《植物DNA分子标记》PPT课件
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
是指DNA探针与染色体上的DNA杂交，并在染 色体上直接进行检测的分子技术，其原理是两 条核苷酸单链片断在适宜的条件下，通过氢键 结合，形成DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RN A双键分子，用带有标记的DNA或者RNA片断 作为核酸探针，与细胞内染色体杂交，用放射 自显影等方法予以显示，在荧光显微镜下观察 目的mRNA或者DNA的存在与定位。
(a) Bx350-184, a 28-chromosome
genome with at least 14 intergeneri c translocations, some of which ha ve two breakpoints in an arm (arro ws). Bar: 10 μm.
0min，观察、拍照。 6. 统计分析：记录条带清晰的RAPD条带，计算带纹相似
率；计算带频率、群内遗传纯度；DNA片段大小。
RAPD结果
Timothy genetic variation (Guo et al
优点：
RAPD的优缺点
（1）不需DNA探针，设计引物不需知道序列信息。覆盖 整个基因组。具有广泛适用性和通用性。
(基于Southern 杂交技术的分子标记)包括：
限制性片段长度多态性标记 （restriction fragment length polymorphism,
RFLP）
原位杂交（in situ hybridization）
PCR依赖的分子标记：
随机扩增多态性DNA标记
（random amplification polymorphism DNA, RAPD）
(d) Prior-57, a 14-chromosome ge
nome with intergeneric translocatio ns. Bar: 10 μm.
RFLP标记：限制性片段长度多态性
RFLP指应用特定的核酸内切酶切割有关的DNA分子所产生的DNA片段在长度上的变化。 包括基因组DNA限制性酶切，Southern印记，DNA探针制备，同位素/非同位素标记，DNA分子杂交
（2）用一个引物可扩增出多片段。
（3）技术简单，需要样品量少，成本低。
（4）每个RAPD标记相当于基因组分析中的靶序列位点， 简化信息的转移过程。
（5）可以对RFLP难以分析的基因组区域做遗传连锁图。
（6）分析自动化。
RAPD的优缺点
缺点： （1）显性标记，无法区别显性纯合体和杂合体。 （2）对反应条件敏感，重复性差。模板浓度、
The technique enables the spatial localization of gene expression to be determined as well as the l ocation of individual genes on chromosomes.
Guo et al. 2005
(b) Bx351-160, a 28-chromosome
genome with intergeneric translocat ions. Bar: 20 μm.
(c) Bx350-177 with fertile pollen, a
28-chromosome genome comprisi ng approximately equal amount of Lolium and Festuca DNA with 9 inte rgeneric translocations, some of w hich have two breakpoints in an ar m (arrows). Bar: 20 μm.
Mg 2+浓度，PCR反应中条件的变化等。 （3）存在共迁移问题。不同个体相同分子量的片段
不一定同源；一条带可能包含不同的产物。
AFLP标记
• AFLP：扩增片段长度多Βιβλιοθήκη Baidu性 （amplified fragment length polymorphism）
• AFLP技术是1992年由荷兰Keygene公司的科学家Zab eau Mare和Vos Pieter发明并发展起来的一种选择扩 增限制酶切片段的方法。
随着分子生物学技术的发展，现在DNA分子标记
技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作
图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、
基因克隆等方面。 DNA分子标记大多以电泳谱带的形式表现，分为
非PCR依赖的分子标记(基于Southern 杂交技术的分 子标记)和PCR依赖的分子标记。
非PCR依赖的分子标记
进行Southern印迹转移操作，用特定的探针与滤膜上的DNA杂交，经过放射自显影就能检测到高 等植物核DNA的RFLP。
(1) (2)
0.4kb 0.1kb0.2kb
0.4kb
0.3kb
×
0.5kb 0.5kb
品系1 系2
0.5kb 0.4kb
品 –
0.3kb
0.2kb
0.1kb +
RFLP标记方法与步骤
5.无基因多效性 **
6.检测手段简单快速
7.成本低廉
8.重复性好
* 杂合子的一对等位基因各自都具有自己的表型效应，称为共显性 （codominance）
** 基因多效性（gene pleiotropism）：一个基因产生多种表型效应 的现象。
DNA分子标记（DNA molecular marker）直接在 DNA分子水平上检测生物间的差异，是DNA水平上 遗传变异的直接反应。
酸），对所研究的基因组DNA进行PCR扩增，引物与基因组DNA某一区段互补时，就与其 结合，就可对引物下游DNA进行合成，即扩增。
RAPD的基本概念和原理
RAPD的引物：
（1）为随机引物 （2）序列较短（通常为10个核苷酸） （3）为一个寡核苷酸单链引物
0.2k b 0.5kb
0.2k b 0.5kb
a
b
c
d
Fig. 5 GISH images of chromosom es of tetraploid and diploid Festuloli um progenies. The DNA of L. peren ne was used as probe, and shown a s blue color. The chromosomes of F. pratensis were shown as pale blue color. Translocation breakpoints are indicated in a and c by arrows.
AFLP的基本原理
植物基因组DNA经限制性内切酶消化形成相对分子 量大小不等的随机限制性酶切片段，随后将特定 的接头连接在这些DNA片段两端，接头序列和邻 近限制性酶切位点作为引物进行PCR扩增，最后 通过PAGE分离扩增的特异限制性片段。在不需要 DNA序列的情况下，利用一套特定引物可在一次 单个反应中检测到大量的片段。
EcoRI N-3 ´ MseI NN-3´
CORE
EN
5
´
Z -GACTGCGTACC
EXT AATTC NN
5 ´ -GATGAGTCCTGAG TAA N
AFLP的优缺点
• 优点： （1）少量引物可获得较多标记，50~150条带 （2）多为显性标记或共显性标记，受环境影响 小
，无复等位效应
（3）带型清晰，具高分别率 （4）由于用两种引物经两步选择扩增，带型稳定，带
来自一个完整的纯合子的个体的每一种同源DNA分子，都会在同样的位点被准确切割。但是
在不同物种、不同品种、甚至同一品种的不同的两个个体之间，DNA会发生变异，其中有 些变异导致了限制性酶切位点的更动，从而产生了限制片段长度的多态性。
用限制性酶来酶解植物核DNA会产生数万个片段，其大小变化是连续的，如进行电泳分离，只能 看到弥散状的连成一片的电泳结果。然而，各限制片段在凝胶中还是分开的，但不能分辨。
（1）DNA的分离：可用CTAB法或SDS法 （2）酶切：一般根据基因组总DNA的复杂性选 （3）琼脂糖凝胶电泳 （4）Southern印迹转移 （5）DNA杂交及放射自显影
用限制酶。
RFLP标记优点
（1）不受性别、年龄局限，不会受表达的组 受影
（2）标记座位的等位基因间是共显性的，通过 纯合子
（3）RFLP标记源于基因组DNA自身变异，在
AFLP的基本原理
AFLP引物是一种人工合成的单链寡核苷酸，一般长度 为18~20个核苷酸。引物主要由3部分组成：
（1）核心序列（CORE），该序列与人工接头互补； （2）限制性内切酶识别特异序列（ENZ）； （3）选择性延伸序列（EXT），即引物3端的选择碱
基，选择碱基延伸到酶切片段区。
如：EcoRI引物和MseI引物
纹丰富，灵敏度高，重复性好
（5）不需事先知道DNA序列信息 • 缺点：操作复杂，费用较高
SSR标记
SSR：简单重复序列（simple sequence repeat）多态性 ，也叫微卫星标记。
微卫星：即短串联重复(Short Tandem Repeat，STR)， 它是由2-6bp重复单位构成的DNA序列，通常多态性片 段长度在100-300bp。以人类基因组为例，平均每15-20 kb就存在1个STR座位，据此估计整个人类基因组中大约 有50,000-100,000个STR位点。由于微卫星DNA具有高度 的多态性和遗传稳定性，所以非常适合作为遗传学DNA 分子标记。
基于分子杂交技术的分子标记技术
此类标记技术是利用限制性内切酶解及凝胶电 泳分离不同的生物 DNA 分子，然后用经标记 的特异 DNA 探针与之进行杂交，通过放射自 显影或非同位素显色技术来揭示 DNA 的多态 性。
分子杂交：由具有互补碱基顺序的任何两 条单链核酸分子片断形成双链的过程。
染色体原位杂交
In situ hybridization
For in situ hybridization, a tissue sample is incubated with a labeled nucleic acid probe, excess pro be is washed away and the location of hybridized probe is examined.
织、发育阶段或外界环境的不同而 杂交后电泳带型可直接区别杂合子和显性 数量上几乎不受限制。
RFLP标记缺点
（1）DNA需要量大。 （2）所需仪器较多 （3）技术较为复杂 （4）多数RFLP表现为二态性，提供的信息量较低 （5）与内切酶选用密切相关
RAPD标记
• 1990年，美国杜邦公司科学家Williams推出。 • RAPD方法是在PCR技术基础上发展起来的，它利用一系列单个随机引物（通常为10个核苷
植物DNA 分子标记
分子标记的概念
广义的分子标记（molecular marker）： 可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白。包 括蛋白质标记和DNA标记（狭义的分子标 记）。
蛋白质标记包括动植物蛋白、同工酶及 等位酶
理想的分子标记：
1.高多态性
2.共显性遗传 *
3.能明确辨别等位基因 4.遍布整个基因组
等步骤。
生物能快速、精确地复制自身的DNA，但这种精确 性是相对的。实际上，在植物的自然群体中存在大量 的DNA序列变异。如：碱基对的代换、缺失等。几乎 不可能有两个生物体DNA的碱基序列是相同的。
限制性内切酶酶解DNA长链，是识别DNA上的特异 的位点并在这些位点上切断的过程。酶识别位点碱基 对越少，DNA分子中被识别的位点越多，所产生的限 制片段越短。
DNA扩增指纹印记
（DNA amplification fingerprinting, DAF）
简单序列重复标记（simple sequence repeat, SSR）
随机引物聚合酶链式反应
（arbitrarily primed PCR, AP-PCR）
扩增片段长度多态性标记
（amplified fragment length polymorphism, AFLP）
0.3kb 0.3kb ×
品系1 品 系2
0.5kb
0.3kb 0.2kb
RAPD的基本实验程序
1. DNA的提取 2. 模板DNA浓度和质量的检测 3. PCR扩增 4. 电泳检测：PCR结束后每个样品加4ul凝胶上样缓冲液
，每个泳道点样20ul。 5. 将凝胶浸于1ug/ml的EB中30min~60min，用水清洗约1
(a) Bx350-184, a 28-chromosome
genome with at least 14 intergeneri c translocations, some of which ha ve two breakpoints in an arm (arro ws). Bar: 10 μm.
0min，观察、拍照。 6. 统计分析：记录条带清晰的RAPD条带，计算带纹相似
率；计算带频率、群内遗传纯度；DNA片段大小。
RAPD结果
Timothy genetic variation (Guo et al
优点：
RAPD的优缺点
（1）不需DNA探针，设计引物不需知道序列信息。覆盖 整个基因组。具有广泛适用性和通用性。
(基于Southern 杂交技术的分子标记)包括：
限制性片段长度多态性标记 （restriction fragment length polymorphism,
RFLP）
原位杂交（in situ hybridization）
PCR依赖的分子标记：
随机扩增多态性DNA标记
（random amplification polymorphism DNA, RAPD）
(d) Prior-57, a 14-chromosome ge
nome with intergeneric translocatio ns. Bar: 10 μm.
RFLP标记：限制性片段长度多态性
RFLP指应用特定的核酸内切酶切割有关的DNA分子所产生的DNA片段在长度上的变化。 包括基因组DNA限制性酶切，Southern印记，DNA探针制备，同位素/非同位素标记，DNA分子杂交
（2）用一个引物可扩增出多片段。
（3）技术简单，需要样品量少，成本低。
（4）每个RAPD标记相当于基因组分析中的靶序列位点， 简化信息的转移过程。
（5）可以对RFLP难以分析的基因组区域做遗传连锁图。
（6）分析自动化。
RAPD的优缺点
缺点： （1）显性标记，无法区别显性纯合体和杂合体。 （2）对反应条件敏感，重复性差。模板浓度、
The technique enables the spatial localization of gene expression to be determined as well as the l ocation of individual genes on chromosomes.
Guo et al. 2005
(b) Bx351-160, a 28-chromosome
genome with intergeneric translocat ions. Bar: 20 μm.
(c) Bx350-177 with fertile pollen, a
28-chromosome genome comprisi ng approximately equal amount of Lolium and Festuca DNA with 9 inte rgeneric translocations, some of w hich have two breakpoints in an ar m (arrows). Bar: 20 μm.
Mg 2+浓度，PCR反应中条件的变化等。 （3）存在共迁移问题。不同个体相同分子量的片段
不一定同源；一条带可能包含不同的产物。
AFLP标记
• AFLP：扩增片段长度多Βιβλιοθήκη Baidu性 （amplified fragment length polymorphism）
• AFLP技术是1992年由荷兰Keygene公司的科学家Zab eau Mare和Vos Pieter发明并发展起来的一种选择扩 增限制酶切片段的方法。
随着分子生物学技术的发展，现在DNA分子标记
技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作
图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、
基因克隆等方面。 DNA分子标记大多以电泳谱带的形式表现，分为
非PCR依赖的分子标记(基于Southern 杂交技术的分 子标记)和PCR依赖的分子标记。
非PCR依赖的分子标记
进行Southern印迹转移操作，用特定的探针与滤膜上的DNA杂交，经过放射自显影就能检测到高 等植物核DNA的RFLP。
(1) (2)
0.4kb 0.1kb0.2kb
0.4kb
0.3kb
×
0.5kb 0.5kb
品系1 系2
0.5kb 0.4kb
品 –
0.3kb
0.2kb
0.1kb +
RFLP标记方法与步骤
5.无基因多效性 **
6.检测手段简单快速
7.成本低廉
8.重复性好
* 杂合子的一对等位基因各自都具有自己的表型效应，称为共显性 （codominance）
** 基因多效性（gene pleiotropism）：一个基因产生多种表型效应 的现象。
DNA分子标记（DNA molecular marker）直接在 DNA分子水平上检测生物间的差异，是DNA水平上 遗传变异的直接反应。
酸），对所研究的基因组DNA进行PCR扩增，引物与基因组DNA某一区段互补时，就与其 结合，就可对引物下游DNA进行合成，即扩增。
RAPD的基本概念和原理
RAPD的引物：
（1）为随机引物 （2）序列较短（通常为10个核苷酸） （3）为一个寡核苷酸单链引物
0.2k b 0.5kb
0.2k b 0.5kb
a
b
c
d
Fig. 5 GISH images of chromosom es of tetraploid and diploid Festuloli um progenies. The DNA of L. peren ne was used as probe, and shown a s blue color. The chromosomes of F. pratensis were shown as pale blue color. Translocation breakpoints are indicated in a and c by arrows.
AFLP的基本原理
植物基因组DNA经限制性内切酶消化形成相对分子 量大小不等的随机限制性酶切片段，随后将特定 的接头连接在这些DNA片段两端，接头序列和邻 近限制性酶切位点作为引物进行PCR扩增，最后 通过PAGE分离扩增的特异限制性片段。在不需要 DNA序列的情况下，利用一套特定引物可在一次 单个反应中检测到大量的片段。
EcoRI N-3 ´ MseI NN-3´
CORE
EN
5
´
Z -GACTGCGTACC
EXT AATTC NN
5 ´ -GATGAGTCCTGAG TAA N
AFLP的优缺点
• 优点： （1）少量引物可获得较多标记，50~150条带 （2）多为显性标记或共显性标记，受环境影响 小
，无复等位效应
（3）带型清晰，具高分别率 （4）由于用两种引物经两步选择扩增，带型稳定，带
来自一个完整的纯合子的个体的每一种同源DNA分子，都会在同样的位点被准确切割。但是
在不同物种、不同品种、甚至同一品种的不同的两个个体之间，DNA会发生变异，其中有 些变异导致了限制性酶切位点的更动，从而产生了限制片段长度的多态性。
用限制性酶来酶解植物核DNA会产生数万个片段，其大小变化是连续的，如进行电泳分离，只能 看到弥散状的连成一片的电泳结果。然而，各限制片段在凝胶中还是分开的，但不能分辨。
（1）DNA的分离：可用CTAB法或SDS法 （2）酶切：一般根据基因组总DNA的复杂性选 （3）琼脂糖凝胶电泳 （4）Southern印迹转移 （5）DNA杂交及放射自显影
用限制酶。
RFLP标记优点
（1）不受性别、年龄局限，不会受表达的组 受影
（2）标记座位的等位基因间是共显性的，通过 纯合子
（3）RFLP标记源于基因组DNA自身变异，在
AFLP的基本原理
AFLP引物是一种人工合成的单链寡核苷酸，一般长度 为18~20个核苷酸。引物主要由3部分组成：
（1）核心序列（CORE），该序列与人工接头互补； （2）限制性内切酶识别特异序列（ENZ）； （3）选择性延伸序列（EXT），即引物3端的选择碱
基，选择碱基延伸到酶切片段区。
如：EcoRI引物和MseI引物
纹丰富，灵敏度高，重复性好
（5）不需事先知道DNA序列信息 • 缺点：操作复杂，费用较高
SSR标记
SSR：简单重复序列（simple sequence repeat）多态性 ，也叫微卫星标记。
微卫星：即短串联重复(Short Tandem Repeat，STR)， 它是由2-6bp重复单位构成的DNA序列，通常多态性片 段长度在100-300bp。以人类基因组为例，平均每15-20 kb就存在1个STR座位，据此估计整个人类基因组中大约 有50,000-100,000个STR位点。由于微卫星DNA具有高度 的多态性和遗传稳定性，所以非常适合作为遗传学DNA 分子标记。
基于分子杂交技术的分子标记技术
此类标记技术是利用限制性内切酶解及凝胶电 泳分离不同的生物 DNA 分子，然后用经标记 的特异 DNA 探针与之进行杂交，通过放射自 显影或非同位素显色技术来揭示 DNA 的多态 性。
分子杂交：由具有互补碱基顺序的任何两 条单链核酸分子片断形成双链的过程。
染色体原位杂交
In situ hybridization
For in situ hybridization, a tissue sample is incubated with a labeled nucleic acid probe, excess pro be is washed away and the location of hybridized probe is examined.
织、发育阶段或外界环境的不同而 杂交后电泳带型可直接区别杂合子和显性 数量上几乎不受限制。
RFLP标记缺点
（1）DNA需要量大。 （2）所需仪器较多 （3）技术较为复杂 （4）多数RFLP表现为二态性，提供的信息量较低 （5）与内切酶选用密切相关
RAPD标记
• 1990年，美国杜邦公司科学家Williams推出。 • RAPD方法是在PCR技术基础上发展起来的，它利用一系列单个随机引物（通常为10个核苷
植物DNA 分子标记
分子标记的概念
广义的分子标记（molecular marker）： 可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白。包 括蛋白质标记和DNA标记（狭义的分子标 记）。
蛋白质标记包括动植物蛋白、同工酶及 等位酶
理想的分子标记：
1.高多态性
2.共显性遗传 *
3.能明确辨别等位基因 4.遍布整个基因组
等步骤。
生物能快速、精确地复制自身的DNA，但这种精确 性是相对的。实际上，在植物的自然群体中存在大量 的DNA序列变异。如：碱基对的代换、缺失等。几乎 不可能有两个生物体DNA的碱基序列是相同的。
限制性内切酶酶解DNA长链，是识别DNA上的特异 的位点并在这些位点上切断的过程。酶识别位点碱基 对越少，DNA分子中被识别的位点越多，所产生的限 制片段越短。
DNA扩增指纹印记
（DNA amplification fingerprinting, DAF）
简单序列重复标记（simple sequence repeat, SSR）
随机引物聚合酶链式反应
（arbitrarily primed PCR, AP-PCR）
扩增片段长度多态性标记
（amplified fragment length polymorphism, AFLP）
0.3kb 0.3kb ×
品系1 品 系2
0.5kb
0.3kb 0.2kb
RAPD的基本实验程序
1. DNA的提取 2. 模板DNA浓度和质量的检测 3. PCR扩增 4. 电泳检测：PCR结束后每个样品加4ul凝胶上样缓冲液
，每个泳道点样20ul。 5. 将凝胶浸于1ug/ml的EB中30min~60min，用水清洗约1