蛋白纯化方案

蛋白纯化方案

一、离子交换层析

1.1原理：蛋白质的等电点是进行离子交换层析的重要依据；离子交换剂与蛋白质的结合。

1.2方法步骤：

1、离子交换树脂的选择

类型包括：阴、阳离子交换树脂、强离子交换树脂和弱离子交换树脂；层析时液相流速要适中，让蛋白有足够的时间吸附在树脂上；树脂吸附容量在10%-20%，一般选用强离子交换树脂，它能够提供更好的重现性。

2、树脂的准备和层析柱的填装

干燥树脂以大约十倍体积量的样品缓冲液（如10g树脂+100ml样品缓冲液）。柱高对一般层析而言，只需为柱直径的2倍，装柱要谨慎，必须一次性完成。高精度层析时柱高为柱直径的4-5倍。

3、样品上柱

样品溶液首先通过离心分离或用0.45ul孔径滤纸过滤而成为澄清溶液。

4、洗柱和目的蛋白的洗脱

选择合适的洗脱条件，利用梯度洗脱法将目的蛋白从树脂上洗脱下来，因为梯度洗脱（步骤见梯度式洗脱）可使不同蛋白质的分离更加彻底。

1.3蛋白质的等电点未知

确定蛋白质等电点最常用的方法是等电聚焦电泳。通过氨基酸序列推测出的等电点常与表观等电点相差一个单位。

当蛋白质因不纯而不能进行等电聚焦电泳时，要确定溶液PH值得简单方法步骤如下：

上清中不存在目的蛋白时就是所需PH。

蛋白浓缩

一般离子交换层析浓缩（见浓缩步骤）的回收率可达60%-80%，与硫酸铵沉淀法相当。超滤法浓缩的回收率则可达到95%。

二、凝胶过滤层析

又称为大小排阻、凝胶排阻、分子筛等，是利用分级分离，而不需要蛋白质化学结合，就明显降低了因不可逆结合所致的蛋白质损失和失活。采用了离子交换层析，那么凝胶过滤法是下一步的理想纯化方法，因为这两种分离方法在原理上互补。

选择窄分离范围的填料分离分子量相近的蛋白质可以达到一个较好的分离效果。；而分离一个未知分子量蛋白，则需要一个宽分离范围的填料。

2.1应用于以下几个方面：

1、分子量测定

2、去除低分子量的杂质

3、从二聚体或其他寡聚体中分离目的蛋白

4、更换蛋白质的缓冲液

2.2样品分离操作：

（1）、选择填料

根据蛋白质分子量，选择具有相应分离范围的凝胶

（2）、确定层析柱尺寸

计算所需填料的体积，一般分析分离或分级分离上样量是柱床体积的1%-5%

柱直径=（m/10cm）1/3其中m是蛋白的质量（mg）

柱长度=柱直径x30

（3）、选择缓冲液

选择相应的缓冲液，一般中等离子强度的缓冲液有助于消除蛋白质与凝胶可能产生的相互作用。

（4）、层析

具体选取的层析柱正在查找各文献，近期汇报！最近提取粗酶和找到合适PH，跑电泳等同步进行！