定磷法测定核酸的含量(精)

定磷法测定核酸的含量

核酸, 含量, 测定

【实验目的】

掌握定磷法测定核酸含量的原理和方法

【实验原理】

核酸分子结构中含有一定比例的磷(RNA含磷量约为8.5%~9.0%，DNA含磷量约为9.2%)，测定其含磷量即可求出核酸的量。

核酸分子中的有机磷经强酸消化后形成无机磷，在酸性条件下,无机磷与钼酸铵结合形成黄色磷钼酸铵沉淀，其反应为：

在还原剂存在的情况下,黄色物质变成蓝黑色,称为钼蓝。在一定浓度范围内，蓝色的深浅与磷含量成正比，可用比色法测定。若样品中尚含有无机磷，需作对照测定，消除无机磷的影响，以提高准确性。

【实验材料】

1.实验器材

恒温水浴,721分光光度计

2.实验试剂

（1）标准磷溶液：将磷酸二氢钾于110℃烘至恒重，准确称取0.8775g溶于少量蒸馏水中，转移至500ml容量瓶中，加入5ml5mol／L硫酸溶液及氯仿数滴，用蒸馏水稀释至刻度。此溶液每1m1含磷400μg，临用时准确稀释20倍(20μg／

m1)。

（2）定磷试剂

①17％硫酸：17m1浓硫酸(相对密度l.84)缓缓加入到83m1水中。

②2.5％钼酸铵溶液：2.5g钼酸铵溶于100ml水。

③10％抗坏血酸溶液：10g抗坏血酸溶于100ml水，并贮存于棕色瓶中，溶液呈淡黄色尚可使用，呈深黄甚至棕色即失效。

临用时将上述三种溶液与水按如下比例混合：溶液(1):溶液(2):溶液(3):水

=1:1:1:2(V:V)

（3）5%氨水,27%硫酸

【实验操作】

1．磷标准曲线的绘制

取干燥试管7支编号，按表所示加入试剂。

试剂管号0123456磷标准溶液，ml0.00.050.10.20.30.40.5蒸馏水，

ml3.02.950.92.80.72.62.5定磷试剂，ml3.03.03.03.03.03.03.0A660加毕摇匀，在45℃水浴中保温10min，冷却，以零号管调零点，于660nm处测吸光度。以磷含量为横坐标，吸光度为纵坐标作图。

2．总磷的测定

称粗核酸0.1g，用少量水溶解(若不溶，可滴加5%氨水至pH7.0)，待全部溶解后，移至50ml容量瓶中，加水至刻度(此溶液含样品2mg/m1)，即配成核酸溶液。

吸取上述核酸溶液1.0ml，置大试管中，加入2.5m127%硫酸及一粒玻璃珠，于通风橱内直火加热至溶液透明(切勿烧干)，表示消化完成。冷却后取下，将消化液移入100ml容量瓶中，以少量蒸馏水洗涤试管两次，洗涤液一并倒入容量瓶，再加蒸溜水至刻度，混匀后吸取3m1溶液置试管中，加3m1定磷试剂，45℃水浴保温10min后取出,测A660。

3．无机磷的测定

吸取核酸溶液1ml，置于100ml容量瓶中，加水至刻度，混匀后吸取3.0ml置试管中，加定磷试剂3.0m1，45℃水浴中保温10min后取出,测A660。

4．结果处理

总磷A660－无机磷A660=有机磷A660

从标准曲线上查出有机磷微克数(X)，按下式计算样品中核酸百分含量

【实验结果讨论】

定磷法即可以测定DNA的含量又可以测定RNA的含量，若DNA中混有RNA或RNA中混有DNA，都会影响结果的准确性。

核酸的定量测定——定磷法

[原理]

磷的测定方法很多，Fiske-Subbarow定磷法是一经典的但至今仍被经常采用的方法，它具有灵敏、简便的特点。各种含磷有机物经硫酸或过氯酸水解，使有机磷消化成为无机磷。无机磷在酸性条件下，与钼酸盐（常用钼酸铵或钼酸钠）反应生成磷钼酸盐络合物。用还原剂处理，磷钼酸盐络合物被还原生成钼蓝，在

660nm处有最大光吸收峰。在一定浓度范围内，颜色的深浅与磷含量成正比关系。因此可应用分光光度法进行磷的定量测定。

化学反应式：

(NH4)2MoO4 + H2SO4 → H2MoO4 + (NH4)2SO4

H3PO4 + 12H2MoO4 → H3P (Mo3O10)4 + 12H2O

还原剂

H3P (Mo3O10)4 → Mo2O3 MoO3

核酸是一类含磷化合物，其分子含有一定比例的磷，一般纯的RNA及其核苷酸含磷质量分数为9.0%；DNA及其核苷酸含磷质量分数为9.2%，即每100g核酸含有9.0～9.2g磷，也就是核酸量是含磷量的11倍左右，故测得磷的量，即可求

得核酸量。这就是定磷法的理论依据，磷的定量测定是测定核酸含量常用手段之一。

生物有机磷材料中有时含有无机磷杂质，故用定磷法来测定该有机磷物质的量时，必须分别测定该样品的总磷量，即样品经过消化以后所测得的含磷量，以及该样品的无机磷含量，即样品未经消化直接测得的含磷量。将总磷量减去无机磷才是该有机磷物质的含磷量。 [方法和步骤] 磷标准曲线的绘制

取试管7支，0～6依次编号。按下表加入各试剂。注意每加好一种试剂后应立即摇匀。

各反应液加毕后，于30℃保温20min，置分光光度计中在波长660nm比色，测光吸收值。以磷含量为横坐标，光吸收值为纵坐标作图，即得定磷标准曲线。 2、总磷量的测定

取30毫升凯氏烧瓶2只，Ⅰ、Ⅱ依次编号，Ⅰ号瓶为空白对照，用刻度吸管准确吸取核糖核酸样液1.0mL，置于Ⅱ号凯氏烧瓶内，Ⅰ号瓶加入蒸馏水1.0mL，不加样液，两瓶分别加入6mol/L硫酸1.0mL置消化架用小火加热消化，待溶液呈褐色，稍加冷却，加入2 mol/L硝酸2滴，再继续加热，直至逸出白色烟雾，溶液无色透明，表示消化完成时为止。待凯氏烧瓶冷却后，分别加入1.0mL蒸馏水，置沸水浴蒸煮5min，使焦磷酸分解。凯氏烧瓶从沸水浴中取出，待其冷却，将Ⅰ和Ⅱ号瓶内的消化液分别移入两只10毫升容量瓶中，用少量蒸馏水洗涤凯氏烧瓶两次，并将洗涤液一并倒入容量瓶内，再各加蒸馏水稀释至刻度。取试管3支，按7～9依次编号，7号管为空白对照。

准确吸取空白对照液1.0mL，置于7号管内，再分别准确吸取Ⅱ号瓶经过消化的核糖核酸样液1.0mL，置于8、9号管内，以下操作与磷标准曲线绘制相同。测出光密度，即可由绘制的标准曲线查得核糖核酸经消化稀释后的总磷量。

3、无机磷的测定

取试管3支，按10～12依次编号，10号管为空白对照。

用刻度吸管分别准确吸取未经消化的核糖核酸液1.0mL，作为无机磷测定样液，置于11、12号管内，空白管以蒸馏水代替RNA液，以下操作与磷标准曲线绘制相同。测出光密度，即可由绘制的标准曲线查得无机磷含量。若溶液浑浊，影响