荧光定量实验全流程

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荧光定量PCR实验操作流程

荧光定量PCR实验操作流程1. 检查实验室条件在进行荧光定量PCR实验前，首先要检查实验室的环境是否适合实验。

实验室应该保持干燥、清洁和无菌。

检查PCR仪和读板器是否能正常运转，并准备所有必需的试剂和器械。

2. DNA/RNA的提取和纯化从组织和细胞中提取和纯化DNA/RNA是实验的第一步。

在提取和纯化DNA/RNA的过程中，需要保持无菌和正确的技术。

同时需要注意使用适当的缓冲液和酶切剂，以避免DNA/RNA的损伤和降解。

3. DNA/RNA质量检测检测DNA/RNA的质量和浓度，以确保实验结果的准确性。

可以使用紫外线光谱仪或其他质量检测设备。

同时，需要记录下每个样本的质量和浓度值。

4. 反转录如果需要检测RNA，需要首先进行反转录（Reverse Transcription，RT）。

反转录反应将RNA转录成相应的cDNA，可以使用逆转录酶和随机引物进行反转录反应。

5. 荧光定量PCR反应体系和引物设计荧光定量PCR反应体系包括模板DNA/RNA，荧光探针，引物和PCR反应缓冲液。

引物的设计是至关重要的，需要确保引物与目标序列的特异性和敏感性。

引物的设计可以使用NCBI或其他引物设计软件进行。

6. PCR反应设置PCR反应参数：温度梯度，反应时间和DNA量，浓度和样本装载量等。

注意反应器核心温度的控制，以确保反应的准确性和重复性。

7. 数据分析使用荧光定量PCR的结果进行数据分析。

可以使用数据分析软件，例如GenEx或其他软件。

计算出每个样本的阈值循环数（Ct值），并使用标准曲线法进行定量计算。

总之，荧光定量PCR是一种高灵敏度和高特异性的分子生物学检测技术，不仅可以用于基础研究，还可以用于临床诊断和治疗监测等领域。

在实验前需要认真准备，操作流程中需要注意无菌和正确的技术，以确保实验结果的准确性。

荧光定量PCR原理及实验步骤精选全文

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荧光定量PCR原理及实验步骤
一、实时荧光定量PCR原理
常规PCR技术对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。

实时定量PCR技术，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。

几个概念：
（1）扩增曲线：
（2）荧光阈值：
（3）Ct值：
（4）标准曲线
SYBR Green工作原理：
1、SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位
2、SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光
3、变性时，DNA双链分开，无荧光
4、复性和延伸时，形成双链DNA，SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光
信号。

二、实验步骤
1. 实验前先在大型仪器共享平台上预约多元荧光定量PCR仪。

1、将所需引物和SYBgreen（避光）拿出，解冻。

计算好所有引物和SYBgreen
的用量。

2、反应体系（25μL）如下：
H2O 11μL
SYBgreen 12.5Μl
上游引物0.25μL
下游引物0.25μL
cDNA 1μL
可先将H2O 和SYBgreen按照所需量配好后，分装，再根据需要加引物和模板。

4、加完所有试剂后，盖上盖子，混匀，离心。

上机。

荧光定量PCR实验操作流程

荧光定量PCR实验操作流程1、实验器材多样品研磨珠均质仪台式高速冷冻型微量离心机荧光定量PCR仪超净工作台分光光度计离心管TIP头2、主要实验试剂及耗材RNA提取液三氯甲烷异丙醇无水乙醇引物75%乙醇：HyPure TMMolecular Biology Grade Water配制离心管、TIP头均购湿热灭菌40min，干燥。

二、荧光定量PCR实验步骤1、总RNA抽提（枪头和离心管均经过湿热灭菌，无RNA酶）1）取匀浆器，加入1ml的Trizol Reagent，置冰上预冷。

2）取100mg组织，加入到匀浆器中。

3）充分研磨直至无可见组织块。

4）12000rpm离心10min取上清。

5）加入250 μl三氯甲烷，颠倒离心管15s，充分混匀，静置3min。

6）4℃下12000rpm离心10min。

7）将上清转移到一新的离心管中，加入0.8倍体积的异丙醇，颠倒混匀。

8）-20℃放置15min。

9）4℃下12000rpm离心10min，管底的白色沉淀即为RNA。

10）吸除液体，加入75%乙醇1.5ml洗涤沉淀。

11）4℃下12000rpm离心5min。

12）将液体吸除干净，将离心管置于超净台上吹3min。

13）加入15μl无RNA酶的水溶解RNA。

14）55℃孵育5min。

15)使用UV1800检测RNA浓度及纯度：仪器空白调零后取2.5μl 待测RNA溶液于检测基座上，放下样品臂，使用电脑上的软件开始吸光值检测。

16）将浓度过高的RNA进行适当比例的稀释，使其终浓度为200ng/μl.左右。

2、反转录（枪头和PCR均经过湿热灭菌，无RNA酶）1）取一PCR管，加入含2μg RNA的溶液。

2）加入1μl 逆转录引物。

3）用无核糖核酸酶的去离子水补足至12μl。

4）于PCR仪上65℃保温5min，迅速置冰上冷却。

5）依次加入4μl 5×buffer，2μl 10mM dNTPs，1μl RNA inhibitor和1μl 反转录酶，用枪抽吸混匀。

荧光定量pcr实验步骤

荧光定量pcr实验步骤荧光定量PCR实验步骤引言：荧光定量PCR（qPCR）是一种广泛应用于生物学研究和临床诊断的技术，可用于准确、快速地定量检测DNA的含量。

本文将介绍荧光定量PCR实验的步骤，以及注意事项和数据分析方法。

一、实验准备1. 准备所需试剂和仪器：包括PCR反应体系的各种试剂（如引物、探针、酶等）和实时荧光定量PCR仪。

2. 根据实验设计，制定合适的实验方案。

确定需要扩增的目标序列，设计引物和探针。

二、样品处理1. 提取待测样品中的DNA，确保提取得到高质量的DNA。

可以使用商业DNA提取试剂盒进行提取，按照厂家说明进行操作。

2. 测定DNA的纯度和浓度，确保测量到的DNA适用于PCR扩增反应。

使用比色法或分光光度计检测DNA的纯度和浓度。

3. 对提取得到的DNA进行稀释，以便在PCR反应中使用。

确保稀释后的DNA浓度恰当，以避免PCR反应的干扰。

三、荧光定量PCR反应体系的准备1. 根据实验设计和目标序列的长度，计算出所需的试剂和反应体系的配比。

2. 根据计算结果，将引物、探针和模板DNA按照适当的比例加入PCR反应管中。

注意保持反应管的清洁和无菌。

3. 加入合适的PCR反应缓冲液、酶和核酸酶抑制剂等试剂。

根据实验设计的需要，可以在反应体系中添加适当的试剂，如酶切酶、胶束等。

四、PCR扩增反应1. 将PCR反应管放入实时荧光定量PCR仪中，设置好PCR反应的程序和参数。

通常包括预热、变性、退火和延伸等步骤。

2. 启动PCR反应，开始扩增。

在反应过程中，实时监测PCR产物的荧光信号强度，并记录下来。

五、数据分析与结果解读1. 在实时荧光定量PCR仪中，可以实时获得PCR反应体系中荧光信号的强度和变化趋势。

根据实验设计的需要，可以选择合适的荧光信号通道进行监测。

2. 根据荧光信号和PCR反应的周期数，可以绘制荧光增幅曲线。

通过观察曲线的形态和特征，可以初步判断PCR反应的特异性和效果。

荧光定量PCR操作流程

荧光定量PCR操作流程1.目的基因引物的合成设计合成200-300bp目的基因片段的引物，利用primer 5.0引物设计工具或者手工合成，引物合成过程中注意上下游的Tm值要相似、GC碱基在上下游的引物里均匀、引物与模板序列紧密互补、引物间避免形成稳定的二聚体或发夹结构等事项。

2 总RNA提取（1）准备研钵（灭菌）、离心管（1.5ML），枪头、手套（一次性）、异丙醇、乙醇，三氯甲烷2）取适量家蚕组织，加液氮充分研磨；匀浆加1ml RNAiso Plus后匀浆；3）室温放置5min （可在-70℃下保存1个月）4）加0.2ml氯仿（chloroform），振荡混匀，室温放置5分钟；5）12000g，15min，4℃；6）取上清（约0.6ml），加与上清等体积异丙醇，室温放置10分钟；7）12000g，10min，4℃；8）取沉淀（RNA呈胶状沉淀），加1ml 75%乙醇（可在-20℃保存1年）洗涤；9）12000g，5min，4℃；10）取沉淀，室温干燥10min；11）溶解于DEPC处理水中12）-80℃保存，尽快使用，或在8）保存。

3 反转录（TOYOBO试剂盒）Nuclease-free water up to 10ul5ⅹRT buffer 2ulRT Enzyme Mix 0.5ulPrimer Mix 0.5ulRNA 0.5-1ug4定量PCR反应（本实验室7300系统）SYBR 10ulForward Primer 1ulReverse Primer 1ulROXⅠ 0.4ulc DNA模板2ul一个模板重复三次以尽量减小误差；每个模板都要设内参。

内参是生物体或者细胞中稳定表达的基因，表达量几乎不变。

而后按照试剂盒说明操作流程设定仪器参数即可。

实时荧光定量PCR技术实验操作流程

实时荧光定量PCR技术实验操作流程
1.RNA提取：
针对茎环状结构RT引物，RNA正常提取就好;对于Oligod(T)特异的RT引物，尽量用特殊试剂盒提取miRNA。

2.反转录：
反转录过程对酶没有特殊要求，操作按照反转录酶的说明书进行。

对于引物，在反转录过程中只需加入Oligod(T)特异的RT引物或茎环状结构RT引物，不需要另外添加其他RT引物。

用Oligod(T)特异的RT引物时，RNA需要进行3'Poly(A)加尾处理。

内参基因不需要单独设计RT引物，可以用荧光定量PCR的反向引物作为RT引物。

3.荧光定量PCR：
先优化PCR体系(引物浓度、退火温度等)，进行引物测试，确保扩增曲线正常且溶解曲线为单一的尖峰，阴性对照无扩增，则引物测试合格，再进行后续实验(常规操作)。

实时荧光定量PCR具体实验步骤

实时荧光定量PCR具体实验步骤
实时荧光定量（Real Time quantitative PCR）是检测RNA或DNA的一种常用技术，通过检测特定目标的增加（或减少），可以用来测定RNA 或DNA的表达水平，或者基因等的转录水平。

下面我们就对实时荧光定量PCR(RT-qPCR)的实验步骤进行具体介绍。

1.搭建实验
第一步是搭建实验，即准备实验所需的干燥试剂，第二步是准备RNA 样本，第三步是准备标准曲线，最后是根据实验需要准备实验板和实验试管。

2、RNA样品提取
在实验中，会使用到多种RNAs，一般情况下使用TRIzol或Phenol 抽提方法进行RNA抽提，不同的细胞、组织中RNA的杂质含量不一样，因此需要根据实验需求进行适当调整抽提浓度。

3、RT-qPCR反转录
在RT-qPCR反转录之前，首先要准备反转录试剂，一般采用qPCR反转录试剂盒，这种试剂盒含有足够的反转录荧光探针以及反转录引物，它可以有效帮助反转录过程。

反转录过程通过复制DNA片段的过程完成，最终转录出的cDNA存在细胞核中。

4、qPCR扩增实验
qPCR扩增实验是在反转录完成后进行，一般来说，这个步骤可以采用qPCR扩增试剂盒，该试剂盒中包含所需的扩增物质如DNA聚合酶、前驱核苷酸、dNTPs，检测细胞核中的cDNA。

荧光定量pcr实验流程

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实时荧光定量PCR具体实验步骤

实时荧光定量PCR具体实验步骤1.提取样本RNA/DNA：首先，从研究对象中提取出所需的RNA或DNA样本。

可以使用商业化的提取试剂盒来完成这一步骤。

2. 反转录酶链反应（RT）：如果提取的样本为RNA，则需要先进行反转录酶链反应，将RNA转录成cDNA（即DNA拷贝），反转录酶具有多样性（M-MLV逆转录酶）和过程性（RTase）。

3.准备PCR反应体系：根据实验所需的扩增模板和引物，将PCR反应体系按照厂家提供的信息制备，通常需要包括PCR反应缓冲液、dNTPs、引物、酶、模板DNA/cDNA和稀释水。

4. 调整荧光探针的浓度：如果实验中使用到了荧光探针（如TaqMan探针、MGB探针等），需要根据实验要求对荧光探针的浓度进行调整。

5.放置PCR板：将所需的PCR试管或板放置在适当的位置，以便加载反应体系。

6.反应体系加载：按照实验所需的样品数量和模板浓度，依次向PCR反应管或板中加入反应体系。

注意，需要设置相应的阳性对照和阴性对照。

7.封闭PCR反应管/板：闭合PCR反应管或板，以防止反应体系的挥发和样品的交叉污染。

8.准备PCR仪：根据PCR仪的要求，调整PCR仪的温度和时间参数。

9.PCR扩增：将已封闭的PCR反应管或板放置在预热的PCR仪中，开始PCR扩增。

根据实验需要，设置不同的PCR程序（如热启动PCR、两步PCR和三步PCR等）。

10. 实时监测PCR过程：在PCR反应过程中，实时监测PCR反应管或板中产生的荧光信号，并记录下每个周期（cycle）的荧光值。

11. 数据分析：根据荧光信号的变化，结合标准曲线法或相对表达量法，对PCR反应中目标序列的数量进行定量分析。

常见的分析软件包括Stratagene MxPro QPCR软件和Applied Biosystems SDS软件等。

12.结果分析和解释：根据数据分析的结果，对实验结果进行解释和讨论，并在图表中呈现。

13. 结果验证：可以使用其他方法验证RT-qPCR的结果，如Western blotting、细胞免疫化学分析等。

荧光定量PCR实验操作流程

原液 5 μl （从1号管取） 5 μl（从2号管取） 5 μl（从3号管取） 5 μl（从4号管取）
6
45ul
对照
荧光定量PCR
2. 配制PCR预混反应体系：
做5个样本，配制8个样本的预混体系，配制方式如下：
试剂 2×UltraSYBR Mixture Forward Primer，10 µ M Reverse Primer，10 µ M 配制的8个孔的预混体系 80 μl 6.4 μl 20 μl反应体系 10 μl 0.8 μl
加入体积
2 μl
2 μl
2 μl
2 μl
2 μl
2 μl
5. 混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。 6. PCR反应程序：
步骤预变性变性退火/延伸融解曲线分析温度 95℃ 95℃ 60℃ 95℃ 60℃ 95℃ 60℃ 时间 10min 15s 1 min 15s 1 min 15s 15s 注意事项： 1．首先配制预混体系，再将预混体系分装到八连管中。 2. 稀释模板时，需要混匀。不要直接在八连管管壁或管盖上做标
细胞RNA提取
3. 过柱子：
吸取上层水相，至新的RNase-Free管中（注：不要吸到中层）加入等体积70%的乙醇，颠倒混匀；将溶液全部加入到已装入收集管（CollectionTube 2ml)的吸附柱（Spin• Column RM）中。若一次(700ul)不能加完溶液，可分多次入； 12,000rpm离心20s，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中；
材料：2×UltraSYBR Green Mixture，cDNA，actin引物
实验步骤：
1. 稀释模板：每稀释一个倍数，需要将溶液混匀，并短暂离心。

荧光定量PCR实验步骤

我们在进行荧光定量PCR实验时，学会并掌握具体的实验步骤是成功的关键所在，但是总有很多人因为接触比较少，几乎就不知道具体步骤是怎么样的。

下面，我们就来看看到底是怎么样的吧。

1、取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。

2、两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的lvfang，盖紧管盖。

手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。

4℃下12000rpm离心15分钟。

离心后混合液体将分为下层的红色酚lvfang相，中间层以及无色水相上层。

RNA全部被分配于水相中。

水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。

3、RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。

加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。

此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。

4、RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml 的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制)，清洗RNA沉淀。

混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。

5、RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。

6、溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。

以上内容就是关于荧光定量PCR实验步骤的具体陈述，不懂的地方大家可以网上咨询更加详细的信息，希望能对大家有所帮助。

贝兰伯生物技术（杭州）有限公司是由教授级高工带队，博硕士及十几年生命科学领域的研发、销售团队构成，致力于研发、生产高品质实验室耗材、科研产品，为科研事业贡献力量。

主要包括：如PCR管、离心管、无酶无热源诊断包装瓶，无酶无热源吸头、细胞培养类、酶标板、检测板、深孔板、磁套，用于疫苗、抗体药物、基因治疗药物、细胞治疗药物、蛋白质药物、核酸药物、药物研发与核酸提取等学科研究。

荧光定量pcr操作流程

荧光定量pcr操作流程
荧光定量PCR技术是一种常用的实时PCR技术，可以检测DNA和RNA的含量。

它被广泛应用于病毒检测和转基因研究等。

本文将介绍荧光定量PCR技术的操作流程。

首先，在实验室中准备所需要的实验材料，包括样本，PCR引物，模板DNA，dNTP，DNA聚合酶和实时PCR荧光探针，缓冲液，水等。

其次，将样本进行DNase处理，解析得到模板DNA，将模板DNA 用合适的容量放入每个实验管中，以此来建立实验。

然后，将PCR反应液配制好，将与模板DNA一起放入PCR反应管中，包括PCR引物，dNTP，DNA聚合酶，实时PCR荧光探针，缓冲液，水等。

接下来，将放入PCR反应管中的反应液放入PCR设备里进行反应，PCR反应完毕分为一系列步骤，包括反应温度的上升，溶解和延迟，合成，放大等。

其中最重要的步骤是DNA聚合酶与模板DNA的结合，可加速DNA的复制。

最后，PCR反应完毕后，将反应管中的反应液进行荧光定量，将荧光的强度和弱度绘制成曲线，而反应体系中的DNA含量可以用曲线来测定，从而得出DNA的数量。

以上就是荧光定量PCR技术的操作流程。

它可以检测DNA和RNA 的含量，是实验室中常用的实时PCR技术。

它具有灵敏度高，操作简便，时间节约，可重复性好，可用于病毒检测和转基因研究等。

荧光定量pcr操作流程

荧光定量pcr操作流程荧光定量PCR操作流程。

荧光定量PCR（Quantitative PCR，qPCR）是一种用于定量检测DNA或RNA的技术，通过测定PCR反应过程中的荧光信号来定量目标分子的含量。

本文将介绍荧光定量PCR的操作流程，希望能对相关研究工作者提供一些帮助。

1. 实验前准备。

在进行荧光定量PCR实验前，首先要准备好所需的试剂和设备。

包括PCR试剂盒、引物、模板DNA或RNA样品、荧光定量PCR仪等。

确保所有试剂和设备的质量良好，避免对实验结果产生影响。

2. 反应体系设计。

根据实验需要，设计好PCR反应体系，包括引物浓度、模板DNA或RNA浓度、试剂盒成分等。

合理的反应体系设计是保证实验成功的关键，需要根据目标分子的特性和实验要求进行合理的优化。

3. PCR反应条件设置。

根据所用的PCR试剂盒和目标分子的特性，设置好PCR反应的温度、时间和循环次数等条件。

合理的PCR反应条件能够提高PCR 反应的特异性和效率，减少非特异性产物的形成。

4. 荧光定量PCR仪操作。

将混合好的PCR反应体系加入到荧光定量PCR仪中，按照仪器操作手册设置好检测参数，并启动荧光定量PCR仪进行检测。

在检测过程中，要及时观察荧光信号的变化，并根据实验要求进行数据记录和分析。

5. 数据分析与结果解读。

根据荧光定量PCR仪输出的数据，进行数据分析和结果解读。

通过标准曲线法或绝对定量法，计算出目标分子的含量，并进行结果的统计和图表展示。

同时，对实验结果进行科学的解读和讨论，得出合理的结论。

6. 实验后清理。

实验结束后，要对实验台面和仪器进行清理，保持实验环境的整洁。

同时，对实验数据进行归档和整理，做好实验记录和报告。

以上就是荧光定量PCR的操作流程，希望能为相关研究工作者提供一些参考和帮助。

在进行实验时，一定要严格按照操作流程进行，确保实验结果的准确性和可靠性。

祝实验顺利！。

分子诊断荧光定量pcr流程

分子诊断荧光定量pcr流程
分子诊断荧光定量PCR的流程包括以下步骤：
1. 设计引物：根据目标基因的序列，设计特异性引物。

2. 构建标准品：将已知浓度的目标基因片段进行扩增，构建标准品。

3. 样品处理：对临床样本进行处理，提取出其中的DNA或RNA。

4. 配制反应液：根据荧光定量PCR的反应体系，将引物、探针、模板等组分按照一定的比例混合。

5. 运行程序：将反应液放入荧光定量PCR仪中，运行扩增程序。

6. 结果分析：通过荧光定量PCR仪的软件分析结果，计算出目标基因的拷贝数或浓度。

7. 解读报告：将结果解读为临床意义，为医生提供诊断依据。

请注意，荧光定量PCR技术有实时荧光定量PCR和数字荧光定量PCR等不同的方法，具体流程可能略有差异。

另外，进行荧光定量PCR实验时，需要严格遵守实验室安全要求，防止交叉污染和意外事故的发生。

荧光定量pcr实验步骤

荧光定量pcr实验步骤荧光定量PCR实验步骤荧光定量PCR（Quantitative PCR，qPCR）是一种用于测量特定DNA序列数量的技术。

它可以快速、准确地定量检测目标DNA的含量，广泛应用于基因表达分析、病原体检测、遗传变异分析等领域。

下面将介绍荧光定量PCR实验的步骤。

一、实验前准备在进行荧光定量PCR实验之前，需要做好实验前的准备工作。

1. 设计引物和探针：根据目标DNA序列设计引物和探针，确保其特异性和互补性。

2. 准备模板DNA：从样品中提取目标DNA，并进行纯化和定量。

3. 制备PCR反应体系：根据PCR反应的需要，准备好PCR反应体系，包括引物、探针、模板DNA、Taq DNA聚合酶、缓冲液和dNTP等。

4. 验证引物和探针的特异性：使用目标DNA和非目标DNA进行聚合酶链式反应，通过凝胶电泳验证引物和探针的特异性。

二、荧光定量PCR实验步骤1. 反应体系配置：按照实验设计，配置好PCR反应体系。

将引物、探针、模板DNA、Taq DNA聚合酶、缓冲液、dNTP等加入反应管中，然后加入适量的去离子水。

2. PCR反应条件设定：根据引物和探针的特性，设定PCR反应的温度和时间参数。

一般来说，PCR反应包括预变性、变性、退火和延伸四个阶段，其中变性温度为95℃，变性时间为30秒，退火温度为60℃，退火时间为30秒，延伸温度为72℃，延伸时间根据目标片段的长度而定。

3. PCR反应体系装入仪器：将装有PCR反应体系的反应管放入荧光定量PCR仪器中。

4. 荧光定量PCR实验运行：启动荧光定量PCR仪器，按照预设的PCR反应条件进行PCR反应。

仪器会根据设定的温度和时间参数进行PCR反应，并实时检测荧光信号。

5. 数据分析与结果解读：荧光定量PCR仪器会自动记录PCR反应过程中的荧光信号，根据荧光信号的变化可以计算出目标DNA的数量。

通过对比不同样品的荧光信号差异，可以定量分析目标DNA 的含量。

荧光定量PCR操作流程总结

荧光定量PCR操作流程总结荧光定量PCR操作流程一、RNA提取准备物品：无RNA酶大中小枪头；一套枪；trizol试剂；无RNA 酶EP管（1.5mL、200uL）；DEPC水；氯仿；75%DEPC乙醇；异丙醇等1、1mLTrizol样品加200uL氯仿，用力晃动15s2、冰上静置5min3、4℃12000rpm 离心15min4、小心吸取上清水相400-500uL至新的无酶EP管5、按照体积1:1加异丙醇，颠倒混匀6、置于冰上30min7、4℃12000rpm 离心10min8、倒掉上清，加入500uL75%DEPC乙醇，轻弹管底使RNA沉淀漂起9、4℃12000rpm 离心5min10、吸上清弃掉，尽量吸干净11、12000rpm 离心5min12、吸上清弃掉，尽量吸干净，开盖超净台内凉置5min13、每管加20uLDEPC水溶解，弹管底使溶解混匀14、56℃助溶10min15、置于冰上测RNA浓度（Gen5 核酸检测执行）16、擦手纸蘸蒸馏水擦RNA浓度检测板加样孔，再用擦镜纸擦干17、1234孔各加2uLDEPC水，检测，本底为绿色即可继续测样本（2uL）18、依次按编号加入2uL样本，软件关闭后重新打开，选择样本检测19、批准出结果260/280=1.8-2则样品合格二、反转录qPCR准备物品：无RNA酶大中小枪头；无RNA酶EP管（1.5mL、200uL）；RTmix；DEPC水1、计算1000ng（反转录RNA上样量1000ng）的RNA体积，必要时稀释2、反转录体系20uL（RTmix 4uL ；RNA样品约2uL ；DEPC水补齐20uL ）3、弹管底混匀瞬时离心4、Bio-rad 中间选项takaraRT run 16min5、dd水稀释cDNA，使cDNA浓度约为10ng/uL，100uL分装后-20℃保存三、荧光定量PCR准备物品：8联管；引物；cDNA；200uLEP管；无菌枪头1、引物稀释dd水溶解稀释引物，旋涡混匀，引物储存浓度10nM/uL2、定量PCR10uL体系引物F 0.4uL引物R 0.4uLcDNA 1uL(终浓度为1ng/uL)SYBR 5uL(含染料、DNA扩增酶、DNTP、Mg2+、扩增缓冲液等)dd水3.2uL3、布板一个指标三个重复4、取10个200uL无酶EP管，按顺序编号123456789105、按照一个指标：六个孔+2个孔（防止枪误差导致各孔不均）=8孔的剂量配制混合：引物F 0.4uL*8=3.2 uL引物R 0.4uL*8=3.2 uLSYBR 5uL*8=40 uLdd水3.2uL*8=25.6 uL6、按照布板依次加入8联管中（置于冰上），最后每孔加1 uLcDNA（P5 P10 cDNA不同），设置不加cDNA模板的阴性对照。

荧光定量PCR实验使用方法

第一部分一、基本步骤：1、目的基因（DNA和mRNA）的查找和比对；2、引物、探针的设计；3、引物探针的合成；4、反应体系的配制；5、反应条件的设定；6、反应体系和条件的优化；7、荧光曲线和数据分析；8、标准品的制备；二、技术关键：1、目的基因（DNA和mRNA）的查找和比对；从/网点的genbank中下载所需要的序列。

下载的方式有两种：一为打开某个序列后，直接点击“save”，保存格式为“.txt”文件。

保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、序列的注册号。

然后，再打开DNAstar软件中的Editseq软件，点击“file”菜单中的“import”，打开后点击“save”，保存为“.seq”文件。

另一种直接用DNAstar 软件中的Editseq软件，点击“file”菜单中的“open entrez sequence”，导入后保存为“.seq”文件，保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、序列的注册号。

然后要对所有的序列进行排序。

用DNAstar软件中的Seqman软件，点击“sequence”菜单中的“add”，选择要比较的“.seq”的所有文件，点击“add”或“add all”，然后点击“Done”导入要比较的序列，再点击“assemble”进行比较。

横线的上列为一致性序列，所有红色的碱基是不同的序列，一致的序列用黑色碱基表示。

有时要设定比较序列的开始与结尾。

有时因为参数设置的原因，可能分为几组(contig)，若想全部放在一组中进行比较，就调整“project”菜单下的“parameter”，在“assembling”内的“minimum math percentage”默认设置为80，可调低即可。

再选择几个组，点击“contig”菜单下的“reassemble contig”即可。

选择高低的原则是在保证所分析的序列在一个“contig”内的前提下，尽量提高“minimum math percentage”的值。

荧光定量实验全流程

荧光定量实验全流程一. RNA提取准备工作1. 1mL、200ul、10ul枪头盒，浸泡在0.1% DEPC处理水中过夜，报纸包好高压灭菌，入烘箱烘干。

2. 配制0.1%DEPC水，0.1%DEPC水=1000ml双蒸水+1ml DEPC，通风橱放置过夜，高压灭菌，灭菌时将瓶盖拧松但不脱落，灭菌结束后迅速将瓶盖拧紧，冷却至室温后放入4℃冰箱冷却，使用前在超净台内分装成小管待用，避免污染。

3. 配制75%乙醇（DEPC水配置），配好放入4℃冰箱预冷保存。

4. 氯仿、异丙醇4℃冰箱预冷。

注意：DEPC试剂毒性较强，操作时注意做好防护措施，避免吸入和溅到皮肤，浸泡枪头盒的0.1% DEPC处理水需要高压灭菌后才能倒入下水道。

二、提取RNA1. 磨样：将组织样品在研钵中磨成粉，装入有1ml Trizol 的1.5ml无菌无酶EP 管中，震荡混匀，静置5-10min；细胞样品直接加入1ml 预冷的Trizol，震荡混匀，静置5min。

2. 装有样品的1.5ml EP管中加入200ul 氯仿，震荡1min，冰上静置5min，离心（12000g，4℃，10min）3. 离心后液体分层：上层无色液体（RNA）,中层白色（DNA），下层红色（protein）。

小心吸取上层无色液体，不要触碰到中层白色，加入新的无菌无酶EP管中，约400ul。

4. 加入等体积的异丙醇（400ul），混匀，用力震荡，冰上静置10-15min，离心12000g，4℃，15min）5. 弃掉上清液，加入1ml 75% 乙醇，振荡，洗涤，离心8000g，4℃，10min）6. 重复步骤5洗涤7. 小心弃去上清液，超净台内EP管倒置在滤纸上干燥使75%乙醇完全挥发。

8. 根据RNA沉淀大小，加入适量0.1%DEPC水反复吹打直至溶解，50ul左右。

9. 测定RNA浓度三、RNA电泳鉴定RNA很容易讲解，跑电泳的时候也容易降解，最好换新的电泳液。

荧光定量PCR检测实验流程

荧光定量PCR检测实验流程
荧光定量PCR是检测生物样品中RNA含量的最普遍的方法，通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。

目前主要使用Sybr green和taqman法对RNA含量进行检测。

Sybr green在低样本量时成本较低，目前选用的较多。

SYBR Green I是一种只与DNA双链结合的荧光染料。

当它与DNA双链结合时，发出荧光；从DNA双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱。

因此，在一个体系内，其信号强度代表了双链DNA分子的数量。

SYBR Green荧光染料法定量PCR的基本过程是：1、开始反应，当SYBR Green染料与DNA双链结合时发出荧光。

2、DNA变性时，SYBR Green染料释放出来，荧光急剧减少。

3、在聚合延伸过程中，引物退火并形成PCR产物。

4、聚合完成后，SYBR Green染料与双链产物结合，定量PCR系统检测到荧光的净增量加大。

实验流程：细胞或组织RNA提取-RNA浓度检测-RNA逆转录-定量PCR检测。

结果示例：
图 A 基因扩增曲线图；B 基因扩增溶解曲线图；C mRNA相对表达量变化
从图中可以扩增曲线可以看出目的RNA扩增效果，溶解曲线可以看出引物识别特异性情况，通过使用ΔΔCt方法计算可以得到每个组中目的mRNA表达变化。