8.印迹杂交技术

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southern印迹杂交操作流程

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分子杂交的概念及基本原理

分子杂交的概念及基本原理主要内容：一、分子杂交的概念二、分子杂交基本原理（一）DNA变性：1、DNA变性的方法2、增色效应3、溶解曲线4、融解温度5、影响Tm值的因素。

（二）复性：退火一、分子杂交的概念：分子杂交（molecular hybridization）指具有一定同源序列的两条核酸单链（DNA或RNA），在一定条件下按碱基互补配对原则经过退火处理，形成异质双链的过程。

利用这一原理，就可以使用已知序列的单链核酸片段作为探针，去查找各种不同来源的基因组DNA分子中的同源基因或同源序列。

二、分子杂交基本原理：（一）DNA变性：DNA变性是指双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，形成单链无规则线团，因而发生性质改变（如粘度下降，沉降速度增加，浮力上升，紫外吸收增加等）。

1、DNA变性的方法：1)加热；2)改变DNA溶液的pH；3)有机溶剂（如乙醇、尿素、甲酰胺及丙酰胺等）等理化因素。

2、增色效应：DNA在260nm处有最大吸收值，这一特征是由于含有碱基的缘故。

在DNA双螺旋结构模型中碱基藏于内侧，变性时由于双螺旋解开，于是碱基外露，260nm紫外吸收值因而增加，这一现象称为增色效应（hyperchromic effect）。

利用DNA变性后波长260 nm处紫外吸收的变化可追踪变性过程。

3、溶解曲线：如果升高温度使DNA变性，以温度对紫外吸收作图，可得到一条曲线，称为溶解曲线。

4、融解温度：通常人们把50%DNA分子发生变性的温度称为变性温度（即熔解曲线中点对应的温度），由于这一现象和结晶的融解相类似，故又称融点或融解温度（melting temp erature， Tm）。

因此Tm是指消光值上升到最大消光值一半时的温度。

5、影响Tm值的因素：Tm不是一个固定的数值，它与很多因素有关：1) 部因素：pH、离子强度。

随着溶剂内离子强度上升，Tm值也随着增大。

2) 部因素：DNA的碱基比例、DNA的均一性；在相同条件下，DNA内G-C配对含量高，其T m值也高。

Northern印迹杂交技术

5.酶联免疫染色 5.酶联免疫染色
• 室温，用缓冲液Ⅰ洗膜 1-5 min，缓冲液室温，用缓冲液Ⅰ min， min，再用缓冲液Ⅰ Ⅱ洗膜 30 min，再用缓冲液Ⅰ洗膜 1-5 min。 min。 • 用缓冲液Ⅰ稀释抗体缓冲液（1：2000），用缓冲液Ⅰ稀释抗体缓冲液（ 2000），稀释后的抗体溶液在4℃只能稳定12 h。 4℃只能稳定稀释后的抗体溶液在4℃只能稳定12 h。室温下将膜在抗体稀释液中浸泡30 min。温下将膜在抗体稀释液中浸泡30 min。 • 缓冲液Ⅱ洗膜2次，每次15 min，以除去未缓冲液Ⅱ洗膜2 每次15 min，结合的抗体复合物。再用20 mL缓冲液缓冲液Ⅲ 结合的抗体复合物。再用20 mL缓冲液Ⅲ平衡膜2 min。衡膜2-5 min。
• Northern 杂交是用于RNA定量和定性分析的常用杂交是用于RNA RNA定量和定性分析的常用技术，它是将RNA RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维技术，它是将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，再进行核酸分子杂交的一种实验方法。酸分子杂交的一种实验方法。 • 可以鉴定总RNA或poly(A)+RNA样品中同源RNA的存可以鉴定总RNA RNA或 RNA样品中同源RNA的存样品中同源RNA 在与否、测定样品中特定mRNA分子的大小和丰度， mRNA分子的大小和丰度在与否、测定样品中特定mRNA分子的大小和丰度，是分子生物学中研究基因表达在转录水平上的调节以及cDNA合成的重要手段。节以及cDNA合成的重要手段。 cDNA合成的重要手段
浸泡在 250 ml tris*NaCI 室温、室温、30r/min 30min。。

分子生物学复习题(附答案)

分子生物学复习题（附答案）一、单选题（共100题，每题1分，共100分）1.PCR 反应中延伸的时间取决于A、引物长度B、待扩增片段的长度C、模板的纯度D、Taq DNA 聚合酶的量E、模板的含量正确答案：B2.利用DNA 芯片检测基因突变，杂交条件应：A、短时间内、低盐、高温条件下的高严紧性杂交B、长时间内、低盐、高温条件下的低严紧性杂交C、短时间内、高盐、高温条件下的低严紧性杂交D、短时间内、低盐、低温条件下的高严紧性杂交E、短时间内、低盐、高温条件下的低严紧性杂交正确答案：A3.Northern 印迹杂交可以用于A、快速确定是否存在目的基因B、不仅可以检测 DNA 样品中是否存在某一特定的基因，而且还可以获得基因片段的大小及酶切位点分布的信息C、检测靶分子是 RNAD、用于基因定位分析E、用于阳性菌落的筛选正确答案：C4.利用DNA 芯片检测基因的表达情况，杂交条件应选( )A、高盐浓度、低温和长时间B、低盐浓度、低温和长时间C、高盐浓度、高温和长时间D、高盐浓度、低温和短时间E、高盐浓度、高温和短时间正确答案：A5.GeneXpert 全自动结核杆菌检测技术现可进行哪种药物的耐药检测A、链霉素B、乙胺丁醇D、吡嗪酰胺E、利福平正确答案：E6.第三代测序技术的最主要特征：A、对单分子 DNA 进行非 PCR 的测序B、对 SNP 进行非 PCR 的测序C、高通量和并行 PCR 测序D、直接分析 SNPE、直接进行个体基因组测序和 SNP 研究正确答案：A7.线粒体基因组编码几种rRNAA、22 种B、20 种C、18 种D、3 种E、2 种正确答案：E8.转录依赖扩增系统与其他 PCR 技术的区别是A、模板是 RNAB、模板是 DNAC、引物是 RNAD、模板和产物都是 RNAE、需要热循环正确答案：D9.基因多态性连锁分析中，第一、二、三代遗传标记分别是A、RFLP、SSCP、STRB、RFLP、SNP、STRC、RFLP、STR、SNPD、VNTR、SSCP、SNPE、VNTR、STR、RFLP正确答案：C10.关于分子信标技术的描述，不正确的是A、操作简便C、分子信标设计简单D、背景信号低E、灵敏度高正确答案：C11.作为芯片固相载体的材料描述正确的是A、主要有玻片、硅片等实性材料B、不使用硝酸纤维素膜、尼龙膜及聚丙烯膜等膜性材料C、这些载体材料不需要处理，其表面存在活性基团 (如羟基或者氨基)D、可以直接固定已经合成的寡核苷酸探针E、不需要对介质表面进行化学预处理--活化正确答案：A12.任意引物 PCR 的特点描述错误的是A、需预知靶基因的核苷酸序列B、通过随机引物与模板序列随机互补C、扩增后可直接得到靶基因的多态性指纹图谱D、可用于基因组 DNA 图谱构建E、可用于临床致病菌的流行病学检测、分型正确答案：A13.转录依赖扩增系统的描述错误的是A、以 RNA 为模板B、首先由靶 RNA 合成 DNA 拷贝C、再由DNA 转录生成大量 RNA 拷贝D、产物为 DNAE、为等温扩增正确答案：D14.焦磷酸测序技术不使用的酶是A、DNA 聚合酶 (DNA polymerase)B、DNA 连接酶 (DNA ligase)C、ATP 硫酸化酶 (ATP sulfurylase)D、荧光素酶 (luciferase)E、三磷酸腺苷双磷酸酶 (Apyrase)正确答案：B15.关于 G-C 之间氢键的描述下列正确的是A、G-C 之间有 3 个氢键B、G-C 之间有 2 个氢键C、G-C 之间有 1 个氢键D、G-C 之间有 4 个氢键E、G-C 之间有 5 个氢键正确答案：A16.PCR 反应的基本过程不包括以下：A、预变性B、退火C、探针杂交D、变性E、延伸正确答案：C17.发出临床检验报告前应进行结果审核，审核内容不包括A、室间质量评价是否合格B、临床医生申请的检验项目是否已全部检验C、室内质控是否在控D、检验报告是否正确E、检验结果与临床诊断是否相符正确答案：A18.个体识别所使用的 HLA 分型技术不包括下列哪项 ( )A、PCR-RFLPB、PCR-SSPC、PCR-SSOPD、PCR-指纹图E、FISH正确答案：E19.编码 HIV 衣壳蛋白的是A、tat 基因B、vif 基因C、pol 基因D、gag 基因E、env 基因正确答案：D20.用于基因定位的技术是：A、荧光定量 PCR 技术B、PCR-RFLP 技术C、PCR 微卫星检测技术D、原位杂交技术E、cDNA 表达芯片技术正确答案：D21.核酸分子杂交的基础是A、碱基互补配对B、磷酸化C、配体受体结合D、甲基化E、抗原抗体结合正确答案：A22.基因芯片技术的本质是 ( ) ：A、核酸分子杂交B、蛋白质分子杂交技术C、连接酶链反应D、DNA 重组技术E、酶切技术正确答案：A23.镰状细胞贫血患者，代替其血红蛋白β链 N 端第六个氨基酸残基谷氨酸的是A、丙氨酸B、酪氨酸C、丝氨酸D、缬氨酸E、苯丙氨酸正确答案：D24.目前，个体识别和亲子鉴定主要依靠A、STR 基因座技术B、PCR-SSOC、蛋白质凝胶电泳技术D、PCR-SSCPE、细胞混合培养技术正确答案：A25.指导合成蛋白质的结构基因大多数为：A、中度重复序列B、回文序列C、单拷贝序列D、高度重复序列E、散在核原件正确答案：C26.母亲血浆中的胎儿 DNAA、占母亲血浆总 DNA 的 50%以上B、可用于检测胎儿从母亲遗传而来的线粒体 DNA 突变C、确定RhD 阳性孕妇所怀胎儿的RhD 情况D、确定胎儿是否从母亲遗传了X 连锁的基因突变E、血友病 A 的产前诊断正确答案：C27.引起急性移植排斥反应最重要的抗原是A、ABO 血型抗原B、HLA 抗原C、超抗原D、异嗜性抗原E、Rh 血型抗原正确答案：B28.下列方法中不属于 RNA 诊断的是A、Northern blotB、RNA 斑点杂交C、基因芯片D、mRNA 差异显示 PCR 技术E、逆转录 PCR正确答案：C29.基因芯片技术的优点不包括A、芯片检测稳定性高B、操作简单C、微缩化D、高通量E、观察结果直观正确答案：A30.在核酸检测体系中加入内质控，其作用不是监控的是A、仪器故障如扩增仪孔间温度差异所致的假阴性B、核酸提取效率太低所致的假阴性C、标本中抑制物或干扰物所致的假阴性D、试剂失效或 Taq 酶活性降低所致的假阴性E、样本吸取错误所致的假阴性正确答案：E31.荧光定量 PCR 检测核酸量的时间段在A、非指数期B、PCR 反应的最初阶段C、PCR 反应最后的时间阶段D、指数期的起始阶段E、指数期的终末阶段正确答案：D32.在人类基因组中，编码序列占的比例为A、21%B、3%C、23%D、5%E、1.5%正确答案：E33.下列是 PCR 反应体系中必须存在的成分， ( )除外A、引物B、模板C、dNTPD、Mg2+E、DMSO正确答案：E34.PCR 反应体系的描述错误的是A、模板B、一条引物C、dNTPD、DNA 聚合酶E、缓冲液正确答案：B35.唯一一个在结肠上皮增殖过程中起看门作用的基因是A、MCC 基因B、DCC 基因C、APC 基因D、p53 基因E、HNPCC 基因正确答案：C36.血友病是一种A、先天性代谢缺陷病B、常染色体隐性遗传病C、X 连锁遗传病D、染色体病E、先天畸形正确答案：C37.PCR-ASO 描述错误的是A、需要寡核苷酸探针B、检测点突变的技术C、PCR 产物必须电泳分离D、需正常和异常两种探针E、需严格控制杂交条件正确答案：C38.下列不可以作为核酸探针使用的是A、microRNAB、单链 DNAC、寡核苷酸D、mRNAE、病毒 RNA正确答案：A39.下述序列中，在双链状态下属于完全回文结构的序列是A、AGTCCTGAB、AGTCAGTCC、AGTCGACTD、GACTCTGAE、ACTCGACT正确答案：C40.下列疾病不可进行基因诊断的是A、组织水肿B、SARS 疑似患者C、肿瘤D、艾滋病E、血友病正确答案：A41.下列方法中不能分辨野生型和突变型基因的是A、PCR-SSCPB、变性梯度凝胶电泳C、熔解曲线分析D、逆转录 PCR正确答案：D42.珠蛋白基因的碱基由G 突变为 C 时，造成的突变称为A、密码子缺失或插入B、单个碱基置换C、融合基因D、移码突变E、片段缺失正确答案：B43.决定 PCR 反应特异性的是A、模板B、dNTPC、引物D、缓冲液E、Taq DNA 聚合酶正确答案：C44.第二代测序技术最主要技术特征是A、对单分子 DNA 进行非 PCR 的测序B、针对 SNP 进行非 PCR 的测序C、高通量和并行 PCR 测序D、直接分析 SNPE、直接进行个体基因组测序和 SNP 研究正确答案：C45.关于mtDNA 的描述正确的是A、结构基因编码 mtDNA 复制所需的酶、调控蛋白、NADH 氧化还原酶、ATP 酶等B、重链有编码功能，轻链无编码功能C、含 22 个结构基因D、含 tRNA 基因，可转录 22 种 tRNA，以满足线粒体内蛋白质翻译的需要E、含 rRNA 基因，编码 2 种 rRNA，即 12SrRNA 和 18SrRNA正确答案：D46.SDS 是一种阴离子表面活性剂，其可断开蛋白质分子内和分子间的( )A、氢键B、离子键C、二硫键D、酯键E、疏水键正确答案：A47.下列哪一项 PCR 技术可以检测固定组织的DNA 或RNA：A、反转录 PCRB、单细胞 PCRC、原位 PCRD、巢式 PCRE、荧光 PCR正确答案：C48.采用了所谓酶联级联测序技术的测序方法是A、边合成边测序B、焦磷酸测序C、寡连测序D、化学降解法测序E、双脱氧终止法测序正确答案：B49.原核生物基因组特点不应包括：A、插入序列B、断裂基因C、转录产物为多顺反子D、操纵子结构E、重复序列正确答案：B50.下列哪些技术不适用于鉴定菌种亲缘性：A、随机扩增DNA 多态性分析B、连接酶链反应C、PCR-RFLPD、多位点测序分型E、DNA 测序技术正确答案：B51.下列哪种质粒带有抗性基因A、F 质粒B、Col 质粒C、接合型质粒D、ColEIE、R 质粒正确答案：E52.由于突变使编码密码子形成终止密码，此突变为：A、同义突变B、移码突变C、错义突变D、终止密码突变E、无义突变正确答案：E53.若要采用 Southern 或Northern 印迹方法分析某特定基因及其表达产物，需要A、收集培养细胞的上清液B、收集组织或细胞样品，然后从中提取蛋白质C、利用PCR 技术直接从标本中扩增出待分析的片段D、收集组织或细胞样品，然后从中提取总DNA 或 RNAE、制备固定在支持物上的组织或细胞正确答案：D54.下列说法正确的是A、液状石蜡切片中缩短蛋白酶 K 的消化时间可增加提取 DNA 片段的长度B、组织样本不需蛋白酶 K 消化即可进行核酸提取C、用于提取核酸的石蜡切片需要先用二甲苯脱蜡D、用于提取核酸的石蜡切片不需脱蜡即可进行核酸提取E、新鲜的组织样本需要先用二甲苯脱蜡才能进行核酸提取正确答案：C55.下列关于引物设计的原则中，错误的是A、两条引物的Tm 值相差尽量大B、G+C 的含量应在 45%~55%之间C、尽量避免引物二聚体的出现D、反应体系中引物的浓度一般在0.1~0.2μmol/L 之间E、5’端可加修饰基团正确答案：A56.下列哪种病毒在复制过程中可产生 RNA-DNA 杂交体A、HIVB、HPVC、HBVD、HCVE、流感病毒正确答案：A57.未知突变的检测，下列最准确的方法是A、PCRB、RFLPC、核酸杂交D、序列测定E、ASO正确答案：D58.关于肺炎支原体的实验室检测，正确的是A、体外培养生长缓慢但阳性率很高B、免疫学方法检测的假阳性率较低C、体外培养在支原体感染的早期诊断上具有重要意义D、利用分子生物学方法可以进行流行病学调查和耐药基因分析E、PCR 技术可检测到极微量的 DNA，但特异性不高正确答案：D59.人类可遗传的变异中最简单、最常见的一种是 ( )A、RFLPB、VNTRC、STRD、SNPE、CNV正确答案：D60.Southern 印迹转移的步骤不包括 ( )A、用限制性内切酶消化 DNAB、DNA 与载体的连接C、用凝胶电泳分离 DNA 片段D、DNA 片段转移到硝酸纤维素膜上E、用一个标记的探针与膜上 DNA 杂交正确答案：B61.PCR 反应体系不包括A、耐热的 TaqDNA 聚合酶B、cDNA 探针C、4 种 dNTPD、合适的缓冲液体系E、模板 DNA正确答案：B62.细菌感染分子生物学检验的检验对象是A、测定血清中抗体抗原B、镜检病原体形态C、测定血清中病原体蛋白含量D、测定血清中蛋白酶活性E、测定样本中核酸含量正确答案：E63.一位男性血友病患者，他亲属中不可能是血友病的是A、外甥或外孙B、同胞兄弟C、姨表兄弟D、叔、伯、姑E、外祖父或舅父正确答案：D64.延伸的温度通常为A、55℃B、72℃C、37℃D、95℃E、25℃正确答案：B65.以下不是在移植配型中常用的分子生物学检测技术是A、核酸分子杂交技术B、PCR 技术C、基因芯片技术D、免疫组化技术E、基因测序技术正确答案：D66.Sanger 双脱氧链终止法使用的链终止物是A、dNTPB、NTPC、α-32P-dNTPD、ddNTPE、α-35S-dNTP正确答案：D67.一般来说核酸杂交的温度低于其 Tm 值多少度A、30~40℃B、10~15℃C、15~25℃D、5~10℃E、40~50℃正确答案：C68.有关微卫星的描述正确的是A、散在重复序列的一种B、10~100bp 组成的重复单位C、主要存在于着丝粒区域，通常不被转录D、形式为 (CA) n/ (TG) n、 (AG) n、 (CAG) n 等E、又称为可变数目串联重复序列 (VNTR)正确答案：D69.判断 HBV 复制及传染性的直接指标是检测A、HBV DNA 多聚酶活力B、HBsAgC、HBV DNAD、HBeAgE、HBcAg正确答案：C70.检测 TB 的实验室技术中，被认为是目前最先进的一种检测TB 及其耐药性的方法是A、PCR 技术B、荧光定量 PCR 技术C、PCR-RFLP 技术D、全自动结核杆菌检测技术E、DNA 测序技术正确答案：D71.在 pH 为下述何种范围时，Tm 值变化不明显A、pH 为 4~5B、pH 为 3~5C、pH 为 8~11D、pH 为 5~9E、pH 为 5~6正确答案：D72.单核苷酸多态性检测芯片探针的设计不正确的是 ( )A、一般采用等长移位设计法B、包括与靶序列完全匹配的野生型探针C、三种不同的单碱基变化的核苷酸探针D、靶序列与探针完全匹配的杂交点显示较弱的荧光信号E、可以对某一段核酸序列所有可能的 SNPs位点进行扫描正确答案：D73.结核分支杆菌的基因组特征是A、单链 DNAB、双链 DNAC、单正链 RNAD、单正链 RNA 双聚体E、单负链 RNA正确答案：B74.下列有关遗传病的叙述中正确的是A、遗传病是指由遗传物质改变而引起的疾病B、遗传病一定是先天性疾病C、遗传病都是由基因突变引起的D、遗传病只能诊断不能治疗E、先天性疾病都是遗传病正确答案：A75.下列关于病毒基因组描述不正确的是A、基因组可以由DNA 或 RNA 组成B、有重叠基因C、基因组大部分是用来编码蛋白质的D、有高度重复序列E、相关基因往往丛集形成一个功能单位正确答案：D76.HCV 基因分型的“金标准”是( )A、基因分型检测芯片B、测序分析法C、实时荧光 PCRD、基因型特异性引物扩增法E、RFLP正确答案：B77.规范化的临床基因扩增检验实验室工作区域不包括A、标本制备区B、隔离区C、扩增区D、产物分析区E、试剂储存和准备区正确答案：B78.点/狭缝杂交可以用于A、快速确定是否存在目的基因B、不仅可以检测 DNA 样品中是否存在某一特定的基因，而且还可以获得基因片段的大小及酶切位点分布的信息C、用于基因定位分析D、阳性菌落的筛选E、蛋白水平的检测正确答案：A79.DNA 芯片的固相载体不可以用A、半导体硅片B、玻璃片C、滤纸D、硝酸纤维素膜E、尼龙膜正确答案：C80.PCR 反应必需的成分是A、BSAB、DTTC、Tween20D、明胶E、Mg2+正确答案：E81.多重 PCR 的描述中正确的是：A、同一个模板，多种不同的引物B、相同的引物，多种不同的模板C、多个模板，多种引物D、引物的Tm 值、反应时间和温度、反应缓冲液等尽量不一致以区分不同产物E、同一反应内各扩增产物片段的大小应尽可能相同或接近正确答案：A82.下列物质不适于非放射性探针标记的是A、AKPB、ACPC、生物素D、地高辛E、荧光素正确答案：B83.双脱氧终止法测定核酸序列时，使用 ddNTP 的作用是：A、作为 DNA 合成的正常底物B、形成特异性终止链C、标记合成的DNA 链D、使电泳时 DNA 易于检测E、使新合成的 DNA 链不易形成二级结构正确答案：B84.关于 Sanger 双脱氧链终止法叙述错误的是A、每个 DNA 模板需进行一个独立的测序反应B、需引入双脱氧核苷三磷酸 (ddNTP) 作为链终止物C、链终止物缺少3’-OH，使链终止D、测序反应结果是产生 4 组不同长度的核苷酸链E、高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳可分离仅差一个核苷酸的单链 DNA 正确答案：A85.下列关于 real-time PCR 引物设计的原则中，不正确的是A、两条引物的Tm 值相差尽量大B、G+C 的含量应在 45%~55%之间C、尽量避免引物二聚体的出现D、反应体系中引物的浓度一般在0.1~0.2μmol/L 之间E、引物过长可能提高退火温度正确答案：A86.巢式 PCR 错误的是A、是对靶 DNA 进行二次扩增B、第二次扩增所用的模板为第一次扩增的产物C、巢式 PCR 可提高反应的灵敏度和特异性D、常用于靶基因的质和 (或) 量较低时E、第二对引物在靶序列上的位置应设计在第一对引物的外侧正确答案：E87.产前诊断临床应用尚不广泛，原因不包括A、诊断的准确性受到多种制约B、需要生殖医学与遗传学技术的结合C、诊断技术不成熟D、单个细胞的遗传诊断困难E、已明确母亲为携带者的婴儿正确答案：C88.纯 DNA 的 A260/A280 比值为 1.8，可使比值升高的是：A、蛋白质B、酚C、RNAD、氯仿E、Mg2+正确答案：C89.K-ras 基因最常见的激活方式是A、染色体重排B、点突变C、插入突变D、缺失突变E、基因扩增正确答案：B90.下列不是片段性突变引起原因的是A、基因重排B、转录异常C、碱基缺失D、碱基扩增E、碱基插入正确答案：B91.下列不符合转座因子含义的是A、转座因子是 DNA 重组的一种形式B、可在质粒与染色体之间移动的DNA 片段C、转座子是转座因子的一个类型D、可移动的基因成分E、能在一个 DNA 分子内部或两个 DNA 分子之间移动的 DNA 片段正确答案：A92.对于寡核苷酸探针，杂交温度一般低于其 Tm 值A、20~30℃B、15~30℃C、5℃D、30~40℃E、10~15℃正确答案：C93.电脑显示和打印出的 DNA 碱基序列图谱中不出现的颜色：A、紫B、蓝C、绿D、黄E、红正确答案：A94.关于真菌，以下描述正确的是A、真菌种类繁多，其中大多数对人类有害B、浅部真菌感染对治疗有顽固性，对机体的影响相对较小C、近年真菌病的发病率有明显下降趋势D、病原性真菌根据其入侵组织部位深浅的不同分为浅部真菌和内部真菌E、真菌感染对人体的危害不大正确答案：B95.下列关于人类遗传病的叙述不正确的是A、人类遗传病包括单基因遗传病、多基因遗传病和染色体异常遗传病B、21-三体综合症患者体细胞中染色体数目为 47 条C、遗传性疾病既可以直接诊断，也可以间接诊断D、单基因病是指受一个基因控制的疾病E、人类遗传病是指由于遗传物质改变而引起的疾病正确答案：D96.构成完整的病毒颗粒的成分是A、结构蛋白B、核酸C、蛋白质与核酸D、蛋白质E、糖蛋白正确答案：C97.关于荧光原位杂交技术叙述不正确的是( )A、用荧光素标记探针B、用放射性核素标记探针C、无需经过核酸的提取D、可以用于遗传病的产前诊断E、可以用于基因定位正确答案：B98.RNA/RNA 杂交体的 Tm 值一般应增加A、1-5℃B、5~10℃C、10~15℃D、15~20℃E、20~25℃正确答案：E99.关于肿瘤分子诊断的说法正确的是A、肿瘤分子诊断的核心是基于细胞水平的分子诊断技术B、肿瘤分子诊断的研究成果仅用于临床肿瘤的诊断C、肿瘤分子诊断就是利用分子生物学原理和技术建立的肿瘤诊断方法D、肿瘤分子诊断的含义主要表现在虽然检测对象众多，但大多数标志物是特异性的肿瘤标志物E、肿瘤的分子诊断中根据目的、对象、类型的不同要采取相似的诊断策略与方法正确答案：C100.逆转录 PCR 扩增最终产物的特异性由A、随机引物决定B、oligo-d (T) 决定C、PCR 扩增的特异引物决定D、扩增效率决定E、逆转录酶决定正确答案：C。

基因组学课件第8章分子杂交与印迹技术

➢ 操作步骤：
✓ 蛋白样品的制备 ✓ 蛋白样品的分离-（SDS-PAGE） ✓ 转膜 ✓ 封闭 ✓ 一抗杂交 ✓ 二抗杂交 ✓ 底物显色
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3、Western 印迹杂交
➢ 酶联显色：
HRP：底物为DAB AP：底物为BCIP/NBT
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3、Western 印迹杂交
52
3、Western 印迹杂交
转印方法：毛细管虹吸法
➢ 利用毛细管的虹吸作用由转移缓冲液带动核酸分子转移至滤膜上。 ➢ DNA片段由液体携带而从凝胶转移并聚集于薄膜表面。液体通过毛
细管作用抽吸通过凝胶，借助于一叠干的吸水纸巾产生并维持毛细管作用。转移的速度取决于DNA片段的大小和凝胶中琼脂糖的浓度，小片段DNA（<1kb）1h内就能够从0.7%琼脂糖上几乎定量地转移，而较大片段的DNA转移较慢且效率较低。
3）荧光原位杂交
64
2）组织/细胞原位杂交
➢ 特点:
能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究
不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序列灵敏度高
能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态
65
4、原位杂交（in situ hybridization）
1）菌落原位杂交 2）组织/细胞原位杂交 3）荧光原位杂交
5、斑点杂交(dot blot)
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4、原位杂交（in situ hybridization）
➢ 核酸原位杂交特点：
（1）不受组织成分的影响；（2）灵敏度高；（3）可完整保持细胞或组织形态，准确反映组织细胞的相互关系
及功能；（4）可检测多个探针。
60
4、原位杂交（in situ hybridization）
7
2、分子印迹（blot、bloting）

医学分子生物学第九章印迹杂交技术

数据分析
二、蛋白质芯片
蛋白质芯片(protein chip) 是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点
阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。
蛋白质芯片作用原理蛋白质分子间的亲和反应
干姜附子肉桂造模的血清细胞因子芯片检测（L Series 90: RayBio® Labelbased Rat Antibody Array ，货号：AAR-BLM-1-2 ） Normal
（2）Western blotting
① Western（转膜）
电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，转到膜上（硝酸纤维素膜、PVDF膜、中性尼龙膜等）。
胶里的蛋白质带在电场
的作用下横向转移到正
胶
膜
极一侧的膜上。
蛋白
Western装置
② Blotting
PAGE胶待测蛋白
硝酸纤维素膜
待测蛋白一抗二抗
多克隆抗体 Blotting的结果
基因芯片及数据分析
一、基因芯片的技术原理二、基因芯片的点制过程三、基因芯片的数据分析
基因芯片
基因芯片发展历史
Southern & Northern Blot Dot Blot
Macroarray
Microarray
基因芯片
芯片杂交操作流程：
经大规模PCR扩增获得独立cDNA插入片段；用机悈手将PCR产物点在玻璃板上，变性、固定。分别从不同器官或组织中分离mRNA，反转录生成
基本程序（1）细胞或组织固定及切片（2）预杂交及杂交（3）冲洗（4）放射自显影或标记酶显色
原位杂交的原理

分子印迹(渍)与分子杂交技术

• DNA与膜共价结合，反复多次使用不会损耗太多。 •对不同大小的核酸片段都具有同等的结合能力（NC、
NL不具备) －－结合能力较NC膜低－－活化过程较复杂是指将核酸,蛋白质等生物大分子固定在纤维膜上的过程。将核酸或蛋白质从电泳后的凝胶中转移到膜上或直接将核酸点到膜上。（1）物理吸印方法
原位杂交中，标本的固定条件是影响杂交效率的重要因素，标本组织蛋白质的消化程度对探针进入细胞极为重要。去除蛋白的方法是，用0.2mol/l HCl处理载玻片，用蛋白酶K消化，然后用不同浓度的乙醇脱水，原位杂交还是一种新技术，发展很快，在敏感性、特异性和稳定性上还需要进一步完善和提高用于原位杂交的探针可以是单链或双链DNA，也可以是RNA探针。通常探针的长度以100～400nt为宜，过长则杂交效率减低。最近研究结果表明，寡核苷酸探针（16～ 30nt）能自由出入细菌和组织细胞壁，杂交效率明显高于长探针。因此，寡核苷酸探针和不对称PCR标记的小DNA 探针或体外转录标记的RNA探针是组织原位杂交的优选探针。
⑥将滤膜移至用2×SSPE溶液浸过的滤纸上，放置10min。SSPE 配成20×贮备液：3.6mol/l NaCl, 0.2mol/L NaH2PO4(PH7.4), 20mmol/L EDTA(pH7.4)。
⑦将滤膜用滤纸吸干，80℃真空烘干2h。
固相核酸分子杂交类型

Southern印迹杂交（ southern blot ） Northern印迹杂交（Northern blot）斑点杂交（Dot blot）菌落原位杂交（Colony in situ hybridization）组织原位杂交（Tissue in situ hybridization）可以确定探针的互补序列在胞内的空间位置

Southern印迹杂交及其他相关印迹技术简介

Southern印迹杂交及其他相关印迹技术简介姜永均 (江苏省如东高级中学 226400)摘要 Southern印迹杂交(Southern b l ot)是分子生物学领域中最常用的技术方法之一,该技术是1975年英国爱丁堡大学的E. M.Sou t h ern首创的,Sou t h ern印迹杂交故因此而得名。

后来相继出现了三个原理、过程相似,但是操作对象不同的印迹方法,缘于学界前辈的幽默分别将其称为N ort h ern b l ot、W estern blot和Eastern b l ot,这些技术的命名与发明人姓氏并没有关系。

本文简要介绍了Sou t hern印迹杂交及其相关生物技术。

关键词 Sou t hern印迹杂交 Northern印迹杂交 W estern印迹杂交 Eastern印迹杂交在近年的一些省、市中学生生物奥赛试卷中常涉及到Southern印迹、N outhern印迹、W este m印迹等分子生物学技术。

本文将Sout hern印迹杂交及其相关生物技术作一个简单介绍。

Souther n印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法,是研究DNA图谱的基本技术,在遗传病诊断、DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。

Souther n印迹杂交技术1975年由英国人埃德温迈勒萨瑟恩(Ed w i n M ellor Southern)创建。

1977年詹姆斯艾尔文(Ja mes A l w ine)等把此方法应用到RNA的研究方面,称作Northern印迹法。

1979年乔治斯塔克(G eor ge Stark)等则把该方法扩展应用到单向电泳后的蛋白质分子的分析方面,被称作W estern印迹法。

1982年Re i nhart报道双向电泳后蛋白质分子的印迹分析,称之为Eastern印迹法。

目前,有人把Sou hern、Nort hern、W esther印迹法分别称作DNA印迹法、RNA印迹法和蛋白质印迹法。

8.7印迹法

3、DNA探针：
由mRNA转录而来，在逆转录酶的作用下，以mRNA 为模板，合成 cDNA第一链，进而合成第二链。将合成的c 酶切及纯化该cDNA片段即可。也可利用反向技术制备，即以mRNA 为模板逆转录合成第一链cDNA，然后加入一对相应于目的序列两端的PCR引物进行PCR扩增，再电泳分离、纯化，即可得到特定的 cDNA片段。优点双链探针，长度较长，可与靶序列形成的杂交体稳定性、特异性比寡核苷酸探针高，杂交信号强。缺点由于是双链，必须先变性再杂交，在杂交过程中还存在自我复性现象。
4、RNA探针：
以双链DNA为模板，利用噬菌体依赖于DNA的RNA聚合酶于体外转录而成。优点 ①RNA/RNA比RNA/DNA杂交体系稳定性高。 ②单链，不存在变性和自我复性。 ③RNA中不存在高度重复序列，非特异性杂交少。 ④杂交后可用RNase将未杂交的游离探针消化掉，从而使本底降低。缺点 RNA容易降解。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
抗原一抗
标记
二抗
2、固相膜种类 1）硝酸纤维素膜（NC膜）

ห้องสมุดไป่ตู้
与蛋白质可能是通过疏水作用非共价结合。使用时不需要活化，在p H8.0时，蛋白质比较容易吸附于膜上。问题是小分子量的蛋白质与NC膜的结合力较差。
2）电转移法

这种方法是用有孔的塑料和有机玻璃板将凝胶和 NC膜夹成“三明治”形状，而后浸入两个平行电极中间的缓冲液中进行电泳，选择适当的电泳方向就可以使蛋白质在电场力的作用下离开凝胶结合到NC膜上。常用的电泳转移方法有湿转和半干转。

8.印迹杂交技术

片段的大小和含量
40
41
第四节核酸分子杂交的分类
根据杂交核酸分子的种类：
DNA与DNA杂交
DNA与RNA杂交 RNA与RNA杂交
42
根据杂交探针标记的不同：同位素杂交
非同位素杂交
43
根据杂交介质的不同：液相杂交点杂交/狭缝杂交
菌落杂交固相杂交 Northern 杂交 Southern杂交
②为单链核酸，双链核酸探针使用前需变性解链
③具有高度特异性，只与待测核酸杂交
④探针序列通常是基因编码序列，因为非编码序列特异性低
⑤探针标记灵敏度高而稳定，标记方法简便而安全
10
二、探针的种类 1.基因组DNA探针 2. RNA探针 3. cDNA探针
4.寡核苷酸探针
11
⒈ 基因组DNA探针
基因组DNA探针多为某一基因的全部或部
第八章印迹杂交技术
1
第一节核酸分子杂交的基本原理
基本概念:
核酸分子杂交:
将一种核酸单链标记成为探针．再与另一种核酸单链进行碱基互补配对，可以形成异源双链核酸分子的过程。
杂交体:杂交形成异源双链核酸分子
2
核酸分子杂交
不同来源的核酸经变性和复性的过程，其中一些局部碱基互补片段在复性时形成杂化双链，此过程称分子杂交。
35
核酸的固定
烘烤：80℃ 2小时紫外线固定：几分钟
碱固定：使用碱溶液转印DNA或
RNA过程中，DNA或RNA可以自动地
共价地结合到带正电荷或不带电荷的
尼龙膜上。
36
⒋预杂交
将固相膜上能够结合核酸的位点全部封闭
能够结合核酸片段的固相膜同样能够结合探针，

第十二章印迹杂交技术

二、RNA印迹法（Northern blot）
操作：与Southern印迹极为相似，但不需要酶切可直接变性转移； RNA经变性后再电泳（可用甲酰胺、甲醛等使RNA变性，不能用碱，易使RNA降解）；电泳时不能加EB，影响RNA与膜结合；严防RNase污染。用途：检测RNA（定性或定量分析细胞内总RNA或某一特定RNA，特别是分析mRNA的大小和含量）——研究基因插入缺失等突变、基因表达（金标准）。
一、核酸探针
——带有标记物且序列已知的核酸片段，能与待测核酸中的特定序列特异杂交。
• 核酸探针是否合适是决定核酸杂交分析能否成功的关键。
核酸杂交与分子探针
核酸探针应具有的条件
① 特异性高：只与待测核酸样品中的互补序列杂交。 ② 带有标记物：标记物灵敏度高而稳定，检测方便。
核酸探针的种类
常用核酸杂交分类
杂交方法
Southern印迹 Northern印迹斑点杂交菌落杂交和噬斑杂交
适用范围
检测经凝胶电泳分开的DNA 分子,需转印到膜上检测经凝胶电泳分开的RNA 分子,需转移到膜上检测未经分离的,固定在膜上的 DNA或RNA分子检测固定在膜上的,经裂解后从细菌和噬菌体中释放的 DNA分子检测细胞或组织中的DNA或 RNA分子
2.非放射性标记物
优点：无环境污染，可长时间贮存。 • 生物素：
一种小分子水溶性维生素，连接在碱基上和抗生物素蛋白（avidin）特异结合抗生物素蛋白上连接有显色物质(酶、荧光素等) 。 • 酶促显色：
碱性磷酸酶（ALP或AKP）：催化底物（5-溴-4-氯-4吲哚磷酸，BCIP）和硝基蓝四氮唑（NBT），生成不溶性紫色化合物二甲臜；辣根过氧化物酶（HRP）：催化底物二氨基联苯胺（DAB）生成红棕色沉淀物；或催化底物四氨基联苯胺（TMB）生成蓝色沉淀物。

分子杂交和印迹技术-文档资料

（三）蛋白质印渍技术 Western blotting
• 又称为Western杂交，或免疫印渍技术，即利用抗原-抗体反应，检测转移到硝酸纤维素膜上的特异性蛋白质。 • 应用：用于检测样品中特异性蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白质分子的相互作用研究等。
三种印迹技术的比较
– 用去垢剂或蛋白酶除去核酸表面蛋白质
• 探针的选择和标记 • 杂交 • 杂交结果检测
FISH（fluorescence in situ hybridization）技术是一种重要的非放射性原位杂交技术。它的基本原理是:如果被检测的染色体或靶 DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测体系在镜下对待测DNA 进行定性、定量或相对定位分析。
原位杂交 in situ hybridization
• 即组织原位杂交，指组织切片或细胞涂片直接用于杂交分析。先经适当处理，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与DNA或RNA杂交。 • 因此原位杂交可以确定探针的互补序列在胞内的空间位置，这一点具有重要生物学和病理学意义。
原位杂交(in situ hybridization)
（一）DNA印迹技术 Southern blotting
• 又称为 Southern 杂交，即 DNA-DNA 杂交分析，是研究 DNA 图谱的基本技术，主要用于基因组 DNA 的分析，如在基因组中特异基因的定位及检测等，在遗传诊断 DNA 图谱分析及 PCR 产物分析等方面有重要价值。

Southern印迹杂交

Southern印迹杂交实验原理核酸分子杂交技术是分子生物学领域中最常用的具体方法之一。

其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。

由于核酸分子的高度特异性及检测方法的灵敏性，综合凝胶电泳和核酸内切限制酶分析的结果，便可绘制出DNA分子的限制图谱。

但为了进一步构建出DNA分子的遗传图，或进行目的基因序列的测定以满足基因克隆的特殊要求，还必须掌握DNA分子中基因编码区的大小和位置。

有关这类数据资料可应用Southern印迹杂交技术获得。

Southern印迹杂交技术包括两个主要过程：一是将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，即印迹（blotting）;二是固定于膜上的核酸同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。

该技术是1975年英国爱丁堡大学的E.M.Southern首创的，Southern印迹杂交故因此而得名。

早期的Southern印迹是将凝胶中的DNA变性后，经毛细管的虹吸作用，转移到硝酸纤维膜上。

近年来印迹方法和固定支持滤膜都有了很大的改进，印迹方法如电转法、真空转移法；滤膜则发展了尼龙膜、化学活化膜（如APT、ABM纤维素膜）等。

利用Southern印迹法可进行克隆基因的酶切、图谱分析、基因组中某一基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性片断长度多态性分析（RFLP）等。

实验方法本节以哺乳动物基因组DNA为例，介绍Southern印迹杂交的基本步骤。

一、待测核酸样品的制备（一）制备待测DNA基因组DNA是从动物组织（或）细胞制备。

1. 采用适当的化学试剂裂解细胞，或者用组织匀浆器研磨破碎组织中的细胞；2. 用蛋白酶和RNA酶消化大部分蛋白质和RNA；3. 用有机试剂（酚/氯仿）抽提方法去除蛋白质。

（二）DNA限制酶消化基因组DNA很长，需要将其切割成大小不同的片段之后才能用于杂交分析，通常用限制酶消化DNA。

医学分子生物学原理-分子杂交和印迹技术

最适切口平移的片段一般为50-500个核苷酸。
2020年3月4日1时8分
15
DNA切口平移标记法示意图
DNA 酶 Ⅰ ：在双链DNA上随机打开若干个单链缺口，产生3’-OH端。
大肠杆菌 DNA 聚合酶 Ⅰ ： 5’→3’ DNA聚合酶活性； 5’→3’ 外切核酸酶活性。
➢ 将这些菌落归并到一个琼脂主平板，第二个琼脂平板表面铺一张硝酸纤维素滤膜。经培养一段时间后，对菌落进行原位裂解。
2020年3月4日1时8分
6
核酸分子杂交应用
（1）特定基因序列的定性和定量分析（2）基因克隆的筛选（3）酶切图谱的制作（4）基因突变分析（5）疾病的诊断
2020年3月4日1时8分
7
二、探针的种类和制备
探针(probe)的概念：用来检测某一特定核苷酸序列或基因序列
的DNA或RNA的互补标记片段：
5′ 3′ 5′
3′
53′′ 5′
3′
2020年3月4日1时8分
3′ 5′ 限制性内切酶
3′ 5′
Klenow DNA聚合酶
完整双链DNA
5 ′末端突出的DNA
[α-32P]-dNTP 其他3 种dNTP
变性
35 ′′
3 ′末端标记的 DNA
3 ′ 32P-末端标记的
5′
单链DNA探针
21
标记探针的纯化
Luminol化学发光原理
1.曝光：用滤纸吸去杂交膜上多余底物，作好标记，保鲜膜包裹，放在暗夹里，放上X光片，曝光1-5 分钟；
2.显影：取出X光片，按使用说明书显影和定影。
思考题：
2020年3月4日1时8分
29

分子诊断的先河——Southern印迹杂交技术 ppt

分子诊断的先河——Southern印迹杂交技术摘要：上世纪70年代美籍华裔科学家简悦威采用Southern印迹杂交技术成功诊断了α地中海贫血症和镰状细胞贫血症，开创了临床分子生物学检验的先河，他是怎样做到的呢？知识点：分子杂交、核酸分子杂交、探针Southern印迹杂交、琼脂糖凝胶电泳技术、印迹技术临床分子生物学检验技术的发展第一阶段：分子杂交第二阶段：PCR第三阶段：生物芯片第四阶段：DNA测序美籍华裔科学家简悦威应用DNA分子杂交技术诊断α地中海贫血(1976)、镰状细胞贫血(1978)分子杂交(molecular hybridization) 两条单链核酸、抗原与抗体、受体与配体等经相互作用重新组成新的杂交分子图片源于网络非原创核酸分子杂交两条序列互补的单链核酸之间(DNA 与DNA ，DNA与RNA或RNA与RNA)借助氢键相连形成杂合双链碱基互补配对A=T,A=U,C≡G杂合双链图片源于网络非原创核酸分子杂交：待测核酸与探针图片源于网络非原创核酸探针 (nucleic acid probe)能与待测靶核酸特异互补杂交的已知被标记的核酸分子核酸探针的标记1.放射性核素标记：32P、3H、35S等2.非放射性标记：生物素、地高辛、荧光素等分子杂交(molecular hybridization)反应介质液相杂交固相杂交原位杂交印迹杂交Southern印迹杂交(E.M.Southern,1975) ——镰状细胞贫血症的分子诊断(1978)琼脂糖凝胶电泳技术Southern印迹杂交印迹技术分子杂交技术视频源于网络非原创琼脂糖凝胶电泳技术——分离、纯化、鉴定核酸碱性缓冲液琼脂糖凝胶负极正极核酸加样孔电极琼脂糖凝胶电泳技术可将分子量和构象不同的核酸分子进行分离小分子量核酸电泳结束后不同分子量的核酸的迁移位置琼脂糖凝胶电泳技术图谱DNA Marker 核酸样品琼脂糖凝胶电泳技术Southern印迹杂交印迹技术分子杂交技术印迹技术 (Blotting）将核酸分子通过一定方式转移并固定到固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上印迹技术膜核酸凝胶琼脂糖凝胶电泳技术Southern印迹杂交印迹技术分子杂交技术视频源于网络非原创应用Southern印迹检测红色特异DNA片段1. 从样品中提取DNA并通过限制性核酸内切酶消化样品DNA2.消化后的DNA片段经琼脂糖凝胶电泳技术分离3. 凝胶中DNA经碱处理变性成单链，4. 单链DNA经印迹技术从凝胶转移到膜上并固定5. 附着DNA的膜经预杂交后与标记探针进行杂交6. 通过洗涤除去未杂交的探针，经放射性自显影检测与探针序列互补的特定DNA片段Southern 印迹技术1. 通过限制性核酸内切酶消化样品DNA，2. 消化后的DNA片段经琼脂糖凝胶电泳技术分离，3. 凝胶上被分离好的DNA片段经碱处理变性成单链，4. 单链DNA经印迹技术从凝胶转移到膜上并固定，5. 附着DNA的膜经预杂交后与标记探针进行杂交，6. 杂交后洗脱未特异结合的探针，经放射性自显影检测与探针序列互补的特定DNA片段制备待测核酸样品分离、变性、转移、固化DNA 片段杂交检测杂交信号预杂交制备携带标记的核酸探针漂洗去除未参与杂交的标记探针图片源于网络非原创应用Southern印迹杂交技术诊断镰状细胞贫血？分子诊断的先河——Southern印迹杂交技术。

Western印迹杂交

杂交
显色发光
应用
可以非常有效的鉴定某一蛋白质（或表位）的性质；结合免疫沉淀法，可以用来定量分析小分子抗原。
Thank you！
Western印迹杂交
Western印迹杂交是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异性蛋白质的检测方法，又称蛋白印迹或免疫印迹，是一种检测固定在固相基质上蛋白质的免疫化学方法，是当代分析和鉴定蛋白质的最有效的技术之一。
强化1001 卞小稳 0205100211
基本原理在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异性抗体来检测。
显色发光
蛋白质样品制备
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质转膜
封闭
杂交
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳能有效的分离蛋白质,主要依据其分子量的差异，分子量小的蛋白质比分子量大的走得快，从而在凝胶上形成一系列分子量大小不同的条带，达到分离蛋白质的目的。
显色发光
蛋白质
转膜
封闭
因为固相载体能以非共价键的形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性，所以可以把经过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质样品，转移到固相载体上。
杂交
显色发光
蛋白质样品制备 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质转膜
封闭
膜选择的根据主要有： a. 膜与目的蛋白分子的结合能力，（决定单位面积的膜能结合蛋白的载量)，以及膜的孔径,（决定拦截蛋白的大小）； b. 不影响后续的显色检测，也就是适和用于所选的显色方法 Western Blot印迹常用的转移膜主要是硝酸纤维素膜和PVDF膜
显色发光蛋白质样品制sds聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白封闭杂交将膜浸泡在高浓度的蛋白质溶液中温育将膜上的非特异性位点封闭防止其与下一步反应中的一抗结合干扰实验结显色发光蛋白质样品制sds聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白封闭杂交加入特异抗性体一抗膜上的目的蛋白抗原抗原与抗体发生特异性结合进行一抗杂交然后二抗再与一抗结合进行二抗杂交

分子印迹与杂交技术

第 21 章
分子生物学常用技术
第一节分子印迹与杂交技术
Molecular hybridization & blotting technology
一、分子杂交与印迹技术的原理
核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization )
在DNA复性过程中，把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可在不同的分子之间形成杂化双链的这种现象。
2. 印迹(blotting)定义将存在于凝胶中的生物大分子转移（印迹）或直接放在固相化介质上并加以检测分析的技术。
3. 应用广泛用于DNA、RNA、蛋白质的检测
4. 发展电转移印迹技术、
真空吸引转移印迹等
（二）探针技术
探针(probe)的概念
指经过特殊标记的核酸片段，它具
有定的序列，能够与待测的核酸片段
Kary B. Mullis
La Jolla, CA, USA
1944 -
Michael Smith
University of British Columbia Vancouver, Canada
1932 - 2000
一、PCR技术的工作原理
Template DNA
5
5
5
Cycle 1
Primer 1 5 Primer 2
n 或用同位素标记第二抗体，放射自显影法检测蛋白区带的信号。
Western blotting应用
用已知的特异抗体检测目的基因蛋白
SDS-PAGE purified recombinant human CK2α subunit and its Western blotting

分子生物学

名词解释：以核酸和蛋白质等为研究对象。

形式的蛋白质，是细胞内所有蛋白质的集合体。

其代谢规律。

（是旬在疾病分子标记和药物靶点最有效的方法）RNA的DNA序列，是决定遗传性状的功能单位，包括编码序列、编码序列外的侧翼序列及插入序列。

分子内或分子间发生遗传信息的重新组合（包括启动子和操纵基因）以及下游的转录终止信号所构成的基因表达单位，所转录的RNA 为多顺反子。

Ca离子、DAG、IP3RNA，催化反应时需要mg离子参加。

进行杂交并分析。

DNA片段，与一个DNA载体连接成重组DNA，不同来源的DNA共价连接形成的新的DNA分子。

DNA片段连接到一种特定的、能自我复制的DNA分子上，这种分子就是重组DNA技术的载体。

目的基因、合成目的蛋白的载体。

（src是人类鉴定的第一个癌基因）构改变或表达量增加导致细胞生长失控而发生癌变。

基因诊断：是指应用分子生物学和分子遗传学的技术方法，直接检测基因结构及其表达是否一场，从而对疾病作出诊断。

DNA序列，包括启动子、上游启动子元件、增强子、加尾信号和反应元件等。

它们通过与反式作用因子相互作用来发挥转录调控作用。

DNA结合蛋白，真核细胞内含有大量的序列特异性的DNA 结合蛋白，其中一些蛋白的主要功能是使基因开放或关闭，称反式作用因子，简称反式因子。

质，个别是糖脂几乎所有细胞中持续表达，这些基因称为管家基因RNA和蛋白质组成，能以所含的RNA为模板逆转录合成真核生物染色体的端粒DNA重复序列，保证染色体复制的完整性。

DNA克隆群体。

DNA序列。

衰减子：不依赖因子的终止因子结构DNA结构域包含一段约30个氨基酸序列，序列中有两对氨基酸通过配位键结合一个锌离子形成的结构。

在一起。

RNA序列和相应的DNA序列。

回文序列：双链DNA中的一段倒置重复序列的双链被打开后，可形成局部“十字形”结构，这段序列称回文序列。

基因表达随着环境变化而变化，呈现一定的时间和空间上特异性。

DNA或以它为载体构建的重组DNA导入细菌的过程。

8.印迹杂交技术

southern印迹杂交操作流程

分子杂交的概念及基本原理

Northern印迹杂交技术

分子生物学复习题(附答案)

基因组学课件 第8章 分子杂交与印迹技术

医学分子生物学第九章印迹杂交技术

分子印迹(渍)与分子杂交技术

Southern印迹杂交及其他相关印迹技术简介

8.7印迹法

8.印迹杂交技术

第十二章 印迹杂交技术

分子杂交和印迹技术-文档资料

Southern印迹杂交

医学分子生物学原理-分子杂交和印迹技术

分子诊断的先河——Southern印迹杂交技术 ppt

Western印迹杂交

分子印迹与杂交技术

分子生物学

基因组学课件第8章分子杂交与印迹技术

第十二章印迹杂交技术