southern_杂交实验流程

SOUTHERN BLOTTING实验操作流程

A.小麦基因组DNA的提取

1)采集5g鲜嫩的小麦幼苗，将其剪成2cm左右的片段，用液氮冷冻后在研钵中将

其研成粉末（研磨15min左右）。

2)将研磨好的样品转移到预冷的50ml离心管中，加入20ml预热的S buffer，颠

倒混匀。

S Buffer成分

100mM Tris.Cl pH8.5

100mM NaCl

50mM EDTA pH8.0

2％ SDS

3)于65℃水浴锅中温育1-2h，并不时轻柔混匀。

4)加入20ml（等体积的）酚/氯仿，轻柔地颠倒混匀，直至呈乳状（注意：保证混

匀。为有效除去蛋白，此步可以重复）。

5)用水平转子离心机以2000rpm的转速离心20-30min。

6)加入等体积的氯仿，轻柔地颠倒混匀，2000rpm离心20min。

7)转移上清到1个灭菌的50ml离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，颠倒混匀，

室温放置一段时间，用玻璃勾将DNA钩出。

8)用70％的乙醇清洗DNA 2-3次后，将其挑在玻璃钩上晾干，然后溶解在5ml 1×TE

中。

9)待DNA完全溶解后接入10μl RNase，于37℃恒温箱中温育1h。

10)加入等体积的酚/氯仿，轻柔颠倒混匀，以2000rpm的转速离心15min。

11)转移上清至1个灭菌的离心管中，加入等体积的氯仿，混匀，以2000rpm的转

速离心15min。

12)转移上清至1个灭菌的离心管中，加入1/10 体积 3M pH 5.0的乙酸钠（终浓

度为0.3M），混匀后再加入2倍体积95％的乙醇，混匀。

13)用玻璃勾将DNA钩出，然后用70％的乙醇清洗2-3次，晾干后加入1.8-2ml 1×TE

溶解。

14)待DNA完全溶解后，取1μL DNA电泳，检测DNA的浓度和完整性。

15)DNA样品可以放在4℃保存备用。

B.小麦基因组DNA的酶切

1）通常情况下采用下列酶进行谷类作物DNA分析。

识别6碱基序列的酶识别4碱基序列的酶

Apa I Hind III Bam HI Alu I Mbo I Hha I

Sal I Bgl I Sst I Dde I Msp I Taq I

Dra I Pvu II Eco RV Hae III Rsa I Hinf I

Eco RI Xba I

2）如果一次酶切DNA的量在10μg左右，一般采用30μL反应体系。

反应混合液：

DNA 10μg

10 x Buffer 3μL

O y μL

H

2

Enzyme 2μL (ie 2u/ug DNA)

30 μL

3）除Taq I 在65℃消化外，一般在37℃酶切约12h（过夜酶切）。

4）酶切完成后，加入上样缓冲液中止反应（5μL loading buffer/30μL reaction mix）。5）短暂离心后上样电泳。

6）（选择）上样前也可在65℃ 水浴锅中温育1min。

C.琼脂糖凝胶配制

1）经酶切后的基因组DNA一般用比面积大（20×25cm）而厚（8 mm）琼脂糖凝胶电泳（6碱基酶切用产物用 0.8% 琼脂糖凝胶，4碱基酶切产物用1.2% 凝胶，二者都用l×TAE 配制）。

2）向将到1L的三角瓶中加入适量的琼脂糖，然后加入400ml l×TAE，称重、记录下总重量，在微波炉中加热直至琼脂糖完全溶解，称重，用蒸馏水补足蒸发的水分，用铝铂纸或保鲜膜封口，于50℃水浴锅中冷却。

3）用橡皮膏将胶盘两端封住，然后放在水平的实验台上，选择合适的梳子（注意梳齿

数，厚度），将冷却到50℃的凝胶倒到胶盘中。

4）待凝胶完全凝固后，去掉橡皮膏，将琼脂糖凝胶放到水平电泳槽中，加入适量的1×TAE，小心谨慎地拔掉梳子，以免破坏点样孔，影响电泳效果。

5）加入样品，在室温下以25V电压（稳压）电泳过夜。

6）当跑在最前端的溴酚兰指示剂移动到15cm时，终止电泳。

D.电泳结果检测

1）将凝胶转移到加有EB的浅盘中，染色10-15min。

2）用蒸馏水漂洗1-2次。

3）用凝胶成像系统中检测电泳和酶切结果。

E.转膜

将DNA转移到HYBOND-N+尼龙膜上 (AMERSHA)

根据检测结果对凝胶进行修整，用刀片切去点样孔和泳道周围的空白区域。

1）将凝胶转移到盛有0.25N HC1溶液的浅盘中，在水平摇床上轻轻震荡15min（直到凝胶上的蓝色指示剂变为杏黄色）。

2）倒掉HCl，用清水清洗一次，然后加入少量0.4N NaOH以中和过量的HCl。

3）将3张3MM Whatman滤纸（18×27 cm）叠在一起作盐桥，另剪3张3MM滤纸（与尼龙膜大小一致）备用。

4）向一个水平放置的浅盘中加入适量0.4 N NaOH，然后在浅盘上架一块玻璃板，用浅盘中0.4 N NaOH将盐桥浸湿，再将其平铺在玻璃板上（盐桥两端浸在NaOH溶液中），用玻璃棒赶出盐桥（滤纸）下的气泡。

5）将凝胶倒扣在盐桥上（正面向下），用玻璃棒赶出凝胶下的气泡。

6）用0.4 M NaOH 将Hybond-N+尼龙膜浸湿，然后平铺在凝胶上，赶出尼龙膜下的气泡（为防止发生短路，可用保鲜膜将凝胶的周围遮住，防止滤纸或纸塔与盐桥直接接触）。

7）先将1张用0.4 M NaOH浸湿的3MM滤纸 (与尼龙膜大小一致)平铺在尼龙膜上，接着再放上2张同样大小的滤纸。

8）在滤纸上放上纸塔（吸水纸），再在纸塔上放置一个petri-dish，最后在petri-dish 上压一个重约500g重物压，转膜过夜（注意适时补充浅盘中NaOH溶液和更换纸塔）。