免疫电镜技术

• 羟丙基/甲基丙烯酸酯（基本成分） • 乙二醇丙烯酸酯（交连固化剂） • 苯甲酸烷基乙醚（激活剂,引发剂）
低温（-20~-40 °C),紫外光照射下,自由
基链式反应
R1.+ .R2
R1 R2 + R3
R1. R2 .
R1 R2 R3
注意事项
• 称量要准确，尤其量少的 • 搅拌时避免产生气泡（O2自由基聚合阻聚剂） • 使用无色透明胶囊（无色明胶或聚酯胶囊） • 包埋剂加满加盖 • 用具全部预先冷却
免疫电镜方法 (Immunoelectron microscopy)
电子显微镜的基本知识
用电子束代替可见光作为照射源的一种显微装置 透射电镜(transmission electron microscope)
电子束照射标本,收集穿透标本的电子,通过电子透 镜成像并放大,可显示物体超微结构的形态. 扫描电镜(scanning electron microscope) 电子束在样本上逐点进行扫描,收集样本产生的二 次电子进行成像,可显示物体表面和立体的形态.
• 制备免疫电镜超薄切片 免疫标记
免疫电镜超薄切片的制备
• 低温包埋超薄切片法 • 冰冻超薄切片法
1.冷固定
• 取材 • FA+GA固定液中4°C， 2~3h(中间1-2h可取
出修块) • 封闭游离醛基（0.5M NH4Cl in 0.1M PB）
4°C， 2h • 冲洗（0.18M蔗糖in 0.1M PB） 4°C 2h或过
凝集素
凝集素-凝集素受体
凝集素受体
酶
酶-底物
底物
Anti-Biotin
抗Biotin-Biotin核酸
（原位杂交）
探针-核酸
核酸序列
免疫电镜技术:通过（抗原和抗体）特异亲和 反应实现对细胞化学组分的确认与定位
抗原——抗体 激素——受体 糖基——植物凝集
素
（免疫电镜技术最常用）
免疫电镜样本制备
电镜样本
chromogranin A
电镜标记方法：抗原-抗体的特异结合（狭义）
所有高亲和力的特异结合（广义）
被标记物
特异结合反应
研究对象
种属特异抗体
ⅡAb-ⅠAb-Ag
抗原
Protein A
蛋白A-ⅠAb-Ag
抗原
Anti-Biotin
抗Biotin-BiotinⅡAb
-ⅠAb-Ag
抗原
配体
配体-受体
受体
30%
30m 0°C 冰水中 加些盐
50%
60m -20°C 低温冰
箱
70% 90% 60m 60m -20~ -20~ -40 °C -40 °C
100% 100% 60m 60m -20~ -20~ -40 °C -40 °C
*注意事项:
• 脱水剂对抗原的灭活作用随温度降低，但不能 低到脱水剂结冰的温度，所以应选择结冰温度 低的脱水剂
？
（以20g为例） 单体：17.3g 交联剂：2.7g 激活剂：0.1g
乙醇+包埋剂 乙醇+包埋剂
1 ：1
1 ：2
60m
60m
纯包埋剂 60m
纯包埋剂 60m
-20~-40 °C -20~-40 °C -20~-40 °C -20~-40 °C
照射源 成像装置
放大倍数 分辨率
透射电镜
电子束 电磁透镜 (磁场\电场) 1,000×~60万 0.2nm
光镜
可见光 光学透镜 玻璃 40×~2,000 200nm
Kidney
Muscle
Carcinoma
Culture cell
SARS virus
rotaviruse
免疫电镜技术: 在超微结构水平研究（确认与 定位）细胞化学组分及变化的方法
固定剂
结构保存 抗原活性保
存
FA
好
常用
GA
不用或少用
锇酸
好
不用
固定剂(fixative)
①多聚甲醛(paraformaldehyde) 4% in PB
②混合固定液：多聚甲醛
2-4%
戊二醛
0.01- 0.5%
PB/二甲砷酸钠 0.1M(PH7.4)
③PLP固定液： 多聚甲醛：
2%
赖氨酸（lysine）
组织或游离细胞内抗原
• 需对样品进行特殊处理－增加膜的通透性 固定剂+1%Triton X100，10-20min 0.1MPB冲洗，10min 0.5% 1%Triton X100，30min 0.1MPB冲洗，10min －接包埋前法标准程序
包埋后法：
• 适用： 组织细胞（内或外）抗原 游离细胞内部抗原
夜中间换液2~3次
* 常规电镜标本可在冲洗液中存放1~2周，但免疫电镜
标本不行， 因为GA浓度很低微细结构变化大 * 一般采用2℃～4℃冷固定；这样能降低细胞的自溶作
用和水分的抽提
2 .低温脱水
• [目的]去除样品中的水，为包埋剂（水溶性） 的均匀浸透做准备
• 脱水剂：乙醇，甲醇，异丙醇，乙醚，或丙酮 （梯度脱水）
• 预先冷却好全部用具
3. 浸透与包埋
[目的]使包埋剂浸透样品后，固化成硬块 低温包埋剂：丙稀酸类，水溶性
不含环氧基 低温下可聚合 两种： Lowicryl K4M(德国)：紫外线照射下聚合 LR White(英国)：55 ℃ 聚合,不需紫外线照射
低温(0-4℃)聚合，需用加速剂
低温包埋剂（Lowicryl K4M）
0.075M
Sodium periodate
0.01M
PB
0.037M
包埋前法（优先）：
适用情况： • 离散细胞表面抗原的标记 • 冰冻断裂样品 • 扫描电镜样品
包埋前法步骤：
例：离散细胞表面抗原的标记 • 离心 • 缓冲液清洗 • 固定（视抗原） • 免疫标记 • 固定，包埋（常规电镜样品制备）
• 常规电镜：形态结构 • 免疫学方法： 组分 • 免疫电镜：形态结构+组分
免疫电镜延伸了免疫光镜 免疫化学技术与电镜技术结合的产物
在超微结构水平定位某些分子: Ag, 受体
Pancreas
Ultrastructure and chromogranin A immunogold labelling of ECL cell carcinoids. APMIS 113: 506–12, 2005
电镜可见的免 疫反应
透射免疫电镜技术
• 包埋前法（先组分，后制样）： 先进行定位反应，再制备超薄切片
• 包埋后法（先制样，后组分）： 先制备超薄切片，再进行定位反应
扫描免疫电镜技术
免疫电镜要解决的两个问题
• 免疫电镜标本的结构保存与抗原ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ性 保存问题——二者经常矛盾
• 在电镜下显示抗体的合适的标记物