细胞总蛋白提取方法

细胞总蛋白提取方法

一、溶液配制

1.100mM NaF (NaF MW=41.99) 10ml

称取NaF 41.99mg，超纯水8ml溶解后定容至10ml。

2.100 mM PMSF

3.RIPA溶液100ml

成分分子量终浓度

Tris 121.14 0.6 g 5.0 mM (pH 7.4)

NaCl 58.44 0.87 g 150 mM

EDTA 372.24 37.22 mg 1 mM

NP-40 1 ml 1%

SDS 0.1 g 0.1% 脱氧胆酸钠0.5 g 0.5% 溶解于80 ml超纯水中，待溶解后加入HCl调pH值至7.4，定容至100 ml。

※使用前加入

成分储存浓度加入量终浓度

PMSF 100 mM 10μl/1ml 1 mM

NaF 100 mM 10μl/1ml 1 mM Aprotinin 10μg/μl0.2μl/1ml 2μg/μl

Leupetin 10μg/μl0.2μl/1ml 2μg/μl

二、方法

1.细胞收取

1)细胞传代至60mm培养皿中，待细胞融合约100%，收集细胞

2)弃培养基，加入PBS 2ml清洗培养皿一次，弃PBS。

3)加入0.05%胰酶2ml，37℃温育1min。

4)待细胞变形后，将细胞吹下转移至一个1.5ml

ependorf 管中，10,000rpm×3min，4℃

5)弃上清，1ml预冷的PBS清洗沉淀，10,000rpm×3min，4℃

6)重复PBS清洗一次

7)弃上清，-80℃冻存待裂解

2.蛋白提取

1)向细胞沉淀中加入200μl RIPA缓冲液(含1mM PMS

1mM NaF、2μg/ml Aprotinin、2μg/ml Leupetin)

后冰上放置40mins

10,000rpm×15min，4℃

将上清转移至一个新的ependorf 管中（约250μl）

三、注意事项

1、低温可避免蛋白降解，所有离心管需预冷。

2、PBS要吸干，但避免细胞干掉，以免使蛋白浓度过低。

3、整个蛋白提取过程要快，这能保证干预的效果。