第9章 酶免疫试验
【医学PPT课件】酶免疫测定技术
4. 酶结合物的制备： ⑴ 戊二醛交联法 ⑵ 过碘酸盐氧化法
二、反应条件的选择 1. 酶标二抗浓度：100ug/L IgG，加稀释的酶标
二抗，取OD=0.8者。 2. 包被Ag或Ab浓度：棋盘滴定法 3. 3. 温度、时间等
4. 三、操作标准化 5. 1 加样 6. 2 保温 7. 3 洗涤 8. 4 比色 9.
五. ELISA出现“一片黄”的原因： ⑴酶结合物浓度过高 ⑵底物不新鲜 ⑶洗涤不干净 六.ELISA出现“一片白”的原因： ⑴载体吸附性能差 ⑵底物错 ⑶稀释液作包被液 ⑷加错试剂 ⑸包被时间过短 ⑹酶活力低或下降 ⑺样品含有NaN3。
第三节 酶标记技术的发展
一、斑点ELISA 二、免疫印迹法 三、重组免疫结合试验 四、亲和素-生物素系统
二、反应条件的选择 ㈠ 酶标二抗浓度选择 ㈡ 包被抗原浓度的选择
三、操作标准化
一、试剂制备：
㈠ 免疫吸附剂
1. 固相载体
2. ⑴ 要求：① 吸附力强
3.
② 能保持Ag或Ab活性
4.
③ 不参与化学反应
5. ⑵ 载体性能比较
6. ① 载体材料：+、- 结果差别大
7. ② ELISA板：10ug/L IgG包被,加酶标抗IgG， 显色后，测20孔的OD，要求CV<10%。
底增 加。 5. 标本用NaN3防腐，可出现假“-”。
试剂的准备：
注意不同地区冬、夏温差，可造成达到 37℃的时间差异，对弱阳性结果有很大 影响。
加样：
总体积约360ul，包被和封闭均为100ul， 未封闭部分可吸附非特异蛋白
温育：
1 4℃过夜最佳， 37℃2h较好， 2 43℃20min可造成弱“+”假“-” 3 2 水浴较温箱等空气浴均匀
酶免疫试验教案
酶免疫试验教案教案名称：酶免疫试验教案教案目标：1. 了解酶免疫试验的基本原理和应用领域。
2. 掌握酶免疫试验的实验步骤和操作技巧。
3. 培养学生的实验设计和数据分析能力。
4. 培养学生的团队合作和沟通能力。
教学时间：2课时教学资源：1. 实验室设备：酶标仪、洗板机、显微镜等。
2. 实验材料：酶免疫试验盒、标准品、样本等。
3. 实验记录表格、实验报告模板。
教学步骤：引入（10分钟）：1. 引导学生回顾酶的基本概念和作用。
2. 提问：你们知道什么是免疫试验吗？它有什么应用领域？3. 介绍酶免疫试验的基本原理和应用领域。
实验准备（10分钟）：1. 分组讨论：学生分成小组，讨论实验所需材料和设备的准备工作。
2. 教师指导：教师根据学生讨论的结果，引导他们列出实验所需材料和设备清单，并进行检查。
实验操作（40分钟）：1. 实验操作演示：教师进行酶免疫试验的实验操作演示，强调操作步骤和注意事项。
2. 学生操作实验：学生根据教师的演示，分组进行实验操作。
教师在实验过程中进行指导和监督。
3. 学生合作：学生在小组内相互合作，共同完成实验操作。
数据分析（20分钟）：1. 数据记录：学生记录实验数据，并填写实验记录表格。
2. 数据分析：学生根据实验数据，进行数据分析和结果判断。
3. 讨论与总结：学生在小组内讨论实验结果，并进行总结和归纳。
实验报告（20分钟）：1. 实验报告撰写：学生根据实验记录和数据分析，撰写实验报告。
2. 实验报告评价：教师对学生的实验报告进行评价和指导。
作业布置：1. 作业要求：学生根据实验报告，撰写实验心得和体会。
2. 作业提交：学生将作业提交给教师。
教学反思：1. 教学效果评价：教师对学生的实验操作、数据分析和实验报告进行评价。
2. 教学反思：教师对本次教学进行总结和反思，为后续教学改进提供参考。
教学扩展：1. 拓展实验：学生可以选择其他酶免疫试验的应用领域进行拓展实验。
2. 学术研究：学生可以进行相关学术研究，了解最新的酶免疫试验技术和应用。
酶免疫测定技术PPT课件
检测食品中的微生物：制备单克隆抗体分析食品中伤寒沙门氏菌，结果准确 可靠，比常规方法缩短了 3~4ｄ，而且与其它沙门氏菌交叉反应率很低，与 金黄色葡萄球菌、大肠杆菌无交叉反应。
ELISA广泛应用于内分泌、血液、肿瘤、传染病、免疫化学等方面， 例如：用于检测雌性激素、胰岛素等，检查凝血因子、红细胞抗原等； 用于检查甲胎蛋白，其敏感性已达到放射免疫试验相当的水平。
ELISA在抗体检测中优势突出，尤其对病毒检测明显优于常规检测方 法。例如：对流感病毒、腮腺炎病毒、脑炎病毒、狂犬病毒和脊髓灰 质炎病毒等的检测。同时用作自身免疫病抗体测定以及对过敏的诊断， 例如检测过敏原的抗体。
编辑版ppt
18
一、治疗药物监测一药物血浓度测定 有地高辛、奎尼丁、利多卡因、双异丙、普鲁卡因酞胺、
N 一乙酞普鲁卡因酞胺(前者的有活性代谢物)、庆大霉素、 妥布霉素、丁胺卡那霉素、乙基西梭霉素、氨甲喋吟等。 二、药物滥用的尿检验— 半定量分析 有苯丙胺、巴比妥类、苯甲二氮草类、大麻类、可卡因、 乙醇、美沙酮、安眠酮、阿片类 、丙氧吩等。半定量分 析是以阴性、低、中等三种浓度的标准品为三点制作一条 标准曲线, 测定样品的光吸收值变化率与标准曲线比较, 可以计算样本中存在的药物与代谢物总量。 三、血清三环类抗抑郁药的定性分析 阿米替林、去甲替林、丙咪啧、去甲丙咪嗦、氯丙咪嗦、 三甲丙咪嗓、多虑平、普鲁替林等及其4 种代谢物。 定性分析是应用一个一定浓度的标准品作对照, 如样品的 光吸收值变化率超过标准品, 即为阳性;否则算作阴性。据 此可作快速毒物鉴定。 四、血清巴比妥类及苯甲二氮草类的半定量分析 7 种巴比妥类及13 种苯甲二氮草类药物的半定量分析。 测定方法亦系以阴性、低、编辑版中ppt等三种浓度的标准品作对照19 比较, 以测算样本中存在的药物量。
第三版免疫学检验技术第9-13章中级试题及答案
第九章酶免疫技术一、A11、下图所示的为哪一种ELISA技术的反应原理示意图（）。
A、双抗原夹心法B、双位点一步法C、间接法测抗体D、竞争法E、捕获法2、钩状效应是指用ELISA一步法测定标本中待测抗原时，抗原浓度过（），实测值偏（）的现象，极易造成假阴性A、低，高B、高，高C、高，低D、低，低E、高，不变3、ELISA试验中最常用的标记酶是（）。
A、ASTB、HRPC、ACPD、LDHE、ALT4、酶增强免疫测定技术是最早取得实际应用的（）。
A、均相酶免疫测定B、异相酶免疫测定C、固相酶免疫测定D、液相酶免疫测定E、固相-液相酶免疫测定5、利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体的方法，通常称为（）。
A、双抗体夹心法B、双位点一步法C、间接法D、竞争法E、捕获法6、ELISA中最常用的固相载体是（）。
A、聚氯乙烯B、聚苯乙烯C、三聚氧胺D、琼脂糖E、尼龙膜7、均相酶免疫测定不具有的特点是（）。
A、常用于半抗原和小分子的检测B、操作简便，易于自动化C、不易受样品中的内源性酶的干扰D、酶与抗原结合后仍保留酶和抗原的活性E、灵敏度不及异相酶免测定8、酶增强免疫测定技术（EMIT）是一种（）。
A、非均相酶免疫测定技术B、均相酶免疫测定技术C、酶免疫组织化学技术D、酶免疫测定与电泳相结合的技术E、电泳技术9、ELISA板包被后，最常用的封闭物质是（）。
A、人白蛋白B、人球蛋白C、牛血清白蛋白D、牛血清球蛋白E、鼠白蛋白10、可用免疫渗滤试验和免疫层析试验检测的项目没有（）。
A、抗HCV B、HIV C、HCG D、HBsAg E、HAV11、制备抗体酶结合物的方法通常采用（）。
A、戊二醛交联法B、糖原染色法C、免疫印迹法D、酶耦联测定法E、捕获竞争法12、下列不属于ELISA测定方法中所必需的试剂（）。
A、固相的抗原或抗体B、酶标记的抗原或抗体C、酶作用的底物D、戊二醛交联剂E、稀释的血清13、斑点免疫层析试验最常用的载体材料是（）。
酶免疫试验间接法实验报告
酶免疫试验间接法实验报告实验目的：本实验旨在通过酶免疫试验间接法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）来检测特定抗原或抗体的存在，以评估其在生物医学研究或临床诊断中的价值。
实验原理：酶免疫试验间接法是一种常用的免疫分析技术，其基本原理是利用抗原-抗体特异性结合的特性，通过酶标记的抗体与底物反应产生可检测的信号。
在间接法中，首先将待测抗原固定在固相载体上，然后加入特异性的一抗，一抗与抗原结合后，再加入酶标记的二抗，二抗与一抗结合，最后加入底物产生颜色变化，通过光度计测定吸光度，从而间接反映抗原或抗体的含量。
实验材料：1. 固相载体（如96孔板）2. 待测样本3. 特异性一抗4. 酶标记的二抗5. 底物溶液（如OPD）6. 终止液7. 洗涤缓冲液8. 标准品（用于建立标准曲线）9. 酶标仪实验步骤：1. 准备96孔板，将待测样本和不同浓度的标准品分别加入孔中。
2. 加入一抗，室温下孵育1小时。
3. 洗涤孔板，去除未结合的一抗。
4. 加入酶标记的二抗，室温下孵育1小时。
5. 再次洗涤孔板，去除未结合的二抗。
6. 加入底物溶液，使酶催化底物产生颜色变化。
7. 加入终止液，终止反应。
8. 使用酶标仪测定各孔的吸光度。
结果分析：根据标准品的吸光度与浓度建立标准曲线，通过待测样本的吸光度在标准曲线上求得相应的浓度或含量。
通过比较不同样本的吸光度，可以评估抗原或抗体的存在情况。
讨论：本实验中，酶免疫试验间接法显示出良好的特异性和灵敏度，适用于定量或半定量分析。
然而，实验结果可能受到操作条件、试剂质量等多种因素的影响，因此在实验过程中需要严格控制实验条件，以确保结果的准确性和可重复性。
结论：酶免疫试验间接法是一种有效的免疫分析方法，广泛应用于生物医学研究和临床诊断领域。
通过本实验，我们成功地检测了待测样本中的特定抗原或抗体，为进一步的研究和应用提供了可靠的数据支持。
参考文献：[1] Engvall E, Perlmann P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) quantitative assay of immunoglobulin G. Immunochemistry. 1971;8(9):871-874.[2] Voller A, Bartlett A, Bidwell D. Enzyme immunoassays with special reference to ELISA techniques. Journal of General Virology. 1976;33(3):165-169.请注意，以上内容是一个模板，具体的实验报告应根据实际实验数据和结果进行相应的调整和补充。
酶免疫技术—酶联免疫吸附试验(免疫学检验课件)
（二）最适工作浓度的选择
在ELISA测定中应对包被抗原或抗体的浓度和酶标 抗原或抗体的浓度予以选择以达到最佳的测定条件以 间接法测抗体为例
1．酶标抗抗体工作浓度的选择
（1）用100ng/ml人IgG进行包被，洗涤。 （2）将酶标抗人IgG用稀释液作一系列稀释后分别加入已 包被的孔中，温育，洗涤。 （3）加底物显色。加酸终止反应后，读取吸光度（A）值 在1.0时的酶标抗体稀释度，作为酶标抗体的工作浓度。
抗原
E
E
E 底物
捕获法
EE E
E
（+）
EE
（-）
3．注意事项
采用固相捕获法检测IgM类抗体时要注意的 是RF（IgM类）及其它非特异IgM的干扰。RF （IgM类）能与固相抗人μ链抗体结合，并可与 随后加入的酶标抗体（动物IgG）反应，从而导 致假阳性反应。
非特异IgM由于其在第一步温育中， 可与特异IgM竞争与固相抗体结合，所以 会影响测定的灵敏度。因此，使用本法测 IgM，必须对临床样本进行适当稀释。
E
2．技术要点
（1）将特异性抗体包被于固相反应板上，洗涤。 （2）加待检标本,温育，洗涤。 （3）加酶标抗体，洗涤。 （4）加底物，根据颜色反应的程度进行该抗原的
定性或定量。
双抗体夹心法测抗原
EE E EE E
（+）
EE E
（-）
3．注意事项
双抗体夹心法中，应注意类风湿因子(RF) 的干扰。如果待检标本中含有RF，可能产生假 阳性结果。使用抗体的F(ab’)2或Fab片段作为酶 标抗体可消除RF的干扰。
E E
E
（+）
E EE
E EE
（-）
（2）竞争法检测HBeAb：
临床检验技师-临床免疫学和免疫检验(2019)讲义第九章酶免疫技术
第九章酶免疫技术第一节酶免疫技术的特点它是将酶与抗体或抗原结合成酶标记抗体或抗原，在酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应完成后，加入酶的相应底物，通过酶对底物的显色反应，对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析。
一、酶和酶作用底物（一）酶的要求：一个酶蛋白分子每分钟可催化103～104个底物分子转变成有色产物。
用于标记的酶应符合：1.酶的活性要强，催化反应的转化率高，纯度高。
2.易与抗体或抗原偶联，标记后酶活性保持稳定，且不影响标记抗原与抗体的免疫反应性。
3.作用专一性强，酶活性不受样品中其他成分的影响，受检组织或体液中不存在与标记酶相同的内源性酶或抑制物。
用于均相酶免疫测定的酶还要求当抗体与酶标抗原结合后，酶活性可出现抑制或激活。
4.酶催化底物后产生的产物易于判断或测量，方法简单易行、敏感和重复性好。
5.酶、辅助因子及其底物对人体无害，酶的底物易于配制、保存，酶及其底物应价廉易得。
（二）常用的酶1.辣根过氧化物酶（HRP）：目前酶联免疫吸附试验中应用最广泛的标记用酶。
由无色的糖蛋白（主酶）和亚铁血红蛋白（辅基）结合而成的复合物。
辅基是酶活性基团，而主酶则与酶活性无关，HRP的纯度用RZ（HRP分别在403nm和275nm处的吸光度比值）表示，RZ值应大于3.0。
RZ值仅说明血红素基团在HRP中的含量，并非表示HRP制剂的真正纯度，而且RZ值高的HRP并不意味着酶活性也高，RZ值与酶活性无关。
酶活性以单位U表示：即1分钟将1μmol底物转化为产物所需的酶量。
酶变性后，RZ值不变但活性降低，因此使用酶制剂时，酶活性单位比RZ值更为重要。
2.碱性磷酸酶（AP）：大肠杆菌来源的AP分子量80kD，酶作用最适pH为8.0；小牛肠黏膜AP分子量为100kD，最适pH为9.6；后一种AP的活性高于前者。
3.β-半乳糖苷酶（β-Gal）：β-Gal来源于大肠杆菌。
因人血中缺乏此酶，以其制备的酶标志物在测定时不易受到内源性酶的干扰，从而提高特异性，被用于均相酶免疫测定。
简述酶免疫测定操作方法
简述酶免疫测定操作方法酶免疫测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是一种常用的实验方法，用于检测抗原或抗体的存在与否。
以下是一般的酶免疫测定的操作方法：1. 准备工作：根据实验需求，准备样品和试剂。
样品可以是血清、组织液、细胞上清液等，试剂包括酶标记的抗体或抗原、底物、洗涤缓冲液、稀释液等。
2. 酶标记：将酶与抗体（或抗原）进行共偶联，常用的酶包括辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）。
这一步可以通过化学反应或亲和层析法完成。
3. 包被：将待测物（抗原或抗体）吸附在固定在微孔板（通常是多孔聚苯乙烯板）表面的免疫反应单元上，使其成为固相。
通常用于包被的物质有蛋白质A/G，或直接将待测物溶液加入微孔板内。
4. 反应：加入样品或质控品到微孔板中，使之与固定的抗原或抗体发生特异性的结合反应。
然后加入酶标记抗体（或抗原）与待测物形成复合物。
5. 清洗：用洗涤缓冲液洗涤微孔板，以去除非特异性的成分和未结合的酶标记抗体（或抗原）。
6. 显色：加入底物，使其与酶发生化学反应生成可测定的产物，如发色物质。
常用的底物有TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）或pNPP（对硝基苯磷酸）。
7. 停止反应：加入相应的停止液，使反应停止，阻止进一步的颜色发展。
8. 读取结果：使用ELISA读板仪等设备，测定样品中的光密度或发色物质的吸光度。
吸光度数值与待测物的浓度成正比。
以上是一般酶免疫测定的操作方法。
不同的ELISA变种可能有一些差异，例如直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA等。
操作步骤可能也会因实验目的和试剂的差异而有所调整。
第9章酶免疫试验
酶和酶作用底物
常用酶
糖蛋白（主酶） 亚铁血红素（辅基） 主酶与酶活性无关 辅基是酶的活性中心
RZ值与酶活性无关， 酶活性单位比RZ值 更为重要
辣根过氧化物酶（HRP）
RZ值：403nm （辅基）
与275nm（主酶） OD ELISA中应用最为广
值之比
泛的标记用酶
酶和酶作用底物
常用酶 碱性磷酸酶（AP） 菌源性AP
包被有待测细胞因子抗体的微孔板
基
+
分泌相应细胞因子的待测细胞
本
有或无刺激物培养
原 细胞因子被板上的特异性抗体捕获
理
后续的反应如同ELISA
一个斑点代表一个细胞因子分泌细胞，斑点的颜
色深浅程度与细胞分泌的细胞因子量相关
酶联免疫斑点试验(ELISPOT)
第五节 发光酶免疫试验（LEIA）
原理：参与催化某一发光反应的酶来标记抗 体（或抗原），在抗原-抗体反应后加入发光 物，酶催化和分解底物发光，由光检测仪检 测发光强度，最后通过标准曲线计算出被测 物的含量。
4°c过夜 封闭（牛血清白蛋白或小牛血清）
间接包被
亲和素-生物素化抗体（抗原） SPA-抗体（抗原）
间接吸附于固相载体上
三、酶结合物
1.辣根过氧化物酶（HRP） 2.碱性磷酸酶 （ALP) 3.β-半乳糖苷酶 (β-Gal)
四、酶的显色底物与酶促发光底物
常用底物 四甲基联苯胺 TMB
三大经典标记技术 放 荧酶 射 光免 免 免疫 疫 疫技 技 技术 术术
掌握：酶联免疫吸附试验； 熟悉：酶和酶作用底物、固相载体、酶
免疫测定的应用； 了解：酶标记抗体或抗原、酶免疫技术
的分类；
第一节 酶免疫试验的组成要素 第二节 酶免疫试验的分类 第三节 酶联免疫吸附试验 第四节 酶联免疫斑点试验 第五节 发光酶免疫试验 第六节 酶免疫试验的临床应用及常用商品试剂的方法
初级检验士考试(临床免疫学和免疫检验)讲义第九章酶免疫技术
第九章酶免疫技术第一节酶免疫技术的特点第二节酶免疫技术的分类第三节酶联免疫吸附试验第四节酶免疫测定的应用第一节酶免疫技术的特点酶免疫技术是将抗原抗体反应的特异性和酶高效催化反应的专一性相结合的一种免疫检测技术。
它是将酶与抗体或抗原结合成酶标记抗体或抗原，此结合物既保留了抗体或抗原的免疫学活性，同时又保留了酶对底物的催化活性。
在酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应完成后，加入酶的相应底物，通过酶对底物的显色反应，对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析。
它通过利用酶催化底物反应的生物放大作用，提高了抗原抗体反应的敏感性。
一、酶和酶作用底物（一）酶的要求1、酶的活性要强，催化反应的转化率高，纯度高。
2、易与抗体或抗原偶联，标记后酶活性保持稳定，且不影响标记抗原与抗体的免疫反应性。
3、作用专一性强，酶活性不受样品中其他成分的影响，受检组织或体液中不存在与标记酶相同的内源性酶或抑制物。
4、酶催化底物后产生的产物易于判断或测量，方法简单易行、敏感和重复性好。
5、酶、辅助因子及其底物对人体无害，酶的底物易于配制、保存，酶及其底物应价廉易得。
（二）常用的酶1.辣根过氧化物酶（HRP）HRP来源于蔬菜植物辣根中，分子量40kD，是由无色的糖蛋白（主酶）和亚铁血红蛋白（辅基）结合而成的复合物。
辅基是酶活性基团，最大吸收峰在波长403nm处；而主酶则与酶活性无关，最大吸收峰在275nm。
2.碱性磷酸酶（AP）AP是一种磷酸脂水解酶，可以从大肠杆菌或小牛肠黏膜提取，但两种来源的AP理化性质有所不同：菌源性AP分子量80kD，酶作用最适pH为8.0；肠黏膜AP分子量为100kD，最适pH为9.6；后一种AP的活性高于前者。
3.β-半乳糖苷酶（β-Gal）β-Gal来源于大肠杆菌，分子量540kD，最适pH6～8。
因人血中缺乏此酶，以其制备的酶标志物在测定时不易受到内源性酶的干扰，从而提高特异性，被用于均相酶免疫测定中。
酶免疫测定数值
酶免疫测定数值全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：酶免疫测定（enzyme immunoassay，EIA）是一种常用的生化实验技术，通过检测特定反应物与其对应抗体结合产生的酶活性变化来定量测定样品中目标分子的含量。
酶免疫测定广泛应用于医学诊断、生物学研究以及食品安全等领域，已成为一种重要的实验方法。
酶免疫测定的原理是利用酶标记抗体对特定抗原进行检测。
一般来说，酶标记抗体是经过特定处理，将受体稀释剂或胶体金等金属标记在抗体分子上。
在反应过程中，待检样品中的目标分子与抗体结合形成免疫复合物，然后将酶标记抗体加入反应体系中，再次结合形成复合物。
最后通过特定底物的化学反应使得酶生成的产物可定量检测，从而间接测定样品中目标分子的含量。
酶免疫测定技术具有灵敏度高、专一性强、操作简便、快速、重复性好等优点，被广泛用于检测生物体内各种代谢产物、重要生理指标以及各种疾病标志物。
比如：血糖、肝功、肾功能、心肌标志物、感染病原体等的检测。
在疾病的早期诊断、治疗及疗效监测中发挥着重要作用。
酶免疫测定技术的应用范围广泛，具有较强的发展潜力。
目前，美国、欧洲等发达国家已经建立了相对完善的酶免疫测定技术体系，不仅在临床医学领域得到广泛应用，还在食品安全、环境监测、药物检测等方面取得了丰硕的成果。
国内的酶免疫测定技术也在逐步完善和发展中，为我国的医学健康事业做出了积极的贡献。
值得一提的是，随着科技的不断进步和人们对健康的关注程度的提高，酶免疫测定技术也在不断发展和创新，出现了越来越多的新技术和新方法。
如基于原子力显微镜、扩增现象技术等的快速、高灵敏度检测技术，为酶免疫测定技术的发展带来了新的机遇和挑战。
相信随着技术的不断完善和应用的不断推广，酶免疫测定将会在医学领域和其他领域中发挥更加重要的作用。
酶免疫测定数值是通过对待检样品中目标分子的特定反应与酶标记抗体的结合来测定的。
该技术在医学诊断、生物学研究等领域得到了广泛应用，具有重要的意义。
临床免疫学检验-课件-第9章 酶免疫技术1
• 保有酶的催化活性和抗体（或抗原）的活性。 • 结合物有良好的稳定性。 • 标记方法简单、产率高、且重复性好。
制备酶结合物的方法
戊二醛交联法：以双功能交联剂为“桥”，分别 与酶和抗体（抗原）连接而形成结合物。
要求：交联剂至少含有两个可与蛋白质分子通过化 学反应而结合的反应基团。
HRP催化TMB
HRP催化
– 终止反应； –提高显色的稳定性，退色慢！以TMB为例
不加终止液：2小时内反应产物退色，蓝色产物 在450nm有最大吸收峰，但峰值较低
加终止液：反应产物变成黄色，在450nm处具有 最大吸收峰，峰值比蓝色产物峰值高。
–不同显色体系里可能使用的终止液不同（酸或碱）。
– 定义：通过化学反应将酶与抗体或抗原形成结合物 – 作用：酶免疫测定技术的核心组成部分，它的稳定性
决定EIA试剂盒的有效使用日期。
（一）酶标记抗体或抗原的制备 （p50）
• 抗原和抗体的要求：
• 抗原：纯度高，抗原性完整; • 抗体：效价高、亲和力强、特异性强，能批量生产，易于分
离纯化。常用单克隆抗体
碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）： β-半乳糖苷酶（β-galactosidase, β-Gal）
辣根过氧化酶（HRP）
• HRP的性质: • 主酶（糖蛋白）+ 辅基（亚铁血红素）蔬菜作物辣根中含 量很高。 • 最高吸收峰:主酶(275nm)与酶活性无关；辅基(403nm)酶活 性基团
• HRP的纯度： • 纯度数(Reinheit zahl, RZ)表示：A403/A275 • 用于标记的HRP, RZ ≥ 3.0。 • 仅表示辅基在HRP中的含量，RZ越大不意味着酶活性越高， 酶变性后RZ不变但活性降低 。
酶免疫测定法原理
酶免疫测定法原理酶免疫测定法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，简称ELISA）是一种常用的生物化学分析技术，广泛应用于医学、生物学、环境科学等领域。
其原理基于抗原与抗体的特异性结合反应，利用酶的催化作用实现检测与定量分析。
ELISA可以用于检测体液中的蛋白质、病原体、抗体等多种生物分子。
其基本原理是将待检样品中的目标分子与特异性抗体结合，再通过酶标记的二抗或底物与结合复合物发生反应，最后通过酶的催化作用产生显色或荧光信号来定量检测目标物质的含量。
ELISA的基本步骤包括：1. 固相吸附：将特异性抗体固定在微孔板上，形成抗原固定相。
2. 样品加入：待检样品中的目标分子与抗原固定相结合。
3. 清洗：通过洗涤步骤去除非特异性结合物质。
4. 酶标记的二抗或底物加入：酶标记的二抗与结合复合物发生特异性结合，或底物与酶发生催化反应。
5. 清洗：去除未结合的二抗或底物。
6. 显色：加入显色底物使酶催化产生可见的色信号。
7. 反应停止：加入反应停止液终止酶催化反应。
8. 读取结果：使用酶标仪或光度计测量样品中的信号强度，与标准曲线比对得出待测样品中目标物质的浓度。
ELISA技术的优点在于其高灵敏度、高特异性、简单易行、可定量测定等特点。
它可以应用于疾病的早期诊断、药物疗效监测、免疫学研究等方面。
同时，ELISA还可以通过改变实验条件或使用不同的检测标记，实现不同类型的检测，例如酶免疫吸附试验、酶免疫细胞分析等。
然而，ELISA也存在一些局限性。
由于ELISA依赖于抗原与抗体的特异性结合反应，因此需要具备高质量和特异性的抗体。
此外，ELISA的结果受到多种因素的影响，包括温度、洗涤步骤的严格控制、反应时间的控制等。
因此，在进行ELISA实验时，需要严格控制实验条件，保证结果的准确性和可靠性。
酶免疫测定法原理基于抗原与抗体的特异性结合反应和酶的催化作用，通过检测酶催化产物的信号来定量分析待测物质的含量。
第三版免疫学检验技术第章中级试题及答案
第九章酶免疫技术 一、A1 1、下图所示的为哪一种ELISA 技术的反应原理示意图（）。
A 、双抗原夹心法B 、双位点一步法C 、间接法测抗体D 、竞争法E 、捕获法 2、钩状效应是指用ELISA 一步法测定标本中待测抗原时，抗原浓度过（），实测值偏（）的现象，极易造成假阴性A 、低，高B 、高，高C 、高，低D 、低，低E 、高，不变3、ELISA 试验中最常用的标记酶是（）。
A 、AST B 、HRPC 、ACPD 、LDHE 、ALT 4、酶增强免疫测定技术是最早取得实际应用的（）。
A 、均相酶免疫测定B 、异相酶免疫测定C 、固相酶免疫测定D 、液相酶免疫测定E 、固相-液相酶免疫测定 5、利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体的方法，通常称为（）。
A 、双抗体夹心法B 、双位点一步法C 、间接法D 、竞争法E 、捕获法6、ELISA 中最常用的固相载体是（）。
A 、聚氯乙烯B 、聚苯乙烯C 、三聚氧胺D 、琼脂糖E 、尼龙膜 7、均相酶免疫测定不具有的特点是（）。
A 、常用于半抗原和小分子的检测B 、操作简便，易于自动化C 、不易受样品中的内源性酶的干扰D 、酶与抗原结合后仍保留酶和抗原的活性E 、灵敏度不及异相酶免测定 8、酶增强免疫测定技术（EMIT ）是一种（）。
A 、非均相酶免疫测定技术B 、均相酶免疫测定技术C 、酶免疫组织化学技术D 、酶免疫测定与电泳相结合的技术 E 、电泳技术9、ELISA 板包被后，最常用的封闭物质是（）。
A 、人白蛋白B 、人球蛋白C 、牛血清白蛋白 D 、牛血清球蛋白 E 、鼠白蛋白10、可用免疫渗滤试验和免疫层析试验检测的项目没有（）。
A 、抗HCV B 、HIV C 、HCG D 、HBsAg E 、HAV11、制备抗体酶结合物的方法通常采用（）。
A 、戊二醛交联法 B 、糖原染色法 C 、免疫印迹法 D 、酶耦联测定法 E 、捕获竞争法12、下列不属于ELISA 测定方法中所必需的试剂（）。
酶免疫技术
酶标记抗体或抗原
过碘酸钠法（直接法） 过碘酸钠法（直接法） 制备方法
常用于HRP标记抗体或抗原 常用于HRP标记抗体或抗原 HRP
戊二醛交联法
酶标记抗体或抗原
戊二醛交联法
戊二醛分子中有两个相同的醛基， 戊二醛分子中有两个相同的醛基，可分别 HRP和蛋白质分子中的氨基结合 和蛋白质分子中的氨基结合。 与HRP和蛋白质分子中的氨基结合。该法 有一步法和二步法。 有一步法和二步法。二步法标记效率比一 步法高，酶标记物质量较均一。 步法高，酶标记物质量较均一。
酶标记抗体或抗原
纯化及鉴定
标记完成后应除去反应液中的游离酶、 标记完成后应除去反应液中的游离酶、 游离抗体或抗原、 游离抗体或抗原、酶聚合物以及抗体 或抗原聚合物， 或抗原聚合物，避免游离酶增加非特 异显色， 异显色，以及游离抗体或抗原起竞争 作用而降低特异性染色强度
常用的纯化方法： 常用的纯化方法： 葡聚糖凝胶G 200/G-150过柱层析纯化 葡聚糖凝胶G-200/G-150过柱层析纯化 50%饱和硫酸铵沉淀提纯 50%饱和硫酸铵沉淀提纯
竞争法
方法：用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗 方法：用已知抗体包被，加入待测血清， 酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。 原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。加底物显色。 应用：用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（ 应用：用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药
物、激素等） 激素等）
1、已知抗体包 被于载体表面
酶标记抗体或抗原
制备方法要求 抗原要求纯度高，抗原性完整 抗原要求纯度高， 抗体需要特异性好、效价高、 抗体需要特异性好、效价高、亲 合力强以及比活性较高，能批量生 合力强以及比活性较高， 易纯化。 产，易纯化。
临床免疫学和免疫检验第九章 酶免疫技术讲义
第九章酶免疫技术第一节酶免疫技术的特点它是将酶与抗体或抗原结合成酶标记抗体或抗原，在酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应完成后，加入酶的相应底物，通过酶对底物的显色反应，对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析。
一、酶和酶作用底物（一）酶的要求：一个酶蛋白分子每分钟可催化103～104个底物分子转变成有色产物。
用于标记的酶应符合：1.酶的活性要强，催化反应的转化率高，纯度高。
2.易与抗体或抗原偶联，标记后酶活性保持稳定，且不影响标记抗原与抗体的免疫反应性。
3.作用专一性强，酶活性不受样品中其他成分的影响，受检组织或体液中不存在与标记酶相同的内源性酶或抑制物。
用于均相酶免疫测定的酶还要求当抗体与酶标抗原结合后，酶活性可出现抑制或激活。
4.酶催化底物后产生的产物易于判断或测量，方法简单易行、敏感和重复性好。
5.酶、辅助因子及其底物对人体无害，酶的底物易于配制、保存，酶及其底物应价廉易得。
（二）常用的酶1.辣根过氧化物酶（HRP）：目前酶联免疫吸附试验中应用最广泛的标记用酶。
由无色的糖蛋白（主酶）和亚铁血红蛋白（辅基）结合而成的复合物。
辅基是酶活性基团，而主酶则与酶活性无关，HRP的纯度用RZ（HRP分别在403nm和275nm处的吸光度比值）表示，RZ值应大于3.0。
RZ值仅说明血红素基团在HRP中的含量，并非表示HRP制剂的真正纯度，而且RZ值高的HRP并不意味着酶活性也高，RZ值与酶活性无关。
酶活性以单位U表示：即1分钟将1μmol底物转化为产物所需的酶量。
酶变性后，RZ值不变但活性降低，因此使用酶制剂时，酶活性单位比RZ值更为重要。
2.碱性磷酸酶（ALP）：大肠杆菌来源的ALP分子量80kD，酶作用最适pH为8.0；小牛肠黏膜ALP分子量为100kD pH为9.6；后一种ALP的活性高于前者。
3.β-半乳糖苷酶（β-Gal）：β-Gal来源于大肠杆菌，分子量540kD，最适pH6～8。
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酶免疫试验(enzyme immunoassay,EIA) 以酶标记抗体（抗原）作为主要试 剂，将酶高效催化反应的专一性和抗 原抗体反应的特异性相结合的免疫检 测技术。 酶免疫测定技术 酶免疫组织化学技术
酶免疫试验的临床应用
及常用商品试剂的方法特点
（一）均相酶免疫测定主要用于药物和小分子物质 的检测。 （二）异相酶免疫 ELISA用于临床血液及其他体液标志物 ELISPOT监测HIV等疫苗研究免疫应答反应、移植研 究、 Th0/Th1/Th2 细胞转换分析、自身免疫研究、 过敏机制探讨、传染性疾病研究。 （三）发光酶免疫试验用于微量物质的定量检测.
A 抗原特性
B 抗体特性
C 抗原抗体反应后是否需要分离结合和游离酶标记物
D 酶的稳定性
E 载体特性
第三节 酶联免疫吸附试验
一、基本原理
原理 1 3
包被
2
反应加入待测抗 体或抗原和酶标 抗原或抗体
洗涤使结合在 固相上的抗原 抗体复合物与 未结合的分离
4
底物显色 定性或定量 的分析
二、ELISA方法建立的基本步骤
（一）ELISA方法类型的建立 1 初步确定方法类型 2.工作条件的优化
3.ELISA检测结果测定
（二）对建立的方法进行评价
三、方法类型及反应原理 三个必要试剂 固相的抗原或抗体
酶标记物（酶结合物）
酶反应的底物
ELISA检测抗原的方法
双抗体夹心法
方法：用已知抗体包被，加入待检血清， 再加酶标抗体，加底物显色
1、已知抗体包 被于载体表面
1、已知抗体包 被于载体表面
+
竞争法测抗原
-
E
E
E
3、加酶作用 的底物不显色 或显色弱
E
E
E
2、加待检物 抗原与酶标抗 原竞争与抗体 结合
2、加待测物 和酶标抗原， 酶标抗原与抗 体结合
E
E
3、加酶作用 的底物显色
ELISA检测抗体的方法
间接法 方法 用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的 抗人IgG（抗抗体或二抗）加底物显色。 优点 一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体 应用 常测定HCV抗体、HIV抗体和梅毒螺旋体抗体等
HRP的常见底物
2,2′-氨基-二(3-乙基苯并噻唑啉磺酸-6)铵盐 (ABTS)
酶和酶作用底物
HRP的常见底物 OPD反应后显橙黄 色，加酸终止反 应后呈棕黄色， 测定波长492nm。 不稳定，致癌性。 TMB反应后显蓝色 ， 加酸终止反应后变 为黄色,测定波长 450nm ，稳定，无 致癌性，ELISA中应 用最广泛的底物。
β–半乳糖苷酶 （β-Gal）
用于均相酶 免疫测定
酶和酶作用底物
常用底物
HRP的底物 HRP
DH2+H2O2→ → → D+2H2O H2O2为受氢体， HRP对受氢体的专一性很高
供氢体DH2习惯上被称为底物， 底物有多种
酶和酶作用底物
常用底物 四甲基联苯胺 TMB 邻苯二 胺 (OPD) 5-氨基水杨酸 (5-ASA )
4．常用的酶有哪几类？特点？
小 结
酶免疫技术是标记免疫技术的一种，它是以酶标 记的抗原或抗体作为主要试剂的免疫检测方法， 在抗原与抗体的特异性反应完成后，通过酶对底 物的作用进一步提高敏感性。
均相酶免疫测定主要用于小分子激素和半抗原的 测定，异相酶免疫测定根据是否使用固相支持物， 又可分为液相和固相酶免疫测定两种类型。
4°c过夜 封闭（牛血清白蛋白或小牛血清）
间接包被
亲和素-生物素化抗体（抗原） SPA-抗体（抗原）
间接吸附于固相载体上
三、酶结合物
1.辣根过氧化物酶（HRP） 2.碱性磷酸酶 （ALP) 3.β-半乳糖苷酶 (β-Gal)
四、酶的显色底物与酶促发光底物
常用底物 四甲基联苯胺 TMB 邻苯二胺 (OPD) 5-氨基水杨酸 (5-ASA )
酶和酶作用底物
常用酶
糖蛋白（主酶） 亚铁血红素（辅基） 主酶与酶活性无关 辅基是酶的活性中心
RZ值与酶活性无关， 酶活性单位比RZ值 更为重要
辣根过氧化物酶（HRP） RZ值：403nm （辅基） ELISA 中应用最为广 与275nm（主酶） OD 泛的标记用酶 值之比
酶和酶作用底物
常用酶 碱性磷酸酶（AP） 菌源性AP 肠黏膜AP
捕获法 应用：
病原体急性感染诊断中的IgM型抗 体
甲型肝炎HAV-IgM抗体
乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗体
捕获法
原理： 抗人IgMμ链抗体包被
捕获待测标本中IgM类 抗体 加入特异性抗原和酶 标记特异性抗原的抗 体 底物显色
1、固相化抗人 IgM 2、加待测物 特异性IgM与 非特异性IgM 和抗人IgM结合 3、加特异性 抗原，与特异 性抗体结合 4、加酶标抗体 与特异性抗原结 合，加底物显色
HRP的常见底物
2,2′-氨基-二(3-乙基苯并噻唑啉磺酸-6)铵盐 (ABTS)
酶和酶作用底物
HRP的常见底物 OPD反应后显橙黄 色，加酸终止反 应后呈棕黄色， 测定波长492nm。 不稳定，致癌性。 TMB反应后显蓝色 ， 加酸终止反应后变 为黄色,测定波长 450nm ，稳定，无 致癌性，ELISA中应 用最广泛的底物。
液体标本中抗原或 抗体的定性和定量
异相
酶免疫组化 组织切片或其它标 本中抗原的定位
固相酶免疫试验 液相酶免疫试验
一、均相酶免疫试验
用于小分子激素和半抗原（如药 物）的测定 原
理
酶标记物与相应的抗原或抗体结 合后，标记酶的活性会发生改变， 不用分离结合和游离酶标记物，通 过测定标记酶的活性的改变，而确 定抗原或抗体的含量。
D 捕获法ELISA
2 捕获法主要用于何种物质的测定（ ） A IgG D IgD B IgA E IgE C IgM
3 下列关于双抗体夹心法原理，不正确的是（ ）
A 使用分别针对抗原不同决定簇的两种单克隆抗体作 为酶标记物 B 一种单克隆抗体作为固相抗体，另一种作为酶标抗 体 C 可使标本和酶标抗体同时加入成为一步法 D 用于检测二价或二价以上的抗原 E 采用高亲和力的单克隆抗体可提高检测的灵敏度和 特异性
第九章 酶免疫试验
医学技术学院免疫教研室
三大经典标记技术
放 射 免 疫 技 术
荧 光 免 疫 技 术
酶 免 疫 技 术
掌握：酶联免疫吸附试验；
熟悉：酶和酶作用底物、固相载体、酶
免疫测定的应用；
了解：酶标记抗体或抗原、酶免疫技术 的分类；
第一节 酶免疫试验的组成要素
第二节 酶免疫试验的分类
第三节 酶联免疫吸附试验
第一节 酶免疫试验的组成要素
一、固 相 载 体
固相抗体或抗原就是把抗体或抗原 结合到固相载体的表面 固相抗体或抗原是非均相酶免疫 技术中将游离和结合的酶标记物 迅速分离的最常用方法
固相载体
•结合抗体或抗原的容量大
要求
•抗体或抗原牢固地固定在其表面
•不影响免疫反应性 •利于反应充分进行
种类
•固相方法简便易行，快速经济 •微孔板 •磁微粒 •膜载体
标记酶的要求： 1.纯度高,活性强,催化反应效率高。 2.易与抗体或抗原结合标记后酶活 性稳定，不影响抗原抗体反应性。 3.作用专一，且酶活性不受样品其 他成分影响。
标记酶的要求： 4.酶催化底物后产生的产物易于判 断或测量，方法敏感，重复性好，简 单易行。 5.酶、辅助因子及其底物对人体和 环境无害，易于配制、保存，价廉易 得。
应用： 二价或二价以上的较大分子抗 原 测定乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、 HCG等
+
双抗体夹心法测抗原
E
E
E E
E E
E
E
E
-
ELISA检测抗原的方法
竞争法 方法：用已知抗体包被，同时加入待测血清 和酶标抗原，酶标抗原与待检物竞争与包被 物结合。加底物显色。 应用：用于只有一个抗原决定簇的小分子半 抗原（药物、激素等）
E E E E E
1、固相化抗人 IgM
2、加待测物 只有非特异性IgM 和抗人IgM结合
3、加特异性抗 原，不能与非 特异性IgM结合 4、加酶标抗体 无抗原结合， 加底物不显色
+
捕获法原理
-
第三节
习
题
1 下列哪一种ELISA最常用于抗原的测定（ ） A 双抗体夹心法ELISA C 竞争法ELISA B 间接法ELISA E 补体结合法
均相酶免疫测定 最具代表性的两种技术：
酶放大免疫分析技术EMIT enzyme-mutiplied immunoassay technique
克隆酶供体免疫分析 CEDIA cloned enzyme donor immunoassay
酶放大免疫分析技术EMIT示意图
常用酶：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和溶菌酶
原理及特点
抗原抗体反应的特异性
+
酶高效催化反应的专一性
原 理 及 特 点
原理： 酶标抗体（抗原）与抗原（抗体） 的特异性反应 酶对底物的显色反应 对抗原或抗体进行定位、定性或 定量的测定分析
原 理 及 特 点
特点： 灵敏度高、特异性强、准确性好 酶标记试剂能够较长时间保持稳定 操作简便、对环境没有污染。 易与其它技术偶联 衍生出适用范围更广的新方法。
酶放大免疫分析技术EMIT示意图
克隆酶供体免疫分析 （CEDIA）示意图
二、异相酶免疫试验 与均相
不同之处