Intact PTH
试剂有效期长有效期可长达1年以上，放射免疫分析由
于放射性同位素的衰变，一般有效期只有一个月，而酶免的底物贮存性差，都无法与化学发光相比，有效期长可以降低使用成本，利于推广应用。
梦想——之以恒、真正为实现纳米科技事业的梦想而奋斗！
3 化学发光免疫分析的优越性
➢ 中国免疫诊断现状
中国
国际（欧美为主）
种类
方法
检测原理
酶联免疫
酶与样本反应，依据颜色变化程度确定结果
免疫化学发光
诊断
将抗原抗体同样本结合，由磁珠捕捉反应物，加入发光促进剂加大反应发光速度与强度，进而诊断
根据镧系元素螯合物发光特点，用时间分辨技术测时间分辨荧光
量荧光，检测波长和时间两个参数进行信号分辨
分子诊断
PCR 基因芯片
DNA高温变成单链，低温互补配对链合成
激发态ν
的中间体。这种激发态中间体，当其回到稳定的基态时，可同时发射出
光子。利用发光信号测量仪器即可测量光量子产额，该光量子产额与样
品中的待测物质的量成正比。由此可以建立标准曲线并计算样品中待测
能量
h.ν
物质的含量。
基态ν0 梦想——之以恒、真正为实现纳米科技事业的梦想而奋斗！

基于化学发光磁酶免疫的HCG检测系统研究

Ａｂｓｒｃ：ＡｎｔａｔＨＣＧｅｅｔｎｙｓｅｂｓｄｏｈｍｉｕｎｓｅｔｍａｎｔｃｅｙ —ｉｋｄｉｄｔｃｉｇｓｔｍａｅｎｃｅｌｍｉｅｃｎｇｅｉｎｚｍｅ－ｎｅｍｍｕｏｓａｓｄ－ｌｎａｓｙｉｅ－ｓｒｂｄｃｅ．Ｔｈｙｓｅｃｕｌｅｅｔｗｅｋｈｍｉｕｍｉｅｃｎｅｓｎｓｔｖｅｙｕｉｇｐｈｔｎ—ｏｕｔｎｅｈｄｗｉｈａｓｅｉｅｓｔｍｏｄｄｔｃａｃｅｌｎｓｅｃｅｉｉｌｓｎｏｏｃｎｉｇｍｔｏｔｐ — ｃａｏｏ‘ ｌｃｒｎｉｅｅｔｏｎｉ．ｎｏｄｒｔｍｐｏｈｅｅｔｒｃｓｏ，ＦｉｌｐｈｔｅｅｔｏｃｄｔｃｉｎｕｔＩｒｅｉｒｖｅｔｅｄｔｃｉｐｅｉｉｎＰＧＡｓｕｓｄｔｏｎｈｏｏｏｎｇｉｅｏｃｕｔｔｅｐｈｔｎ
ｍａｎｅｉｎｚｍｅｌｎｋｅｍｍｕｎｏｓａｇｔｃｅｙ —ｉｄｉａｓｙ
ＷａｇＭｉｉ，Ｌｉｕｔｏ，Ｌｉｐｎ，ＬｏＪｎｉｇ，Ｌｉｕｘｕ，ＣａｎｉｎｘａｕＪｎａｕＲｕｉｇｕｉｐｎｕＣｈｎｉｉＸｉｘａ，
蔽和抗干扰设计，以高速高频的ＦＧＡ器件完成光子计数，实现对ＨＣＰＧ的定量检测。对ＨＧ抗原溶液的检测结果表明，Ｃ检测系统在ＨＧ抗原浓度为００￣６０ｎ／Ｃ．６０ｇｍＬ范围内线性关系良好，相关系数Ｒ０５。对检测系统进行重复性测试，变异＝．１９系数为０６％，重复性较好。该系统具有小型便携、灵敏度高、重复性好等特点，在疾病标志物现场检测领域具有较为广阔．１

化学发光免疫分析

化学发光免疫分析的类型介绍更新：2012-05-16 12:26:51 | 来源：标签：化学发光反应参与的免疫测定分为以下几种类型：（一）化学发光酶免疫测定化学发光酶免疫测定（CLEIA）是采用化学发光剂作为酶反应底物的酶标记免疫测定。

经过酶和发光两级放大，具有很高的灵敏度。

以过氧化物酶为标记酶、以鲁米诺为发光底物、并加入发光增强剂以提高敏感度和发光稳定性。

应用的标记酶也可以为碱性磷酸酶，发光底物为dioxetane磷酸酯，固相载体为磁性微粒医学教|育网搜集整理。

（二）化学发光免疫测定化学发光免疫测定（CLIA），是用化学发光剂直接标记抗原或抗体的一类免疫测定方法。

吖啶酯是较为理想的发光底物，在碱性环境中即可被过氧化氢氧化而发光。

用作标记的化学发光剂应符合以下几个条件：1.能参与化学发光反应。

2.与抗原或抗体偶联后能形成稳定的结合物试剂。

3.偶联后仍保留高的量子效应和反应动力。

4.应不改变或极少改变被标记物的理化特性，特别是免疫活性。

鲁米诺类和吖啶酯类发光剂等均是常用的标记发光剂。

（三）微粒子化学发光免疫分析该免疫分析技术有两种方法：一是小分子抗原物质的测定采用竞争法；二是大分子的抗原物质测定采用双抗体夹心法。

该仪器所用固相磁粉颗粒极微小，其直径仅1.0μm，这样大大增加了包被表面积，增加抗原或抗体的吸附量，使反应速度加快，也使清洗和分离更简便。

其反应基本过程：（1）竞争反应：用过量包被磁颗粒的抗体，与待测的抗原和定量的标记吖啶酯抗原同时加入反应杯温育，其免疫反应的结合形式有两种，一是标记抗原与抗体结合成复合物；二是测定抗原与抗体的结合形式。

（2）双抗体夹心法：标记抗体与被测抗原同时与包被抗体结合成一种反应形式，即包被抗体-测定抗原-发光抗体的复合物。

（四）电化学发光免疫测定电化学发光免疫测定（ECLI）是一种在电极表面由电化学引发的特异性发光反应，包括电化学和化学发光两个部分。

分析中应用的标记物为电化学发光的底物三联吡啶钌或其衍生N-羟基琥珀酰胺（NHS）酯，可通过化学反应与抗体或不同化学结构抗原分子结合，制成标记的抗体或抗原。

磁免疫化学发光

化学发光磁酶免疫（MCEIA）
1.简介：
化学发光磁酶免疫检测法是将化学发光分析法，磁性分离技术以及免疫学方法三者有机结合起来而建立的一种新型快速检测方法。方法中，磁珠表面包被单克隆抗体后可以特异性地与靶物质(如细菌、病毒、细胞和酶等)结合，利用磁性粒子所具有的磁响应性，在外加磁场作用下结合磁珠的靶物质就会被磁场吸附，从而与其它成分分离，达到纯化、富集或消除靶物质的作用。
2.化学发光类型：
闪光型（flash type）：发光时间很短；只有零点几秒到几秒；样品必须立即测量，需要配全自动化的加样及测量仪器辉光型（glow type）：发光时间从几分钟到几十分钟，或几小时至更久；样品的测量可以使用通用型仪器，也可以配有全自动化仪器
化学发光酶免疫 (Chemiluminescence Immunoassay, CLIA)
CEIA
MCEIA
MS
化学发光磁酶免疫（MCEIA）
2.原理：
2.1双抗夹心法（直接法）
化学发光磁酶免疫（MCEIA）
2.2 双抗夹心法（二）
化学发光磁酶免疫（MCEIA）
3.技术路线
半抗原
半抗原
FITC
抗体
抗体
FITC抗体
磁珠包被 FITC抗体 FITC标记抗体酶标记抗体
磁珠包被抗体酶标记抗体
2.相对于微孔板包被，免疫磁珠引入到定量分析方法后其优势在于：
更好的选择性：免疫磁珠有着大的多的活性比表面积，能提供更多的结合位点，可以在溶液中较为均一的分散，易于结合位点充分暴露；更高的灵敏度：免疫磁珠可以利用磁分离器方便地对所形成的复合物富集分离，使得洗涤结果更彻底、干扰物浓度极大降低和靶物质浓度有效富集，进而提高分析方法的信噪比和灵敏度；更快的反应速度：免疫磁珠可均匀分布在样品溶液中，更易于接近靶物质，从而加快抗体与靶物质的结合速度。

磁微粒发光免疫论述

› 提高发光强度、快速达到稳定、持续发光
分析步骤
分配样品, 磁颗粒和试剂
孵育使反应物结合
在磁场中清洗去除未结合物质
加入底物产生信号
孵育, 促使信号的产生
信号检测
磁微粒化学发光
该免疫分析技术有两种方法：一是小分子抗原物质的测定采用竞争法；二是大分子的抗原物质测定采用双抗体夹心法。该仪器所用固相磁粉颗粒极微小，其直径仅1.0μm，这样大大增加了包被表面积，增加抗原或抗体的吸附量，使反应速度加快，也使清洗和分离更简便。
倍爱康磁发光免疫夹心法
免疫反应
分离反应
夹心法
发光反应（磁发光）
显色反应（磁酶免）
竞争法
免疫反应
分离反应
竞争法
发光反应（磁发光）
显色反应（磁酶免）
●磁微粒化学发光—间接法：

待测抗体与荧光素标记的抗原结合，随后加入包被着抗荧光素抗体的磁微粒，通过抗荧光素抗体与荧光素的特异性结合使抗原抗体复合物连接在磁微粒上，在外加磁场中直接沉淀，去上清后清洗沉淀的复合物，加入酶标抗体，形成磁微粒－抗原－抗体－酶标二抗夹心免疫复合物。再次清洗后，加入酶促化学发光底物。底物在酶作用下被催化裂解，形成不稳定的激发态中间体，当激发态中间体回到基态时便发出光子，形成发光反应，通过光量子阅读系统记录光子能量，并通过计算机处理系统将光能量强度在标准曲线上转换为待测抗体的浓度，并报告结果。
磁微粒化学发光免疫分析技术
概念和原理
概念：化学发光免疫分析法与磁性微粒分离技术相结合的一种检测方法原理：磁微粒是指磁性纳米粒子与无机或有机分子结合形成的可均匀分散于一定基液中具有高度稳定性的胶态复合材料。由于磁微粒具有磁响应性，成本低、能耗少和无污染等特点，人们在磁微粒表面或通过磁微粒表面的功能基团（如氨基、羧基、巯基及环氧乙烷等）将酶、抗体、寡核苷酸等生物活性物质进行固定，可进一步用于酶的固定化、靶向药物载体、细胞分选、免疫检测、蛋白与核酸的分离纯化及杂交检测等领域。传统的免疫学检测多以酶标板为固相载体，悬浮性磁微粒作为载体具有较高的比表面积，能够更为充分地与样品反应，加之外加磁场的灵活应用，较之酶标板载体具有更高的灵敏度、更快的检测速度和更好的重复性等优点，目前已被广泛应用于生物及医学检测等领域。

化学发光

化学发光免疫测定（CLIA）技术化学发光免疫测定（Chemiluminesent Immunoassay,CLIA）是免疫测定技术继酶免技术（EIA）、放免技术（RIA）、荧光免疫技术（FIA）和时间分辨荧光免疫技术（TRFIA）之后发展的一项新兴测定技术。

要谈化学发光免疫测定技术就必须先谈化学发光。

化学发光技术是近二、三十年来发展起来的一种测定方式，其利用化学反应释放的自由能激发中间体(常用碱性磷酸酶－金刚烷胺），使其从激发态回到基态，当中间体从激发态回到基态时会释放等能级的光子，对光子进行测定而进行定量分析。

化学发光具有荧光的特异性，同时不需要激发光，就避免了荧光分析中激发光杂散光的影响有很高的灵敏度，并且不象放射分析那样存在强烈的环境污染和健康危害，是一种非常优秀的定量分析方法。

虽然化学发光具备很高的特异性和很小的干扰，但化学分析本身的不特异性，制约了整个方法的使用。

因此，如同RIA、FIA等一样利用免疫反应的特异性和化学发光本身的信号特异性形成了目前所说的化学发光免疫测定（CLIA）技术。

CLIA是一种高度敏感的微量测定技术，凡具有抗原性的物质（包括半抗原）都可以用CLIA测定。

其起步于80年代初，快速发展于90年代，在国外CLIA的应用处于蓬勃发展的阶段,其具备以下特点①高度敏感，极限达10-17－10-19M/L，远高于RIA、EIA，与TRFIA相当但比TRFIA便宜。

②特异性强，重复性好C.V.＜5％。

③测定范围宽，可达7个数量级。

④试剂稳定性好，无污染有效期6－12月。

⑤操作简单，易于自动化。

在对环保很重视的国家，CLIA成了取代RIA的首选方法。

电化学发光分析技术特点最先进的分析原理专利的电化学发光分析技术（ECL）。

ECL是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应。

包括了两个过程。

发光底物二价的三联吡啶钌及反应参与物三丙胺在电极表面失去电子而被氧化。

氧化的三丙胺失去一个H成为强还原剂，将氧化型的三价钌还原成激发态的二价钌，随即释放光子恢复为基态的发光底物。

化学发光免疫分析技术原理及特点对比

化学发光免疫分析技术原理及特点对比一、化学发光免疫分析技术原理自从二十世纪七十年代开创化学发光技术以来，世界各国科学家在这个技术的基础上不断研究发展，以改善此技术在人体医学检验上的应用，通过不懈的努力探索，最终化学发光技术进入临床测试应用，为人类健康检验做出了重要的贡献。

时至今日，化学发光免疫分析作为一种微量物质定量检测技术，已经发展的先进且成熟，在人体疾病筛查和健康检测等方面，有着十分重要的作用。

化学发光免疫分析结合了化学发光反应和免疫学的特点，通过将发光物质或酶标记在抗原或抗体上，抗原或抗体与待测物质发生特异性结合，随后加入氧化剂、化学发光底物或是电压的激发，通过氧化剂氧化发光物质，酶催化发光底物或是发光物质在电压的激发下形成高能的激发态，由于激发态不稳定，再回到基态过程中会以光的形式释放出能量，同时由于待测物浓度与发光强度在一定条件下呈线性定量关系，因此借助仪器检测发光的强度就可以确定待测物的含量。

以测定人绒毛膜促性腺激素(HCG)为例(图)，待测物HCG首先与酶标记的抗体以及发光标记物标记的抗体反应，形成双抗体夹心复合物，随后再加入与含有与发光标记物结合的磁珠，通过磁铁将复合物聚集，最后加入发光底物产生光信号进行定量。

图-人绒毛膜促性腺激素化学发光测定原理二、不同化学发光免疫分析技术特点对比根据标记物的不同，化学发光可大致分为：利用吖啶酯、鲁米诺等进行标记的直接化学发光免疫分析(Chemiluminescence immunoassay，CLIA)、利用如辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶等标记的酶促化学发光免疫分析(Chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA)和利用三联吡啶钌等标记的电化学发光免疫分析(Electrochemiluminescence immunoassay，ECLIA)。

直接化学发光免疫分析发光过程十分快速，在几秒钟之内就可以完成，而酶在一般情况下稳定性较好，如辣根过氧化物酶处于室温下可以在几周内保持稳定，且具有较高的特异性，发光时间较直接化学发光法更长，可以持续几分钟到十几分钟，电化学发光法处于电解池介质中反应因而可以反复使用。

化学发光免疫分析法报告

化学发光免疫分析法概述化学发光是物质在氧化还原过程中发光的现象。

能产生化学发光的物质称为化学发光剂。

化学发光免疫分析法是用化学发光剂包括发光物质或者发光反应催化剂等直接标记抗体或抗原的一类免疫测定方法。

将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应结合起来，藉以检测抗原或抗体的分析技术。

将发光物质或酶标记在抗原或抗体上，免疫反应后，通过化学发光反应来测定发光标记物或酶标记物的化学发光信号，从而确定待测抗原或抗体的浓度.化学发光免疫分析（chemiluminescence immunoassay，clia）兴起于20世纪80年代，由于方法成熟，目前已经成为临床免疫诊断的主要方法。

化学免疫分析是将化学发光或生物发光体系与免疫反应相结合，用于检测微量抗原或抗体的一种新型标记免疫测定技术。

临床上所用的化学发光试剂盒包含两个部分，即免疫反应系统和化学发光系统。

免疫反应系统，其基本原理同酶联免疫技术（elisa）。

根据标记物的不同可分为三大类:1.标记酶的化学发光免疫分析，其中应用最多的是三种酶：依据HRP-Luminol-H202-对碘苯酚(PIP)增强型化学发光反应体系进行检测的辣根过氧化物酶(HRP)；能催化AMPPD的分解反应从而产生化学发光进行抗原抗体定量分析的碱性磷酸酶(ALP)；另一种是虫荧光素酶，能催化氧化虫荧光素产生发光而实现对ATP、各种激素、药物以及抗原抗体的定量分析。

2.标记直接化学发光物质的化学发光免疫分析，最典型的是标记氨基异鲁米诺(ABEI)和吖啶酯类的化学发光免疫分析。

3.标记荧光物质，通过过氧化草酸酯化学发光体系进行检测的化学发光免疫分析。

按照标记反应的过程和形成结合物的结构特点，可以将标记分子分为“直接偶联”和“间接偶联”两种方式。

间接偶联可以在原有结构中引进新的活性基，增加反应活性。

下面就鲁米诺、光泽精等几种化学底物发光原理作一简要评述。

1 常见的发光物质1.1 鲁米诺和其衍生物鲁米诺（luminol）和其衍生物是最早在化学发光免疫分析中使用而且被临床较广泛应用的一种常用的化学发光物。

化学发光免疫分析

化学发光免疫分析一、化学发光免疫技术的概念二、化学发光免疫分析基本原理三、化学发光免疫分析的类型四、临床应用五、发展与展望一、化学发光免疫技术的概念化学发光免疫技术：化学发光分析是根据化学反应产生的辐射光的强度来确定物质含量的分析方法。

化学发光免疫分析是将化学发光系统与免疫反应相结合，用化学发光相关的物质标记抗体或抗原，与待测的抗原或抗体反应后，经过分离游离态的化学发光标记物，加入化学发光系统的其它相关物产生化学发光，进行抗原或抗体的定量或定性检测。

化学发光免疫测定是目前世界公认先进的标记免疫测定技术，化学发光免疫分析技术具有高度的准确性和特异性，成为检验方法中最为重要的技术之一。

化学发光免疫分析技术作为疾病诊断的主要手段已被广泛用于机体免疫功能、传染性疾病、内分泌功能、肿瘤标志物、性激素、甲状腺功能等方面的体外诊断实验中。

化学发光免疫分析的优势•灵敏度高灵敏度高是化学发光免疫分析关键的优越性，其灵敏度可达10-22 mol/L （RIA 为10 -12 mol/L ）。

化学发光免疫分析能够检出放射免疫分析和酶联免疫分析等方法无法检出的物质，对疾病的早期诊断具有十分重要的意义。

•宽的线性动力学范围发光强度在4 ～6 个量级之间与测定物质浓度间呈线性关系。

这与显色的酶免疫分析吸光度（OD 值）为2.0 的范围相比，优势明显。

虽然RIA 也有较宽的线性动力学范围，但放射性限制了其应用。

•光信号持续时间长辉光型的CLIA 产生的光信号持续时间可达数小时甚至一天。

简化了实验操作及测量。

•分析方法简便快速绝大多数分析测定均为仅需加入一种试剂（或复合试剂）的一步模式。

•结果稳定、误差小样品系直接自己发光，不需要任何光源照射，免除了各种可能因素（光源稳定性、光散射、光波选择器等）给分析带来的影响，使分析结果灵敏稳定可靠。

•安全性好及使用期长免除了使用放射性物质。

到目前为止，还未发现其危害性；试剂稳定，保存期可达一年。

化学发光免疫分析方法的种类

【化学发光免疫分析种类】
1.直接化学发光
A 吖啶酯发光
原理：纳米磁珠分离后的吖啶酯标记的抗原抗体复合物，在含H2O2的强酸、强碱激发底物的作用下，快速发出可见光，通过光电倍增管进行光子计数，相对光强度RLU与待测抗原浓度成函数关系。

特点：发光过程在5秒内完成，激发发光程序简单，测试速度快，但发光标记物吖啶酯在缓冲液中不稳定，易水解，影响试剂稳定性。

代表仪器：拜耳公司的ACS180。

【化学发光免疫分析种类】
B 异鲁米诺发光
原理：发光过程和原理与吖啶酯完全相同，但激发发光速度更快，在3秒内完成整个过程，测试速度最快，而且克服了吖啶酯在缓冲液不稳定、易水解的缺点。

代表仪器：德国Byk–Sangtec公司的LIAISON
C 电化学发光
原理：纳米磁珠分离后的三联吡啶钌标记的抗原抗体复合物，在三丙胺的作用下，发生氧化还原反应，发出可见光，通过光电倍增管进行光子计数，相对光强度RLU与待测抗原浓度成函数关系。

特点：激发发光过程复杂，时间长，每一个发光过程约需25秒，测试速度慢。

代表仪器：瑞士ROCHE公司的ELECSYS 1010和ELECSYS 2010。

【化学发光免疫分析种类】
•2、酶促化学发光或持久发光
•原理：酶促化学发光一般是将碱性磷酸酶标记在抗体或抗原上，纳米磁珠分离后的碱酶标
记的抗原、抗体复合物在发光底物AMPPD作用下，持续发出可见光，通过光电倍增管读取光信号。

•特点：激发发光时间长，测试速度慢，因为酶易受环境温度的影响，试剂的稳定性不如直接化学发光好。

•代表仪器：美国贝克曼公司的ACCESS，雅培公司的AXSYM。

化学发光免疫分析法-自己整理

化学发光免疫分析法（CLIA）A、管式磁性微粒子化学发光免疫分析法：（竞争法：用标记抗原与待检抗原竞争性结合固相抗体，待检抗原与检测信号成反比）、原理：本实验采用竞争法，酶标抗原与标准品抗原竞争抗体，标准品抗原浓度越大，结合到抗体上的酶标抗原越少，RLU越小，B/B o值越小。

例：A为一种抗原小分子，有免疫反应性。

实验中采用竞争法对尿液中的A进行分析，使待测A、辣根过氧化物酶标记的A（A-HRP在均相体系中与异硫氰酸荧光素（FITQ标记的兔抗A抗体（FITC-A抗体）发生竞争性免疫反应，再加入用羊抗FITC抗体包被的磁微粒，反应生成物结合在磁微粒上，在磁场经分离、洗涤后加发光底物，用冷光分析仪检测发光强度（RLU，测定尿液中A的含量、仪器:Flash ' n glow LB955管全自动进样冷光分析仪（Berthold公司）; 高速离心机（Beckman公司）,转速13000 r/min磁性分离器（北京科美生物技术有限公司定制，磁场强度2800高斯） XW80旋涡混合器（上海精科实业有限公司）试管12 X 60 mm®江拱东医用塑料厂）磁性微粒子（磁性分离剂,Adaltis公司）三、试剂1、A标准品2、A单克隆抗体•0——AFBi-BSA^HRP *：F!TC H AFB I +^4}抗FITCEFITC庐合別比FITCr^t I--r i詩玩FITC AFB1 FrrOAFBt^JMI 时fTC旳舸更片单丸垮序汗士体-F：障羊舍和料TJ5H笛箭♦—厲FR1 AF61^■ —FITC(- 歼ITC一餅3、A-BSA吉合物4、抗FITC抗体包被的磁性微粒子（5mg/mL）5、F ITC标记的A单克隆抗体6 HRP标记的A7、P BST 洗涤液L PBS,含% Tween-20）8、分析缓冲液mol/L的PBS缓冲溶液,pH ,含%BSA %的水解明胶、％的Procli n-300）9、发光底物液（鲁米诺、过氧化氢和对碘苯酚溶液）实验用水为二次蒸馏水四、试剂处理1、用分析缓冲液为稀释液，梯度稀释标准品；2、取A-BSA-HR溶液，以分析缓冲液为稀释液，梯度稀释,配制1:1000、1:2000、1:5000的A-BSA-HRP溶液,4 C保存.FITC-A单克隆抗体溶液的配制：取FITC-A 单克隆抗体溶液，以分析缓冲液为稀释液，梯度稀释，配制1:1000、1:2000、1:5000、1:10000、1:12000的FITC-A单克隆抗体溶液，4 C保存。

化学发光免疫分析技术原理简介(精)

化学发光免疫分析技术原理简介20 世纪60 年代即有人利用化学发光法测定水样中细菌含量和菌尿症患者尿液检查。

1977 年Halman 等将化学发光系统与抗原抗体反应系统相结合，创建了化学发光免疫分析法，保留了化学发光的高度灵敏性，又克服了它特异性不足的缺陷。

近年来对技术与仪器的不断改进，使此技术已成为一种特异，灵敏，准确的自动化的免疫学检测方法。

1996 年推出的电化学发光免疫技术，在反应原理上又具有一些新的特点。

这两种技术目前已在国内一些大型医院实验室用于常规免疫学检验。

一、化学发光免疫分析法化学发光免疫分析法( chemiluminescence immunoassay , CLlA) 是把免疫反应与发光反应结合起来的一种定量分析技术，既具有发光检测的高度灵敏性，又具有免疫分析法的高度特异性。

在CLIA中，主要有两个部分，即免疫反应系统和化学发光系统。

免疫反应系统与放射免疫测定中的抗原抗体反应系统相同化学发光系统则是利用某些化合物如鲁米诺( luminol) 、异鲁米诺(isolu-minol) 、金刚烷( AMPPD) 及吖啶酯( AE) 等经氧化剂氧化或催化剂催化后成为激发态产物，当其回到基态时就会将剩余能量转变为光子，随后利用发光信号测量仪器测量光量子的产额。

将发光物质直接标记于抗原(称为化学发光免疫分析)或抗体上(称为免疫化学发光分析) ，经氧化剂或催化剂的激发后，即可快速稳定的发光，其产生的光量子的强度与所测抗原的浓度可成比例。

亦可将氧化剂(如碱性磷酸酶等)或催化剂标记于抗原或抗体上，当抗原抗体反应结束后分离多余的标记物，再与发光底物反应，其产生的光量子的强度也与待测抗原的浓度成比例。

发光免疫分析的灵敏度高于包括RIA 在内的传统检测方法，检测范围宽，测试时间短，仅需30 - 60min 即可。

试剂货架寿命长，稳定性好，具有大规模自动化测试的功能。

这项技术发展很快，已有许多厂商生产各具特色的测定仪器与配套试剂。

化学发光免疫分析技术

化学发光免疫分析技术化学发光免疫分析技术（Chemiluminescence Immunoassay，CLA）是一种利用化学发光原理检测生物分子的技术。

化学发光是指在一定条件下，某些物质能够通过化学反应，产生电子激发，从而在较高的能级上积累能量，最终能通过放射电磁波而发光的现象。

在CLA中，生物分子（如蛋白质、细胞、激素等）与特异性抗体结合后，通过化学发光原理检测分析生物样本中的目标分子。

CLA技术具有非常高的敏感度、专一性和准确性，被广泛应用于学术研究、临床诊断、环境监测和食品安全等领域。

CLA技术的原理CLA技术主要利用化学发光原理，通过测定分子之间的化学反应发生前后所产生的能量变化以及电子跃迁发光的特性，从而进行分析定量。

其基本原理是：利用亲和层析法、固相抗体法、免疫层析法或酶联免疫吸附法等方法，将特异性的抗体固定在固相载体（如聚苯乙烯微球、硅胶等）上形成抗体-抗原复合物；再将待测样品加入反应体系中，与载体上的抗体结合，形成生物活性复合物；接下来，加入发光底物，在过氧化物酶（POD）或碱性磷酸酶（ALP）的催化下，在化学反应的作用下，引发发光反应，利用光学检测仪器测定发光值，并与标准品进行比较，计算出待测样品中抗原的浓度。

CLA技术的优势CLA技术作为一种高灵敏、高稳定、高特异性的检测方法，具有以下优势：1. 高灵敏度：CLA技术的灵敏度高于其他检测方法，能够检测到极低浓度的生物分子，特别是针对低丰度蛋白质、代谢产物、激素或其他生物标志物，其敏感度更是达到了pg/mL 级别。

2. 高特异性：CLA技术具有极高的特异性，可以区分目标分子和其他非靶分子，降低了假阳性和假阴性的风险，有利于准确判断样本中的目标分子。

3. 高通量：CLA技术可以进行高通量检测，同时检测多个样品，提高了检测效率和样本处理量。

4. 稳定可靠：CLA技术执行简便，无需高端仪器和特殊要求，检测结果稳定可靠，不受样品污染和干扰的影响。

化学发光免疫分析方法.

为85.5％。Magliulo 等［20］建立了牛奶中黄曲霉毒素M1的化学发光酶
免疫分析方法，通过将黄曲霉毒素M牛血清白蛋白包被在聚丙烯板上，
通过酶标二抗在含有鲁米诺的基板上进行检测。该方法的最低检测限为
1 pg/mL，且板间板内数据的变异系数均低于9％，回收率在96％～
122％之间。 Lin 等［21］建立了农产品中黄曲霉毒素B1 的化学发光免疫分析方法。该方法线性检测范围在0.05～10 ng/g 之间，检测灵敏度为0.01 ng/g，板间及板内变异系数分别为12.2％及 10.0％。农产品中样品添加回收率在79.8％～115.4％之间。同时，将建立的分析方法与黄曲霉毒素商品化酶联免疫试剂盒进行了相关性试验，相关系数为
菌素B1 的 ELISA 方法相比，其方法灵敏度提高了10 倍。且通过样品的
添加回收率试验表明其有良好的回收率，其分析结果与ELISA 分析方法
与 HPLC 方法有良好的相关性。
Yang等［17］建立了食品中葡萄球菌肠毒素B（SEB）的碳纳米管的化
学发光免疫分析方法，通过将SEB 抗体吸附在碳纳米管表面，然后将抗
方面报道还有Perschel 等［13］通过化学发光免疫分析对原发性醛固酮
过多症（PHA）进行快速筛选， Tudorache等［14］利用磁颗粒免疫支
持液膜方法（m-ISLMA）检测唾液中的孕酮含量，Iwata 等［15］利用双
夹心化学发光免疫分析方法测定血浆中内皮素－1的含量等。关于这方
面的应用，化学发光免疫分析方法应用的最为广泛，正是在医学检测方
种生物化学领域中最新的超灵敏的碱性磷酸酶底物，其特点是反应速度
快，在很短时间内提供正确可靠的结果。在它的分子结构中有两个重要

化学发光免疫分析的优点

化学发光免疫分析的优点1、灵敏度高：这是CLIA关键的优越性，其灵敏度可达10-16/-21mol/L（RIA为10-12mol/L）。

又如化学发光底物（如AMPPD）可检测出的碱性磷酸酶的浓度比显色底物要灵敏5х105倍。

2．线性范围宽：发光强度在4～6个量级之间与测定物质浓度间呈线性关系。

这与显色的酶免疫分析吸光度（OD值）为2.0的范围相比，优势明显。

也优于放射免疫分析技术。

3、安全性好：彻底消除了放射性危害，环保、安全。

到目前为止，还未发现CLIA的危害性。

4、试剂有效期长有效期可长达1年以上，放射免疫分析由于放射性同位素的衰变，一般有效期只有一个月，而酶免的底物贮存性差，都无法与化学发光相比，有效期长可以降低使用成本，利于推广应用。

5、光信号持续时间长辉光型（glow type）的CLIA产生的光信号持续时间可达数小时甚至一天。

简化了实验操作及测量。

容易实现连续、动态、重复测定6、分析方法简便快速绝大多数分析测定均为仅需加入一种试剂（或复合试剂）的一步模式，容易实现自动化。

7、结果稳定、误差小样品系直接自己发光，不需要任何光源照射，免除了各种可能因素（光源稳定性、光散射、光波选择器等）给分析带来的影响，使分析结果灵敏稳定可靠。

免疫定量分析的两大关键技术:1、标记技术：决定方法的理论灵敏度I125、HRP（luminol)、AKP、AE、ABEI、三联吡啶钌。

2、分离技术：决定方法的实际灵敏度、速度、精密度。

纳米磁性微珠分离非纳米磁性微珠分离技术：塑料微孔板、塑料试管、大塑料球、高分子微球化学发光分类酶促化学发光：HRP（lumino)、AKP★试剂稳定性差★反应速度慢★光信号与温度变化显著相关★综合成本高、发光底物不易保存直接化学发光：AE、ABEI、三联吡啶钌★试剂稳定性好★反应速度快★光信号与温度变化无关★综合成本底、发光底物易保存2.载体的选择：新固相材料的应用新固相材料主要体现在(1)表面有与蛋白结合的官能团，可以充分固定抗体抗原；(2)表面性质要保证不影响结合后蛋白的免疫反应活性；(3)比表面积要足够大以固定足够量蛋白(4)应具有亲水性以避免与待测物和样品基质的非共价结合；(5)在载液的冲击下保持表面的抗体结合活性。

常见化学发光免疫分析技术比较

常见化学发光免疫分析技术比较1、化学发光免疫分析化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay,CLIA），英音:［，kemi，lju：mi’nesəns] ［，imju：nəuə’sei]是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。

是继放免分析、酶免分析、荧光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项最新免疫测定技术。

CLIA是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。

是继放免分析、酶免分析、荧光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项最新免疫测定技术。

1.1、化学发光免疫分析原理化学发光免疫分析包含两个部分, 即免疫反应系统和化学发光分析系统。

化学发光分析系统是利用化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化，形成一个激发态的中间体，当这种激发态中间体回到稳定的基态时，同时发射出光子（hv) , 利用发光信号测量仪器测量光量子产额。

免疫反应系统是将发光物质（在反应剂激发下生成激发态中间体）直接标记在抗原（化学发光免疫分析）或抗体（免疫化学发光分析) 上，或酶作用于发光底物.1。

2、化学发光免疫分析类型化学发光免疫分析法以标记方法的不同而分为两种:（1)化学发光标记免疫分析法；（2）酶标记、以化学发光底物作信号试剂的化学发光酶免疫分析法1。

2.1化学发光标记免疫分析化学发光标记免疫分析又称化学发光免疫分析（CL IA ）, 是用化学发光剂直接标记抗原或抗体的免疫分析方法.常用于标记的化学发光物质有吖啶酯类化合物-acridiniumester (AE) ，是有效的发光标记物,其通过起动发光试剂(NaOH-H2O2）作用而发光，强烈的直接发光在一秒钟内完成，为快速的闪烁发光。

磁微粒化学发光

一、化学发光免疫分析技术概述化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay,CLIA)兴起于上世纪70年代中期，发展至今已经成为一种成熟先进的超微量活性物质检测技术，应用范围十分广泛。

该技术近10年发展迅猛，是目前推广应用最快的免疫分析方法，也是目前最先进的标记免疫测定技术，灵敏度和精确度比酶免法、荧光法高几个数量级。

二、化学发光免疫分析技术原理在化学发光免疫分析中包含两个部分，即免疫反应技术和化学发光技术。

其基本原理是免疫反应中的酶作用于发光底物，使之发生化学反应并释放出大量的能量，产生激发态的中间体。

这种激发态中间体回到稳定的基态时，可同时发射出光子。

利用发光信号测量仪器即可测量出光量子产额，该光量子产额与样品中的待测物质的量成正比，由此可以建立标准曲线并计算样品中待测物质的含量。

化学发光免疫分析技术常采用双抗体夹心法、竞争法及间接法等反应模式，如图1-3所示。

图1.双抗体夹心法图2.竞争法图3.间接法三、磁微粒在免疫学检测中的应用磁微粒是指磁性纳米粒子与无机或有机分子结合形成的可均匀分散于一定基液中具有高度稳定性的胶态复合材料。

由于磁微粒具有磁响应性，成本低、能耗少和无污染等特点，人们在磁微粒表面或通过磁微粒表面的功能基团（如氨基、羧基、巯基及环氧乙烷等）将酶、抗体、寡核苷酸等生物活性物质进行固定，可进一步用于酶的固定化、靶向药物载体、细胞分选、免疫检测、蛋白与核酸的分离纯化及杂交检测等领域。

传统的免疫学检测多以酶标板为固相载体，悬浮性磁微粒作为载体具有较高的比表面积，能够更为充分地与样品反应，加之外加磁场的灵活应用，较之酶标板载体具有更高的灵敏度、更快的检测速度和更好的重复性等优点，目前已被广泛应用于生物及医学检测等领域。

四、磁微粒化学发光免疫分析技术介绍磁微粒化学发光免疫分析技术综合了磁微粒载体技术和化学发光免疫检测技术，使测量结果更准确，更稳定。

●磁微粒化学发光--双抗体夹心法：待测抗原同荧光素标记的抗体及酶标抗体结合形成“三明治”结构的复合物。

磁微粒化学发光酶免疫分析法快速检测血栓4项性能评价

磁微粒化学发光酶免疫分析法快速检测血栓4项性能评价刘艳红;李艳;谢东平;董小瑜【摘要】目的探讨磁微粒化学发光酶免疫分析法检测血栓调节蛋白(TM)、凝血酶-抗凝血酶复合物(TAT)、纤溶酶-α2纤溶酶抑制剂复合物(PIC)和组织型纤溶酶原激活物-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物(t-PAIC)的临床价值.方法采用磁微粒化学发光酶免疫分析法分别检测TM、TAT、t-PAIC和PIC,分析其精密度、携带污染率、正确度、线性检测范围、临床可报告范围、生物参考区间,并按美国临床实验室标准化协会(CLSI)EP系列文件的要求,评价其检测结果 .结果用磁微粒化学发光酶免疫分析法检测血栓4项时,批内、批间精密度[变异系数(CV)]均<10％,携带污染率均<1.0％,线性检测中a值均在1±0.05范围内,决定系数r2均≥0.9500,临床可报告范围、正确度和生物参考区间均符合要求.结论用磁微粒化学发光酶免疫分析法检测血栓4项有较好的临床价值.【期刊名称】《检验医学》【年(卷),期】2019(034)006【总页数】4页(P551-554)【关键词】磁微粒化学发光酶免疫分析法;血栓4项;凝血纤溶早期分子标志物【作者】刘艳红;李艳;谢东平;董小瑜【作者单位】武汉大学人民医院检验科,湖北武汉 430060;武汉大学人民医院检验科,湖北武汉 430060;武汉大学人民医院检验科,湖北武汉 430060;武汉大学人民医院检验科,湖北武汉 430060【正文语种】中文【中图分类】R446.1血栓性疾病是指血栓形成和栓塞2个过程所引起的一系列疾病，为常见病、多发病，其发病率在全球有逐年上升的趋势，早期诊断和积极预防可以降低其发病率和死亡率[1]。

血栓4项包括血栓调节蛋白（thrombomodulin，TM）、凝血酶-抗凝血酶复合物（thrombinantithrombin，TAT）、纤溶酶-α2纤溶酶抑制物复合物（plasmin-α2 plasmin inhibitor complex，PIC）和组织型纤溶酶原激活物-纤溶酶原激活物抑制剂-1 复合物（tissue plasminogen activator-plasminogen activator inhibitor complex，t-PAIC），该4种物质均在凝血、纤溶系统的启动阶段明显升高[2-4]，被认为是血栓性疾病的早期分子标志物，早期、准确的检出对患者早期接受治疗至关重要[5-6]。