平板菌落计数法

平板菌落计数法

（一）目的要求

学习平板菌落计数的基本原理和方法。

（二）基本原理

平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物

充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落

应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取

样接种量即可换算出样品中的含菌数。但是，由于待测样品往往不

易完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可来自样品中

的2～3或更多个细胞。因此平板菌落计数的结果往往偏低。为了清

楚地阐述平板菌落计数的结果，现在已倾向使用菌落形成单位(colony-forming units，cfu)而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。

平板菌落计数法虽然操作较繁，结果需要培养一段时间才能取得，而且测定结果易受多种因素的影响，但是，由于该计数方法的

最大优点是可以获得活菌的信息，所以被广泛用于生物制品检验(如

活菌制剂)，以及食品、饮料和水(包括水源水)等的含菌指数或污染

程度的检测。

（三）器材

1．菌种大肠杆菌菌悬液。

2．培养基牛肉膏蛋白陈培养基。

3．仪器或其他用具1mL无菌吸管，无菌平皿，盛有4.5ml无菌水的试管，试管架，恒温培养箱等。

（四）操作步骤

l．编号

取无菌平皿9套，分别用记号笔标明10-4、10-5、10-6。(稀释度)各3套。另取6支盛有4.5mL无菌水的试管，依次标是10-1、

10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。

2．稀释

用lmL无菌吸管吸取lmL已充分混匀的大肠杆菌菌县液(待测样品)，精确地放0.5mL至10-1的试管中，此即为10倍稀释。将多余

的菌液放回原菌液中。

将10-1试管置试管振荡器上振荡，使菌液充分混匀。另取一支lml吸管插入10 1试管中来回吹吸菌悬液三次，进一步将菌体分散、混匀。吹吸菌液时不要太猛太快，吸时吸管伸人管底，吹时离开液面，以免将吸管中的过滤棉花浸湿或使试管内液体外溢。用此吸管

吸取10-1菌液lmL，精确地放0.5mL至10-2试管中，此即为100倍

稀释。其余依次类推。

放菌液时吸管尖不要碰到液面，即每一支吸管只能接触一个稀

释度的菌悬液，否则稀释不精确，结果误差较大。

3．取样

用三支1mL无菌吸管分别吸取10-4、10-5和10-6的稀释菌悬

液各lmL，对号放入编好号的无菌平皿中，每个平皿放0.2mL。不要

用lmL吸管每次只靠吸管尖部吸0.2mL稀释菌液放入平皿臼，这样

容易加大同一稀释度几个重复平板间的操作误差。

4．倒平板

尽快向上述盛有不同稀释度菌液的平皿中倒入融化后冷却至45℃左右的牛肉膏蛋白胨培养基约15mL/平皿，置水平位置迅速旋动平皿，使培养基与菌液混合均匀，而又不使培养基荡出平皿或溅到平

皿盖上。

由于细菌易吸附到玻璃器皿表面，所以菌液加入到培养皿后，

应尽快倒入融化并于已冷却至45℃左右的培养基，立即摇匀，否则

细菌将不易分散或长成的菌落连在一起，影响计数。待培养基凝固后，将平板倒置于37℃恒温培养箱中培养。

5．计数

培养48h后，取出培养平板，算出同一稀释度三个平板上的菌

落平均数，并按下列公式进行计算，

每毫升中菌落形成单位(cfu)=同一稀释度三次重复的平均菌落数

×稀释倍数×5

一般选择每个平板上长有30~300个菌落的稀释度计算每毫升的含菌量较为合适。同一稀释度的三个重复对照的菌落数不应相差很大，否则表示试验不精确。实际工作中同一稀释度重复对照平板不

能少于三个，这样便于数据统计，减少误差。由10-4、10-5、10-6

三个稀释度计算出的每毫升菌液中菌落形成单位数也不应相差太大。

平板菌落计数法，所选择倒平板的稀释度是很重要的。一般以

三个连续稀释度中的第二个稀释度倒平板培养后所出现的平均菌落

数在50个左右为好，否则要适当增加或减少稀释度加以调整。

平板菌落计数法的操作除上述倾注倒平板的方式以外，还可以

用涂布平板的方式进行。二者操作基本相同，所不同的是后者先将

牛肉膏蛋白胨培养基融化后倒平板，待凝固后编号，并于37℃左右

的温箱中烘烤30min，或在超静工作台上适当吹干，然后用无菌吸

管吸取稀释好的菌液对号接种于不同稀释度编号的平板上，并尽快

用无菌玻璃涂棒将菌液在平板上涂布均匀，平放于实验台上20～

30min，使菌液渗入培养基表层内，然后倒置37℃的恒温箱中培养24～48h。

涂布平板用的菌悬液量一般以0.1mL较为适宜，如果过少菌液

不易涂布开，过多则在涂布完后或在培养时菌液仍会在平板表面流动，不易形成单菌落。