荧光分光光度法测定维生素B2的含量

荧光分光光度法测定维生素B2的含量

实验报告

——应用化学（环境检测与分析）

一、实验目的

1、掌握标准曲线法定量分析维生素B2的基本原理。

2、了解荧光分光光度计的基本原理、结构及性能，掌握其基本操作。

二、实验原理

1什么是荧光？

荧光是光致发光。当物质的分子接受光子能量被激发后，从激发单重态的最低振动能级返回基态时发射的光。

2

3 荧光与环境因素的关系

取代基的性质、溶剂的极性、体系的pH和温度。

维生素B2(Vitamin B2)，别名：核黄素(Riboflavin，RF)，是橘黄色无臭的针状结晶,分子式：C17H20N4O6，相对分子量为：376.37。因其色黄且含有核糖醇，故称为核黄素。结构式为：

由于分子中有三个芳香环，具有平面刚性结构，因此它能够发射荧光。维生素B2易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂，在中性或酸性溶液中稳定，光照易分解，对热稳定。

维生素B2溶液在430—440nm蓝光的照射下，发出绿色荧光，荧光峰在535nm附近。维生素B2在pH＝6—7的溶液中荧光强度最大，而且其荧光强度与维生素B2溶液浓度呈线性关系，因此可以用荧光光谱法测维生素B2的含量。维生素B2在碱性溶液中经光线照射会发生分解而转化为另一物质——光黄素，光黄素也是一个能发荧光的物质，其荧光比维生素B2的荧光强得多，故测维生素B2的荧光时溶液要控制在酸性范围内，且在避光条件下进行。

在稀溶液中，荧光强度F与物质的浓度c有以下关系：

F＝2.303ФI0εbc

当实验条件一定时，荧光强度与荧光物质的浓度呈线性关系：

F=Kc

这是荧光光语法定量分析的依据。

三、仪器与试剂

1、主要仪器：荧光分光光度计（日立F—7000）；比色皿：1cm；容量瓶：50mL；移液管：5mL。

2、试剂：核黄素；维生素B2药片

四、实验步骤

1. 溶液的配制

标准溶液的配制：精确称取2 mg核黄素(VB2)，用超纯水于50ml棕色容量瓶中定容

待测液的配制：将维生素B2药片研磨成粉末状，精确称取2mg，用超纯水于50ml棕色容量瓶中定容；

2. 扫描激发光谱和荧光光谱

3. 标准曲线的绘制

在室温条件下，分别吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0标准溶液于50ml棕色容量瓶中定容。用超纯水作空白试样，测定溶液荧光强度值。用所测结果绘制荧光强度(F)对浓度(c)的曲线。

4. 待测液VB2含量的测定及数据处理

五、实验结果及数据处理λex＝442nm

λem＝524nm

VB2标准曲线及药片中VB2含量的测定（大浓度）

VB2标准曲线及药片中VB2含量的测定（稀释到中间浓度）

六、总结、讨论

1、实验注意事项：

（1）配制标准溶液时，为了减少仪器偏差，取不同体积的同种溶液应用同一移液管。

（2）因荧光是从石英池下部通过，所以拿取石英池时，应用手指捏住池体的上部，不能接触下部。清洗样品池后，应先用吸水纸吸干四个面的液滴，再用擦镜纸往同一方向进行轻轻擦拭。

（3）在使用荧光分光光度计时，须按照既定程序进行。在测定系列标准溶液的浓度和荧光强度时，必须按顺序放入测定。

（4）在测试样品时，应注意样品的浓度不能太高，否则由于存在荧光猝灭效应，样品浓度与荧光强度不呈线性关系，造成定量工作出现误差。

2、此次实验，影响标准曲线的线性的主要因素是配制溶液时，操作是否规范、标准。

七、思考题

1、试解释荧光光度法较吸收光度法灵敏度高的原因？

答：由于现代电子技术具有检测十分微弱光信号的能力，并且荧光强度与激发光强度成正比，提高激发光强度也可以增大荧光强度，使测定的灵敏度提高；而吸收光度法测定的是吸光度，不管是增大入射光强度，还是提高检测器的灵敏度，都会使透射光信号与入射光信号以同样的比例增大，吸光度值不会改变，因此灵敏度不能提高。

2、维生素B2在pH=6~7时荧光最强，本实验为何在酸性溶液中测定？

答：因为维生素B2在碱性溶液中经光线照射，会发生分解而转化为光黄素，后者的荧光比维生素B2的荧光强的多。因此，测量时溶液要控制在酸性范围内进行。