细菌病原诊断的一般步骤2011.12

革兰氏染色法的原理： 革兰氏阴性菌的细胞壁含脂类较多，当用95% 酒精脱色时，一方面能把脂类抽提出来，另 一方面细胞壁各层结构变的松弛，在细胞内 形成的染料-碘复合物，被洗脱出来，当再次 染色（复染）时，被染成复染的颜色。 革兰氏阳性菌与之相反，碘复合物被留在菌 体内，不易被洗脱出来，而呈现紫色。
不同的培养条件 需氧条件： 需氧条件：大部分常见致病菌 一般细菌初代培养时有一定浓度的二氧化 碳有利于生长: 碳有利于生长:如鸭疫里氏杆菌需要用烛缸 而分离破伤风梭菌却要在严格的厌氧条件 下进行: 厌氧箱, 下进行: 厌氧箱,表面皿烛封
麦康凯上沙门菌（ 麦康凯上沙门菌（左）和大肠杆菌（右） 和大肠杆菌（
凝集试验
间接凝集试验 (Indirect agglutination) 将可溶性抗原(或抗体)吸附于一种与免疫 无关的、适当大小的载体微粒表面，再与 相应抗体(或可溶性抗原)在适宜条件下相互 作用，经一定时间出现肉眼可见的凝集现 象，这种方法称为间接凝集试验
分子生物学鉴定
（1）PCR ） （2）探针杂交 ） （3）指纹图谱分析 ） （4）多酶电泳 ） （5）蛋白质芯片 ） （6）基因芯片 ） （7）脉冲场电泳。。。。。。。 ）脉冲场电泳。。。。。。。
谢 谢
动物人工感染（ 人一组） 动物人工感染（3人一组） 保定小鼠 每只注射0.1mL 每只注射0.1mL 菌液 做好标记 注意：正确接种小鼠， 注意：正确接种小鼠，以免被咬
1、可伤两肾；2、可造成皮下出血；3、可伤两耳；4、颈 部皮肤厚可抓；5、用手拖住身体。4和5为正确的方法。
第二天： 第二天：发病鼠的观察和解剖
解剖后直接微生物学检查
光镜检查 如器官触片、血涂片等
巴氏杆菌 (P138页) 页
病原分离及纯化
使用不同培养基 一般用血平板 血平板进行细菌的初代分离培养 一般用血平板进行细菌的初代分离培养 对不纯的细菌进行纯化 专用培养基: 专用培养基:
大肠杆菌以麦康凯培养基 鸡白痢沙门氏菌用SS SS琼脂 鸡白痢沙门氏菌用SS琼脂 鸭疫里氏杆菌为TSB 鸭疫里氏杆菌为TSB 猪传染性胸膜肺炎用加NAD的TSB平板或巧克力平板 猪传染性胸膜肺炎用加NAD的TSB平板或巧克力平板 NAD
细菌病原微生物学 诊断的一般步骤
动物医学院 张炜
常见的微生物诊断步骤
临床观察 解剖 解剖后直接微生物 学检查 细菌分离和纯化
细பைடு நூலகம்鉴定
染色 生化分析 血清学鉴定 分子生物学鉴定
剖解前观察
特征性症状有利于作出初步诊断
猪的解剖方法
禽的解剖方法
采 样样品要新鲜 气温较高时,死亡后尽快送样 死亡后尽快送样,不能及时送检 气温较高时 死亡后尽快送样 不能及时送检 的样品应该放于冰箱冻存 采样部位要富含病原 常用部位如心血、 常用部位如心血、肝、脾和脑等
溶血现象
菌落形态
炭疽杆菌的菌落
产气荚膜梭菌菌落
支原体的菌落
污染样品要注意增菌 如用含胆盐的培养基可用于沙门氏菌的增 菌培养， 低温可用于李氏杆菌的培养， 链霉素可用于革兰氏阳性菌的培养。
染色及镜检
单染色法： 单染色法：只用一种染料使细菌着色的方 法。 复染法；用两种以上的不同染料染色， 复染法；用两种以上的不同染料染色，可 显示出部分细菌的结构或区别不同细菌的 染色特性。 染色特性。 特殊染色法： 特殊染色法：是针对细菌某些特殊结构的 染色法。 染色法。
革兰染色结果
油镜下模式图 ×1000
生化分析
吲哚 甲基红 VP 枸橼酸盐利用（西蒙氏） 枸橼酸盐利用（西蒙氏） 葡萄糖产气（ ℃ 葡萄糖产气（37℃） 乳糖 麦芽糖 甘露糖 蔗糖 H2S（TSI） （ ） 尿素酶 动力 苯丙氨酸脱氨酶 赖氨酸脱羧酶 鸟氨酸脱羧酶 精氨酸双水解酶 明胶液化（ ℃ 明胶液化（22℃）……..
SrDNA
筛选需要扩增的基因
看家基因 毒力因子基因
引物设计
PCR扩增 PCR扩增 电泳, 电泳,测序鉴定
PCR技术 PCR技术 在细菌检 测的基本 流程
操作内容： 操作内容：细菌病 原微生物学诊断
第一天：培养基的制备和动物人工感染 第一天：
第二天：发病动物解剖、 第二天：发病动物解剖、病原直接观察 及细菌分离培养
KCN抵抗力 抵抗力 丙二酸盐利用 水杨苷 侧金盏花醇 卫矛醇 间肌醇 D山梨醇 山梨醇 L阿拉伯糖 阿拉伯糖 棉籽糖 L鼠李糖 鼠李糖 D木糖 木糖 海藻糖 七叶苷水解 粘液酸盐 氧化酶…….. 氧化酶
更新生化分析方法
血清学鉴定
（1）凝集实验 ） （2）沉淀实验 ） （3）免疫标记技术 ）免疫标记技术:ELISA,荧光抗体 荧光抗体 （4）中和实验 ） （5）补体结合实验 ） （6）免疫层析试纸条 ）
干燥及固定： 干燥及固定： 涂片置室温自然干燥，必要时可将标本面 涂片置室温自然干燥， 朝上，放在离火焰较高处微微烘干， 朝上，放在离火焰较高处微微烘干，但切 勿在火焰上直烤 过火后，可用手背试温， 过火后，可用手背试温，以微烫为准
初染: 结晶紫染色液 2分钟 染色液, 1 初染: 结晶紫染色液, 2分钟 媒染: 革兰氏碘液, 2分钟 2 媒染: 革兰氏碘液, 2分钟 脱色: 95%酒精 30秒 酒精, 3 脱色: 95%酒精, 30秒 复染: 番红染色液, 30秒 4 复染: 番红染色液, 30秒
Structure of a Gram-Negative Cell Wall
Structure of a Gram-Positive Cell Wall
细菌涂片标本的制作
涂片： 涂片： 液体培养物： 液体培养物：取一环菌液轻轻涂抹在玻片 制成直径约1cm大小薄层，然后将接 大小薄层， 上，制成直径约 大小薄层 种环灭菌 平板培养物：先滴一滴水到玻片上， 平板培养物：先滴一滴水到玻片上，挑取 单菌落细菌涂抹在玻片上， 单菌落细菌涂抹在玻片上，然后将接种环 灭菌
凝集实验
凝集试验 颗粒性抗原的悬液与含有相应的特异性抗体的血 清混合，在一定条件下，抗原与抗体结合，凝集 在一起，形成肉眼可见的凝集物，这种现象称为 凝集（agglutination） 将血清连续稀释（一般用倍比稀释）后，加定量 的抗原；测抗原含量时，将抗原连续稀释后加定 量的抗体。抗原抗体反应时，出现明显反应终点 的抗血清或抗原制剂的最高稀释度称为效价或滴 度（titer）。
处死发病鼠， 处死发病鼠，并固定在解剖台上 解剖，剪取肝脏制作触片， 解剖，剪取肝脏制作触片，并染色 取心血和肝脏，进行平板（ 取心血和肝脏，进行平板（分2区）划线
第三天： 第三天：细菌的鉴定
取平板上的菌落进行染色， 取平板上的菌落进行染色，并用油镜观察 取疑似菌落进行PCR扩增，结果用凝胶电 扩增， 取疑似菌落进行 扩增 泳进行观察
第三天：细菌的纯化及鉴定:染色及 第三天：细菌的纯化及鉴定 染色及 PCR等 等
第一天： 第一天：培养基的制备和动物人工感染 培养基的制备： 培养基的制备：
按说明书要求配制TSB液体培养基 按说明书要求配制TSB液体培养基 TSB 溶解后加入1.5%琼脂粉。 1.5%琼脂粉 溶解后加入1.5%琼脂粉。 高压灭菌，并加入NAD NAD； 高压灭菌，并加入NAD；并制备平板