原位杂交探针设计原则
原位探针的制备
(一)探针的种类RNA探针是指带有标记的能与组织内相对应的核苷酸序列互补结合的一段单链cDNA或cRNA分子.根据在RNA杂交中所使用的探针依其来源可分为三种：即特异性cDNA、cRNA探针和人工合成寡核苷酸探针.1. 单链cDNA探针: 由于cDNA中不存在内含子及其它高度重复序列，又克服了双链cDNA 探针在杂交反应中两条链之间复性的缺点,从而提高了杂交反应的敏感性。
但由于单链cDNA 探针的制备比较困难,在RNA原位杂交中已很少见有应用.2. cRNA探针：是以cDNA为模板，通过体外转录而获得的。
因为它是一种单链探针，因此也避免了应用双链cDNA探针做杂交反应时存在的两条之间的复性问题。
cRNA与RNA之间形成的杂交体要比cDNA－RNA杂交体稳定。
cRNA－RNA之间形成的杂交体不受RNA酶的影响。
因此杂交反应后可用RNA酶处理,以除去未结合的探针。
由于cRNA探针具有以上这些优点,cRNA探针的杂交饱和水平又比双链DNA探针高出8倍，因此在原位杂交中应用广泛。
cRNA探针的缺点是：探针的制备过程比较复杂，需要较好的分子生物学实验设备,它对RNA 酶敏感,易受破坏，操作中要谨防RNA酶污染。
3. 寡核苷酸探针：人工合成的寡核苷探针是以核苷酸为原料，通过DNA合成仪合成，避免了真核细胞中存在的高度重复序列带来的不利影响。
由于大多数寡核苷酸序列较短，不需要纯化，组织穿透性极好。
根椐目的基因的特异性序列设计的探针，特异性较强。
合成的寡核苷酸探针的缺点是：探针长度必须适宜,探针太长可造成内部错误配对杂交，探针太短可形成非特异性结合。
它与mRNA形成的杂交体不如cRNA－RNA杂交体稳定，再则探针较短,所携带的标记物少，敏感性较低。
依标记物不同，探针又可分为同位素标记探针和非同位素标记探针两大类.前者主要包括3H 、35C、32P和125I等,不同的同位素探针其穿透力,定位和半衰期各不相同,无一种同位素探针具有穿透力强、定位好和半衰期长所有优点。
原位杂交
原位杂交试剂1.Buffer I溶液试剂剂量Tris-HCl 7.882gNaCl 4.4g纯水至500ml 混匀，调pH至7.5，室温保存。
2.Buffer Ⅱ溶液试剂剂量Buffer I溶液10mlBlocking(索莱宝公司) 0.1g调pH至8.0，水浴溶解，过滤除菌分装，-20℃保存。
3.Buffer Ⅲ溶液试剂剂量Tris-HCl 7.882gNaCl 3gMgCl2·6H2O 5.1g纯水至500ml混匀，调pH至9.5，室温保存。
4.2×SSC试剂剂量20×SSC 100ml纯水至1000ml混匀，室温保存。
5.1×SSC试剂剂量20×SSC 50ml纯水至1000ml混匀，室温保存。
6.0.1×SSC试剂剂量1×SSC 100ml纯水至1000ml混匀，室温保存。
7.蛋白酶K稀释液试剂剂量Tris-HCl 7.882gEDTA 7.3g纯水至500ml混匀，调pH至8.0，室温保存。
原位杂交1．探针构建由上海生工生物工程有限公司合成本实验所用的探针。
合成好的探针粉末用无核酶水溶解，浓度为0.5μg/μl。
2．探针标记探针标记体系如下（10μl）：试剂剂量合成的探针2μlDig RNA 1μl10×Buffer缓冲液1μlRNA聚合酶（SP6/T7）1μlDTT（100mM）1μlRI 0.5μl无核酶水至10μl混匀，37℃水浴1h。
后加入2μl DNA酶I，37℃水浴15min，降解模板DNA。
再加入2μl EDTA （0.2M）终止反应。
加入1/10体积的LiCl（4M）及2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀后置于-20℃冰箱过夜、沉淀。
第二天，4℃，12000×g离心15min，弃去上清。
用预冷的75%乙醇洗一次，4℃，12000×g离心1min，吸尽上清，晾干。
溶于50μl无核酶水中，待完全溶解后分装，-80℃保存。
荧光原位杂交 综述
荧光原位杂交（FISH）综述摘要本文简单介绍了荧光原位杂交（FISH）技术的一些基础理论知识以及常用操作方法和步骤。
关键词：荧光原位杂交;1.发展荧光原位杂交（fluorescent in situ hybridization，FISH）是一种细胞遗传学技术，可以用来对核酸进行检测和定位。
荧光标记的核酸探针只和具有高度相似性的核酸杂交，可用于染色体上基因的定位，或在分子生态学中用来标记不同分类细菌或古菌中的核糖体RNA[1]。
1969年，Pardue等和John两个研究小组发明了原位杂交技术，放射性标记的DNA 或28s RNA 被杂交到细胞制备物上，通过放射自显影技术(m icroautoradiography, MAR)检测杂交位点，这一技术可以在保持细胞形态完整性的条件下，使核酸序列在细胞内被检测[2]。
2.原理通过特定分子的荧光标记探针在细胞内与染色体上特意的互补核酸序列原位杂交，通过激发杂交探针的荧光来检测信号。
由于荧光燃料收到一定波长的（即激发波长）的光激发后会发射荧光（即发射波长），所以就滤光镜选择合适的激发波长的光，即可显示某一特定的荧光染料，于是就可以直接显示特定细胞核中或染色体上的DNA序列间相互位置关系[2]。
原位杂交的处理：染色体上杂交的位点提供了DNA探针序列的定位信息。
所以应用该方法时，需打开维持染色体DNA双螺旋结构的碱基配对以使其形成单链分子（这称为DNA变性）。
只有这样染色体DNA才能与探针杂交。
变性染色体DNA而不破坏其形态的标准方法是将染色体干燥在玻璃载玻片上，再用甲酰胺处理[1]。
3.关于探针的发展早期原位杂交技术中探针是放射性标记的，但这个方法并不令人满意，因为放射性标记很验证同时满足灵敏度和分辨率这两个原位杂交成功的必要条件。
灵敏度要求放射性标记具有高中辐射能（例如用32P标记），当标记物能量过高时，会因为信号散射导致分辨率过低。
如果使用低辐射能的放射性标记物，如3H可以得到较高的分辨率，但由于灵敏度低而需要长时间曝光，并由此导致背景过高，难以分辨出真正的信号。
原位杂交的基本方法
原位杂交的基本方法一、组织的取材注意事项：刀要锋利、不能用力向下挤压组织；组织块不宜过大、及时固定。
二、固定（一）原则：及时固定、避免RNA酶的污染4％多聚甲醛（0.1M PBS PH7.4，可加1/1000的DEPC）,动物实验标本最好先灌流固定。
（二）固定液的浓度、固定时间及温度要适宜1 浓度越高组织结构保存的越好，但mRNA的保存越差；2 固定时间越长，mRNA破坏的越多；做原位杂交组织固定时间不宜过长，一般24h，不能高温固定（微波可使组织内温度升高），低温可保护RNA不降解（4 ℃冰箱内固定）。
mRNA杂交：最好用冰冻切片a. 4％多聚甲醛中固定1－2h，浸入15%蔗糖溶液中4℃冰箱过夜，次日切片或保存在液氮中。
b. 取材后直接液氮冷冻，切片后4％多聚甲醛固定10min，空气干燥后－70 ℃低温冰箱保存。
注意：a. 多聚甲醛与戊二醛混合固定的组织可同时用作光、电镜检查，但不能用于原位杂交实验。
b. 石蜡切片蛋白质交联影响探针穿透，包埋降低mRNA含量三、玻片和组织切片的处理玻片的处理：洗涤：洗涤剂→水洗→洗液（24h）→水洗→双蒸水洗→60 ℃烤干→250 ℃烘烤4h，锡箔纸包裹无尘存放。
玻片硅化：将烘烤过的载玻片用2％APES丙酮液浸泡3min →用丙酮洗两次→用DEPC处理过的蒸馏水洗1～2次→40 ℃烘干→防尘保存待用。
（整个过程要戴消毒手套进行）未经硅化的玻片可以涂粘附剂（多聚赖氨酸）2.增强组织的通透性和核酸探针的穿透性：稀释的酸洗涤、去垢剂Triton X-100或消化酶（蛋白酶k、胃蛋白酶），用量及孵育时间视组织的种类、固定剂的种类及切片的厚薄而定。
为保持组织结构，可用4％多聚甲醛再固定。
3.降低背景染色：杂交后的酶处理和杂交后的洗涤。
预杂交：预杂交液不含探针和硫酸葡聚糖，可封闭非特异性杂交点。
杂交后用低浓度RNA酶溶液洗涤一次，以减少残留的内源性RNA。
4.防止RNA酶污染：整个杂交前处理过程都需戴消毒手套，所有实验用玻璃器皿和镊子于实验前一日200 ℃烘烤。
原位杂交探针设计原则
原位杂交探针设计原则-CAL-FENGHAI-(2020YEAR-YICAI)_JINGBIAN原位杂交探针大体可分为三类：寡核苷酸探针，cDNA探针，RNA探针。
寡核苷酸探针由25bp左右的核苷酸组成，通常可以由公司合成，由于其序列较短，因此特异性较强，原位杂交时可以区分家族基因，同一基因的不同剪切体，cDNA探针长约500bp左右，可以通过非对称PCR扩增合成，由于探针式DNA，可以有效的避免降解，但DNA和RNA的结合不如RNA与RNA结合强，通常不采用，RNA探针长约500bp左右，通过体外转录合成，如果设计合理，其特异性是可以得到保证的，其主要缺点是容易被RNAse酶降解。
查看原位杂交相关的文献发现，2000年以前的原位杂交常使用放射性标记的寡核苷酸探针，通过胶片曝光来显色，2000年以后的文献常使用RNA探针。
许多肾脏发育的文献虽然有很多原位杂交数据，但却没有附带上探针序列或者用于探针模板克隆的引物，通过了解厦门黄老师斑马鱼和昆明毛炳宇爪蟾中原位杂交探针设计方法，我们可以采用RNA探针。
文献中很难找到关于RNA探针设计的原则，有的文献报道直接用cDNA合成RNA探针。
借鉴爪蟾中原位杂交探针设计流程，以小鼠FGF10的探针设计为例进行介绍。
1.在NCBI数据库中下载该FGF10的mRNA全序列，然后用FGF10的全长在NCBI中进行BLAST比对分析，比对数据库选择mouse genome+transcript，比对程序选择somewhat similar sequence。
Zebrafish seqRNAs得出的比对结果中有一幅图谱，显示比对序列与数据库中序列的相似性，探针应设计在与其它基因不存在明显相似性的区段，在比对结果的图谱中选择可变区。
如下图黑色框区域。
2.估计黑色框碱基在FGF10 mRNA中的大致范围，在这个范围内选择长约500bp的序列设计探针。
根据上图信息，我们选择FGF103000~3800的范围进行探针设计。
微生物荧光原位杂交实验技术
微生物荧光原位杂交实验技术背景微生物荧光原位杂交实验技术是在原位杂交技术的基础上发展而来的。
原位杂交技术最早应用于染色体分析，后来逐渐应用于微生物检测领域。
随着荧光标记技术的不断发展，人们开始利用荧光标记探针进行原位杂交，从而提高了检测的灵敏度和特异性。
原理微生物荧光原位杂交实验技术的原理是利用特定的荧光标记探针与细胞中的微生物进行杂交，从而将微生物定性和定量地检测出来。
该技术的基本原理是碱基互补配对原则，即探针的序列与待测微生物的序列互补，从而形成稳定的杂交双链。
利用荧光检测仪器检测荧光信号，从而实现对微生物的定量和定位分析。
实验方法样品的制备：将待测样品进行处理，使微生物细胞分离并保持活性。
探针的制备：将特定的DNA或RNA片段进行标记，形成荧光探针。
杂交反应：将样品和探针在一定条件下进行杂交反应，形成杂交双链。
洗涤和干燥：去除未结合的探针和杂质，保持杂交信号的特异性。
荧光检测：利用荧光检测仪器检测样品的荧光信号，并对数据进行处理和分析。
实验结果通过微生物荧光原位杂交实验技术，我们可以得到样品的定性和定量数据。
实验的成功率较高，特异性较强，能够清晰地检测出目标微生物的存在和数量。
该技术的灵敏度较高，可以检测出低拷贝数的微生物基因，为研究提供了有力的工具。
实验讨论微生物荧光原位杂交实验技术具有许多优势，如高特异性、高灵敏度和能够保持细胞结构的完整性等。
然而，该技术也存在一些不足之处，如探针制备过程较为繁琐、杂交反应条件要求较高以及荧光检测仪器价格昂贵等。
荧光探针的稳定性也可能影响实验结果的可靠性。
因此，在应用该技术时需要注意这些因素，并选择合适的探针和实验条件，以保证实验结果的准确性和可靠性。
结论微生物荧光原位杂交实验技术在研究领域具有广泛的应用前景。
除了在微生物检测方面的应用，该技术还可以应用于其他领域，如基因表达分析、细胞凋亡研究等。
虽然该技术存在一些不足之处，但随着技术的不断发展和优化，相信未来会有更多的应用前景等待着我们去探索和发现。
荧光原位杂交探针设计
荧光原位杂交探针设计荧光原位杂交探针（Fluorescence in situ hybridization probes）是一种用于检测和定位细胞或组织中特定DNA或RNA序列的方法。
它是一种高度敏感且特异的技术，广泛应用于生物医学研究和临床诊断领域。
本文将介绍荧光原位杂交探针的设计原理和方法，并探讨其在科学研究和医学诊断中的应用。
1. 荧光原位杂交探针的原理荧光原位杂交探针的设计基于亲和性配对原理。
DNA或RNA的序列与其互补的探针序列发生特异性结合，形成稳定的双链结构。
探针序列的标记物（通常是荧光染料）可以通过显微镜观察到，从而确定目标序列的存在和位置。
2. 荧光原位杂交探针的设计方法荧光原位杂交探针的设计通常包括以下步骤：（1）目标序列选择：根据研究目的选择需要检测的DNA或RNA序列。
（2）探针序列设计：根据目标序列设计互补的探针序列，通常长度在20-50个碱基对之间。
（3）标记物选择：选择合适的荧光染料或其他标记物，以便在显微镜下观察到探针序列的信号。
（4）探针合成：利用化学方法合成标记物修饰的探针序列。
（5）杂交反应：将探针与待检测的样品（细胞或组织）进行杂交反应，使探针与目标序列结合。
（6）信号检测：利用荧光显微镜或其他适当的检测方法观察和记录探针信号。
3. 荧光原位杂交探针的应用荧光原位杂交探针在生物医学研究和临床诊断中有广泛的应用，包括：（1）基因定位：可以确定染色体上特定基因的位置和数量，研究基因组结构和功能。
（2）肿瘤诊断：可以检测肿瘤细胞中的染色体异常和基因突变，提供肿瘤分类和预后评估的依据。
（3）细胞遗传学研究：可以观察到细胞中染色体的数目和结构变化，研究细胞遗传学过程。
（4）病原体检测：可以检测病原体的存在和数量，用于感染性疾病的诊断和监测。
荧光原位杂交探针是一种强大的工具，可以帮助科学家和医生了解细胞和基因组的结构与功能，为疾病的诊断和治疗提供重要的信息。
随着技术的不断发展和创新，相信荧光原位杂交探针将在更多领域展现其巨大潜力，并为人类健康做出更大的贡献。
简述原位杂交的原理及应用
简述原位杂交的原理及应用1. 原位杂交的原理原位杂交是一种基因组杂交技术，它可以用来研究基因组的组成、结构和功能。
原位杂交的原理是通过将一组标记有探针的DNA片段与目标DNA样品进行杂交反应，然后使用适当的探针检测方法来识别和定位目标DNA序列。
原位杂交的基本原理包括以下几个步骤：1.DNA探针制备：3’-OH末端标记方法和末端标记方法是两种常用的DNA探针标记方法。
常用的标记有生物素、荧光物质等。
2.DNA杂交反应：将标记好的DNA探针与目标DNA样品进行杂交反应。
杂交反应的温度、时间以及混合物的浓度需要根据具体实验目的进行优化。
3.杂交后的探针检测：可以使用放射性同位素标记、荧光染料标记等方法对杂交后的DNA探针进行检测，以确定杂交反应是否成功。
4.观察和分析：通过显微镜等工具观察杂交结果，并对杂交位点进行定位和分析，获取目标DNA序列的位置和数量。
2. 原位杂交的应用2.1. 基因组结构研究原位杂交技术可以用来研究基因组的结构，包括基因的数量、排列、序列和重组等信息。
通过特定的探针标记和杂交反应，可以对基因组进行定位和分析，帮助了解基因组的组成和结构。
2.2. 染色体显带分析原位杂交被广泛应用于染色体显带分析领域。
通过核酸探针的杂交，可以识别和鉴定染色体上的特定DNA序列，从而确定染色体的结构和功能。
这对于检测染色体异常和疾病的相关基因有着重要意义。
2.3. 基因定位和图谱构建原位杂交可用于基因定位和构建基因图谱。
通过使用特定的探针标记和杂交方法，可以将目标基因定位到染色体上的特定区域，并确定其在染色体上的位置。
这为进一步研究基因的功能和相互作用提供了基础。
2.4. 个体识别和物种鉴定原位杂交技术可用于个体识别和物种鉴定。
通过探针的杂交反应，可以确定个体或物种特定基因的存在与否，从而进行个体识别和物种鉴定的工作。
2.5. 植物杂交育种原位杂交可以应用于植物杂交育种领域。
通过对目标植物基因组的杂交分析，可以鉴定合适的亲本植物并进行精确的杂交操作。
原位杂交实验原理
原位杂交实验原理带有标记的（有放射性同位素，如3H、35S、32P、荧光素生物素、地高辛等非放射性物质)DAN或RNA片段作为核酸探针，由于核酸探针的种类和标记物的不同，在具体使用的技术方法上也各有差异，但其基本方法和使用原则大致相同。
大致可分为：①杂交前准备，包括固定、取材、玻片和组织的处理，如何增强核酸探针的穿透性、减低背景染色等；②杂交；③杂交后处理；④显示（visual－ization）：包括放射性自显影和非放射性标记的显色。
a) 固定原位杂交组织化学技术（In Situ Hybridization Histochemistry, ISHH）在固定剂的使用和选择上应兼顾到三个方面：保持细胞结构，大限度地保持细胞内DNA或RNA的水平；使探针易于进入细胞或组织。
DNA是比较稳定的，mRNA是相对稳定的但易为酶合成和降解。
RNA却绝然不同，非常容易被降解。
因此，对于DNA的定位来说，固定剂的种类和浓度并不十分重要。
相反，在RNA的定位上，如果要使RNA的降解减少到低限度，那么，不仅固定剂的种类浓度和固定的时间十分重要，而且取材后应尽快予以冷冻或固定。
在解释ISHH的结果时应考虑到取材至进入固定剂或冰冻这段时间对RNA保存所带来的影响，因组织中mRNA的降解是很快的。
在固定剂中，常用的是多聚甲醛。
和其它的固定剂（如戊二醛）不同，多聚甲醛不会与蛋白质产生广泛的交叉连接，因而不会影响探针穿透入细胞或组织。
其它如醋酸-酒精的混合液和Bouin’s固定剂也能获得较满意的效果。
对于mRNA的定位，我们常采用的方法是将组织固定于4%多聚甲醛磷酸缓冲液中1～2h，在冷冻前浸入15%蔗糖溶液中，置4℃冰箱过夜，次日切片或保存在液氮中待恒冷箱切片机或振荡切片机切片。
组织也可在取材后直接置入液氮冷冻，切片后才将其浸入4%多聚甲醛约10min，空气干燥后保存在-70℃。
如冰箱温度恒定，在-70℃可保存数月之久不会影响杂交结果。
原位杂交的原理和应用
原位杂交的原理和应用原位杂交（in situ hybridization）是一种分子生物学技术，用于在细胞或组织中检测特定的核酸序列。
它的原理是通过标记的探针与待检测样品中的靶序列发生互补配对，然后通过适当的方法进行可视化。
原位杂交技术广泛应用于基因表达定位、染色体结构与功能研究、细胞分化和发育过程等领域。
1. 探针的选择：根据待检测的靶序列，可以设计相应的DNA或RNA 探针。
DNA探针一般选择长度为100-1000bp的片段，而RNA探针则通常为全长或部分序列。
探针可通过放射性标记或非放射性标记进行标记。
2.可视化标记：常用的标记技术有放射性标记（如32P或35S）和非放射性标记（如荧光染料、酶标记或生物素-亲和素标记）。
不同的标记方式适用于不同的应用领域。
3.杂交条件：为了使探针与靶序列完全匹配，必须优化杂交条件，包括温度、盐浓度、杂交液成分和时间等。
适当的杂交条件可以提高探针与靶序列的互补配对效率。
4.可视化和检测：杂交后，可以根据探针的标记方式选择不同的可视化方法。
放射性标记的探针可以通过暗室放射自显影或闪烁计数等方法进行检测，而非放射性标记的探针则需要使用适当的染色剂或显微镜观察。
1.基因表达定位：通过原位杂交技术，可以在组织或细胞水平上确定特定基因的表达位置。
这对于研究细胞分化、发育和疾病机理等方面具有重要意义。
例如，在肿瘤组织中，可以使用特定的探针定位癌基因的表达位置，从而帮助了解癌症的发生和发展过程。
2.核型分析：原位杂交可以用于染色体结构与功能的研究。
通过将特定探针与染色体的特定区域进行杂交，可以准确地确定染色体的位置和结构，进而了解染色体的功能和相关疾病。
3.细胞分化与发育研究：原位杂交可以用于研究细胞分化和发育过程中的基因表达变化。
通过将探针与分化或发育相关的基因进行杂交，可以确定这些基因在特定阶段的表达模式，从而揭示细胞分化和发育的机制。
4.检测病毒或微生物感染：原位杂交可以被用来检测病毒或其他微生物在细胞或组织中的感染。
荧光原位杂交技术(fish)的基本原理和应用_理论说明
荧光原位杂交技术(fish)的基本原理和应用理论说明1. 引言1.1 概述荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ Hybridization，简称FISH）是一种广泛应用于生物学研究的重要技术。
它通过在细胞或组织水平上定位和检测特定DNA或RNA序列的分布情况，可以提供关于基因组结构、功能和表达的有价值信息。
该技术最早于20世纪80年代被开发出来，并且经过不断改进与扩展，如今已成为分子生物学研究中不可或缺的工具之一。
1.2 文章结构本文将首先介绍荧光原位杂交技术的基本原理，包括DNA探针的选择与设计、杂交反应条件的优化以及检测与可视化方法。
然后，我们将深入探讨荧光原位杂交技术在生物医学研究领域、植物遗传研究领域和动物进化研究领域的应用实例。
接下来，我们将评述荧光原位杂交技术的优势与局限性，包括其高灵敏度、高分辨率等优势以及对样本处理要求高、无法确定基因功能等局限性。
最后，我们将给出结论并展望荧光原位杂交技术的未来发展方向。
1.3 目的本文的目的是系统地介绍荧光原位杂交技术的基本原理和应用领域，以帮助读者深入了解这一重要技术。
通过阅读本文，读者将能够全面了解荧光原位杂交技术在生物学研究中的作用和意义，并对该技术的优势与局限性有所了解。
此外，本文也将探讨该技术未来可能的发展方向，为读者提供展望与思考。
2. 荧光原位杂交技术基本原理:2.1 DNA探针的选择与设计:荧光原位杂交技术（FISH）是一种利用DNA或RNA分子作为探针，通过特异性互补配对识别和定位目标序列的方法。
在进行FISH实验时，首先需要选择合适的DNA探针。
DNA探针通常由由人工合成的寡聚核苷酸（oligonucleotide）或从天然来源提取得到的全长DNA片段构建而成。
选择DNA探针时，需要考虑以下因素：首先是目标序列的特异性，即该序列在待检测样品中是否具有较高的丰度，并且只存在于感兴趣的目标区域中。
其次是探针长度和两个主要互补区域之间核苷酸序列的碱基组成比例。
原位杂交
T7, 5’
反义探针的合成 3’ , SP6
T7, 3’
5’ , SP6
5. 温和碱性水解（碳酸钠/碳酸氢钠），以调 整探针长度（探针终长度100bp）（可选， 小于500 bp可不进行水解）
-70℃保存
6. 探针半定量
• 用RNA 稀释缓冲液稀释对照探针（罗氏合 成试剂盒Vial 5，100 ng/μl）和自己合成 的探针 ，点膜，抗体，显色。
杂交前将杂交液加热至45 ℃，以利于展布。
覆膜，湿盒，42-50℃，杂交过夜。
五、洗片（免疫组织学操作）
• 洗去杂交液； • RNase处理，降解吸附的探针； • RNase缓冲液清洗：专用器皿 • 低严谨洗： 2×SSC • 高严谨洗： 0.1×SSC
六、检测（室温）
• 封闭：防止抗体的非特异性结合。覆膜，湿盒 Blocking solution BSA washing solution
玻璃板
加灭菌水
展片台
• 切片刀、毛笔、展片台：用氯仿擦拭 • 切片厚度7μm • 专用载玻片（Sigma）（涂有多聚赖氨酸） • 在载玻片的磨砂面用铅笔注明材料名称 • 蜡带要彻底展平 • 用DEPC处理的小滤纸片吸去多余水分 • 烘片：高温烘烤过的铝饭盒中，42℃， 36-48h • 4 ℃保存，备用（应在一周之内进行杂交）。
XXX 反
XXX 正
三、组织预处理（RNA操作）
• 切片脱蜡进水 • 4%多聚甲醛后固定， 4℃ • 0.2M HCI处理（蛋白质变性） • 蛋白酶K处理（5-10 μlg/ml）：37℃，30分钟（关键
步骤）
• 甘氨酸处理（终止蛋白酶K 反应） • 乙酰化：防止探针非特异性结合（降低背景） • 预杂交（不加探针）：湿盒，载玻片覆膜，42℃ 1-2
原位杂交探针的制备
原位杂交探针制备步骤1.转录模板的选取：选取目的基因中150-1200bp 长短的无ployA尾巴的非保守区段为模板。
如果模板长度大于500bp, 杂交前需要将探针进行温和碱水解，小于500bp 探针杂交前则可不进行碱解。
2.转录模板的制备：因为转录模板的纯度直接影响着探针合成的质量和数量，所以一般用质粒纯化试剂盒提取质粒。
首先，将模板DNA片断连接到pGEM-T easy 克隆载体上, 转化大肠杆菌，经酶切或PCR 鉴定甚至测序以后，挑取目的克隆（模板最好为反向连接，将来用T7转录酶合成anti－sense 探针，用SP6转录酶合成sense探针。
模板正向连接时用SP6转录酶合成anti－sense探针，用T7转录酶合成sense探针）于30ml LB液体培养基(含50mg/l Amp) 中37℃, 200rpm 过夜（约16小时）。
待菌液浓度约为5.0 A600 U/ml 时可以提取质粒。
3.转录模板线性化：先取少量的质粒溶液，用载体上的合适的多克隆位点的限制性内切酶进行酶切。
限制性内切酶切断后必须为5'突出或平端, 严禁采用3'突出的限制性内切酶（如实在只能用3'突出的限制性内切酶，则可在酶切后用T4 DNA聚合酶或大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段在4种dNTP存在下消除3'突出端）。
转录模板中应没有同样的酶切位点。
载体上只有一个酶切位点。
可用的限制性内切酶只有NcoI、SpeI、NdeI。
酶切后，电泳检测，如果酶切结果正常，就可以大量酶切模板。
一般选用100－150μl酶切体系。
4. 转录模板的纯化将四管酶切产物合并一起（1.5ml 离心管），（从此时起一直到杂交结束，要进行严格的RNA操作）用DEPC•H2O将总体积补到为600-700μl。
①12000 rpm离心5 min。
取水相；②再加入等体积氯仿（RNA用）12000rpm离心5min，取水相；到新的离心管中。
荧光原位杂交(FISH)探针的制备及其应用
荧光原位杂交（FISH）探针的制备及其应用概述1、克隆性染色体异常是肿瘤的特征2、染色体异常常见的类型3、染色体异常的检测方法二、荧光原位杂交及其探针1、荧光原位杂交的原理2、荧光原位杂交的探针三、荧光原位杂交探针的制备和荧光原位杂交（按试验流程介绍）一、概述1、克隆性染色体异常是肿瘤的特征1914年德国遗传学家Boveri就提出染色体畸变与肿瘤起源相关，然而这还仅仅只是一个假说；1960年Nowell和Hungerford在7例慢性髓系白血病（chronic myeloid leukemia，CML）的患者中发现后来被称为费城染色体（Philadelphia chromosome）的微小染色体；1973年Rowley证实了Ph染色体是9号和22号染色体易位所致，这是人们在肿瘤中认识到的第一个染色体易位；目前，已经有11,500篇文献报道了55,600多种克隆性细胞遗传学异常。
这些染色体畸变，尤其是染色体易位及其相应的融合基因在肿瘤致病的起始阶段有着重要的作用，无不说明克隆性细胞遗传学异常是肿瘤的特征，在肿瘤起源中起重要作用。
下图是各种疾病报告的克隆性染色体异常病例数2、染色体异常的常见类型染色体异常指数目异常和结构异常两类：前者包括整条染色体数目的扩增和缺失；后者包括染色体易位、插入、倒置、区带的缺失或扩增等。
下图是染色体数目异常染色体结构异常3、染色体异常的检测方法染色体异常的识别得益于二十世纪六十年代后发展起来的胰蛋白酶－姬姆萨染色和常规显带技术，使得常规筛查全基因组染色体异常和检测染色体核型改变成为可能。
染色体显带是细胞遗传学分析技术中标准和常用的方法，但耗时且依赖于获得良好的分裂相，还难于分析复杂和隐匿的异常。
PCR或荧光原位杂交（FISH，fluorescent in situ hybridization）对染色体异常的检出依赖于引物或探针与模板的结合，因此较常规显带具有更高的特异性，是高通量检测染色体异常的敏感和特异的方法。
原位杂交实验
原位杂交实验1 探针的设计与合成1)根据实验室已有的p8基因cDNA全长序列，用premier primer5.0设计引物p81和p82，以卤虫cDNA为模板，PCR扩增得到346bp的产物，用T akara胶回收试剂盒回收纯化。
引物编号引物序列长度p81 TGCGGACGAAACAGGAAG 18 bpp82 GCTCAAACAGTGATGCCAGT 20 bp2)目的片段克隆a. 在无菌离心管中加入连接载体的各种成分，载体与片段的摩尔比控制在1:3-1:8，根据凝胶电泳检测后的浓度及载体与片段分子大小来计算摩尔比。
加入成分及比例如下：目的PCR片段 5 μlpGM-T载体（约50ng/uL） 1 μl10×T4 DNA Ligation Buffer 1 μlT4 DNA Ligase（3U/uL） 1 μl无菌去离子水 3 μl总体积10 μlb. 轻轻弹动离心管以混合内容物，短暂离心。
置于PCR仪中16℃过夜连接，反应结束后将离心管置于冰上。
c. 向铺好的含有氨苄青霉素的固体平板表面加入16 μl的IPTG（50mg/ml）、40 μl的X-gal （20mg/ml），使用无菌的弯头玻璃棒将其均匀的涂开，避光置于37℃培养箱1-3小时，使溶解X-gal的二甲基甲酰挥发干净。
d. 将10 μl的连接产物加到100 μl DH5 感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴半小时，将离心管置于42℃水浴90秒，取出管后立即置于冰浴上放置2-3分钟，其间不要摇动离心管。
向离心管加入500 μl 37℃预热的LB（不含抗生素）培养基，150rpm摇床37℃振荡培养45分钟。
目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。
将菌液于4000g下离心10分钟，去掉上清，加入100 μl培养液重溶并加入到配制好的LB固体培养基上，用无菌的弯头玻璃棒轻轻将细胞均匀涂开。
待平板表面干燥后，倒置平板，37℃培养12-16小时。
原位杂交技术的原理及应用
原位杂交技术的原理及应用1. 原位杂交技术的概述原位杂交技术是一种用于研究基因组结构和功能的重要工具。
它基于两个主要原理：互补配对和探针标记。
通过互补配对，可以使DNA探针与目标DNA的特定序列发生结合。
探针通常被标记为荧光染料或放射性同位素，以便检测和定位。
2. 原位杂交技术的工作原理原位杂交技术的工作原理可以分为以下几个步骤：2.1 产生探针首先，需要产生特定序列的DNA探针。
这可以通过PCR扩增、限制性内切酶消化和合成等方法来实现。
探针的选择应根据研究需求和目标DNA的序列来确定。
2.2 标记探针为了使探针可视化和定位，需要对其进行标记。
常用的标记方法包括荧光标记和放射性同位素标记。
荧光标记通过使用特定的荧光染料，使探针在显微镜下可见。
放射性同位素标记则通过使用放射性同位素来标记探针，然后通过放射性计数器来检测和定位。
2.3 杂交反应将探针与目标DNA进行杂交，使它们发生互补配对。
杂交条件的选择取决于目标DNA的性质和探针的序列。
通常，在一定温度和盐浓度下，探针与目标DNA可以形成稳定的双链结构。
2.4 洗涤和检测完成杂交后，需要将非特异性的探针从样品中洗涤掉，以减少干扰和背景信号。
然后，使用显微镜观察或放射性计数器检测探针的信号。
荧光标记的探针可以通过荧光显微镜观察到特定位置的信号强度和分布情况，而放射性同位素标记的探针可以通过放射性计数器测量到辐射信号的强度。
3. 原位杂交技术的应用原位杂交技术在生物学研究中有广泛的应用，主要包括以下几个方面：3.1 基因定位和染色体映射原位杂交技术可以用于确定基因在染色体上的位置并进行染色体映射。
通过将特定序列的探针与目标DNA进行杂交，可以确定基因在染色体上的位置和分布。
这对于基因组研究、疾病基因的定位以及基因组结构和功能的理解都具有重要意义。
3.2 突变检测和基因表达分析原位杂交技术可以用于检测基因突变并分析基因的表达模式。
通过使用特定的突变探针或转录探针，可以检测到特定基因的突变或表达模式。
rna原位杂交的主要实验过程及应用
rna原位杂交的主要实验过程及应用RNA原位杂交（in situ hybridization）是一种用于检测细胞或组织中特定RNA序列的方法。
它主要包括以下实验过程：1. RNA样本固定：细胞或组织样本通常需要被固定在载玻片上，常用的固定剂包括乙醛、乙酰丙酮、PFA等。
2. 去除脂质：在固定的样本中，脂质会干扰RNA与探针的结合，因此需要用脱脂剂去除脂质。
3. 探针制备：选择目标RNA序列的互补序列作为探针，并进行标记，通常标记方式有放射性同位素标记（例如32P、35S）和非放射性标记（例如荧光标记、酶标记）。
4. 杂交：将探针与样本进行杂交，杂交通常在高温下进行，以促进RNA与探针的结合。
5. 洗脱：为了去除非特异性结合的探针，通常进行一系列的洗脱步骤，洗脱条件可以根据具体的实验目的进行调整。
6. 可视化与检测：如果探针采用放射性标记，可以将载玻片放置于感光胶片上，在放射性衰变的辐射下使胶片曝光，然后显影胶片以检测探针的信号；如果探针采用非放射性标记，可以直接通过荧光显微镜观察探针的发光信号。
RNA原位杂交主要应用于以下领域：1. 研究基因表达：可以确定细胞或组织中特定基因的表达模式，帮助揭示基因的功能和调控机制。
2. 分析细胞类型和结构：可以确定细胞或组织中特定RNA序列的分布情况，帮助研究细胞类型和组织结构。
3. 病理学研究：可以检测病理变化相关基因的表达水平，帮助了解疾病的发生机制和进展过程。
4. 发育生物学研究：可以追踪特定RNA序列在发育过程中的表达变化，帮助研究胚胎发育和器官形成的分子机制。
综上所述，RNA原位杂交是一种重要的实验技术，可以用于研究细胞和组织中特定RNA序列的表达模式及其在生物学和医学领域的应用。
RNA原位杂交是一种研究基因表达的常用技术，通过将标记有特定探针的RNA与细胞内目标RNA进行杂交反应，用于确定RNA在组织或细胞中的位置和表达水平。
其主要实验过程如下：1. 制备RNA探针：根据研究对象的RNA序列设计合适的探针，可以使用放射性标记，如32P或35S，或非放射性标记，如荧光标记（如FITC，Cy3等）。
RNA原位杂交中的探针处理
RNA原位杂交中的探针(一)探针的种类RNA探针是指带有标记的能与组织内相对应的核苷酸序列互补结合的一段单链cDNA或cRNA分子。
根据在RNA杂交中所使用的探针依其来源可分为三种：即特异性cDNA、cRNA 探针和人工合成寡核苷酸探针。
1. 单链cDNA探针：由于cDNA中不存在内含子及其它高度重复序列，又克服了双链cDNA 探针在杂交反应中两条链之间复性的缺点，从而提高了杂交反应的敏感性。
但由于单链cDNA探针的制备比较困难，在RNA原位杂交中已很少见有应用。
2. cRNA探针：是以cDNA为模板，通过体外转录而获得的。
因为它是一种单链探针，因此也避免了应用双链cDNA探针做杂交反应时存在的两条之间的复性问题。
cRNA与RNA之间形成的杂交体要比cDNA－RNA杂交体稳定。
cRNA－RNA之间形成的杂交体不受RNA 酶的影响。
因此杂交反应后可用RNA酶处理，以除去未结合的探针。
由于cRNA探针具有以上这些优点，cRNA探针的杂交饱和水平又比双链DNA探针高出8倍，因此在原位杂交中应用广泛。
cRNA探针的缺点是：探针的制备过程比较复杂，需要较好的分子生物学实验设备，它对RNA酶敏感，易受破坏，操作中要谨防RNA酶污染。
3. 寡核苷酸探针：人工合成的寡核苷探针是以核苷酸为原料，通过DNA合成仪合成，避免了真核细胞中存在的高度重复序列带来的不利影响。
由于大多数寡核苷酸序列较短，不需要纯化，组织穿透性极好。
根椐目的基因的特异性序列设计的探针，特异性较强。
合成的寡核苷酸探针的缺点是：探针长度必须适宜，探针太长可造成内部错误配对杂交，探针太短可形成非特异性结合。
它与mRNA形成的杂交体不如cRNA－RNA杂交体稳定，再则探针较短，所携带的标记物少，敏感性较低。
依标记物不同，探针又可分为同位素标记探针和非同位素标记探针两大类。
前者主要包括3H 、35C、32P和125I等，不同的同位素探针其穿透力，定位和半衰期各不相同，无一种同位素探针具有穿透力强、定位好和半衰期长所有优点。
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原位杂交探针大体可分为三类：寡核苷酸探针，CDNA探针，RNA探针。
寡核苷酸探针由25bp左右的核苷酸组成，通常可以由公司合成，由于其序列较短，因此特异性较强，原位杂交时可以区分家族基因，同一基因的不同剪切体，cDNA探针长约500bp左右，可以通过非对称PCR扩增合成，由于探针式DNA，可以有效的避免降解，但DNA和RNA的结合不如RNA与RNA结合强，通常不采用，RNA探针长约500bp左右，通过体外转录合成，如果设计合理，其特异性是可以得到保证的，其主要缺点是容易被RNAse酶降解。
查看原位杂交相关的文献发现，2000年以前的原位杂交常使用放射性标记的寡核苷酸探针，通过胶片曝光来显色，2000年以后的文献常使用RNA探
针。
许多肾脏发育的文献虽然有很多原位杂交数据，但却没有附带上探针序列或者用于探针模板克隆的引物，通过了解厦门黄老师斑马鱼和昆明毛炳宇爪蟾中原位杂交探针设计方法，我们可以采用
RNA探针。
文献中很难找到关于
RNA探针设计的原则，有的文献报道直接用cDNA合成RNA探针。
借鉴爪蟾中原位杂交探针设计流程，以小鼠FGF10的探针设计为例进行介绍。
1.在NCBI数据库中下载该FGF10的mRNA全序列，然后用FGF10的全长在NCBI中进行BLAST 比对
分析，比对数据库选择mouse genome+transcript，比对程序选择somewhat similar
sequenee 。
Zebrafish seqRNAs
Choose Search Set
O Human genomic 卑transcript @Mouse genom c ■+ trans匚「ipt O Others (nr etc.)
Manse genomic plus hanscript Mcuss G+T
Prcarain Selection
Opiimire for0 Highly similar sequences i mega blast)
0 More dissi milar sequences [discontiguous meg ablaut)
® Somev/hat similar sequences iblastn)
Choose a BLAST algorithm ■&
得出的比对结果中有一幅图谱，显示比对序列与数据库中序列的相似性，探
针应设计在与其它基因不存在明显相似性的区段，在比对结果的图谱中选择
可变区。
如下图黑色框区域。
Que ry
Color key tor alignment scores
<404Q-5O50 -80SQ-200 >=200
9001800270036004500 2.估计黑色框碱基在FGF10 mRNA中的大致范围，在这个范围内选择长约
500bp的序列设计探针。
根据上图信息，我们选择FGF103000~3800的范
围进行探针设计。
agcac agaggcacaa tgctttggtt tatgggtata ggttgcattt
3301 tgtggtgttc tttcaacttg ttttctgaca aatgggattt ttaaaatgta tacttcttgt
3361 ggttggattc tgtatgttag agtttaattg gtaactgagt ctaaaggctc taatgtaatg
3421 aatctctaga agaactaggt atcttttttt acttttattt taaaataata attatacctg
3481 acacatgacc atggaccacc cacaaccaaa attaaatgtt tggggagaca aactatagta
3541 ttcagtgaca agggtaacag caaatagtgc agacgttgga ttcttatttc actttgccat
3601 ttagattact aaagagacta tgtgtaaaca gtcatcatta tagtactcaa gacattaaac
3661 agcttctagc aaaatgtatc aaagcttgca gagtccaaaa atagaaaaca tctttccccc
3721 tctcccaccc tacatttccc cctgtatgca tcctaacaga gat 底纹标注的为弓丨物
3.将设计好的探针序列在UCSC上再次比对分析，genome选择mouse,
query type选择translated RNA，点击submit，保证搜索出的条目只有目标基因，如果存在其它非目标匹配项（既不是来自FGF基因的序列），则需
要重新选择一段探针序列。
BLAT S^iirch Genome
你可以点击browser 浏览一下所设计的探针序列是否是
FGF10的序列以及
所在位置。
J-广旳 I mun -■ vour sequencgfrom|l at search VourSeci . UCSC on RefSe^, uni Prof, G^nEank, CCDS and
RefSeq Genes
在选择探针序列时，尽量选择 3'端的区域，避开可能的选择性剪切，同时也 要避免mRNA 的末端序列，因为可能存在翻译终止序列，影响以后的体外 转录效率。
经过上述分析后，探针序列可以较好的避免家族基因的保守序 列，确保特异性。
我们可以针对每个基因设计两个探针，后面比较一下哪个探针杂交效果最 Genatne - Query 匕W Assembly Eort airtyiit - OiTtpjt type :
| Eulnit ] Im feding lucky。