原位杂交实验详解
原位杂交技术的操作详解及小贴士
原位杂交技术的操作详解及小贴士原位杂交技术是一种基因组分析方法，用于确定一些特定DNA序列在细胞或组织中的位置。
该技术可以帮助研究人员了解基因组的结构和功能，以及基因在不同细胞类型中的表达模式。
下面将详细介绍原位杂交技术的操作步骤及一些建议。
操作步骤：1.准备DNA探针：首先需要选择合适的DNA探针，用于与目标DNA序列杂交。
DNA探针可以是标记有荧光分子或放射性同位素的DNA序列，用于在杂交后的图像检测或放射计数。
2.制备标本：从目标细胞或组织中提取DNA，并进行适当的处理步骤以便于杂交反应。
其中的处理步骤包括固定、裂解、脱氧核酸酶处理等。
3.杂交反应：在杂交缓冲液中，加入DNA探针和标本DNA，并进行杂交反应。
杂交条件（包括温度、时间和盐浓度等）会根据探针和目标序列的碱基配对特性进行选择。
对于不同的实验目的，例如检测靶基因在组织中的表达模式，杂交条件需要根据实验要求确定。
4.洗涤：在杂交反应结束后，需要进行洗涤步骤以去除非特异杂交的DNA。
通过在高温、高盐浓度或低温条件下进行洗涤，可以选择性地去除未与目标DNA序列配对的DNA。
5.可视化和成像：根据DNA探针的标记方式，采用不同的方法进行可视化和成像。
对于荧光标记的探针，可以使用荧光显微镜观察，并通过分析图像来确定特定DNA序列的位置。
对于放射性标记的探针，可以使用辐射自显像片、液闪仪或放射计数仪等设备进行检测和计数。
小贴士：1.选择合适的探针：为了获得准确的结果，选择合适的探针非常重要。
探针的特异性和亲和力会直接影响到杂交的特异性和效率。
因此，在设计和合成探针时，需要考虑目标DNA序列的长度、特异性和亲和力等因素。
2.优化杂交条件：杂交条件的优化对于获得准确的结果非常重要。
温度、盐浓度和杂交时间是影响杂交反应的重要因素。
通过调整这些条件，可以增强目标DNA和探针的碱基配对能力，提高杂交特异性和效率。
3.正确选择洗涤条件：洗涤步骤的正确选择可以帮助去除非特异杂交的DNA。
原位杂交步骤自己整理的精讲
原位杂交步骤自己整理的精讲原位杂交是一种常用的实验方法，可以用来检测DNA或RNA序列在细胞或组织中的分布情况。
这种方法可以帮助研究人员确定基因在染色体上的位置，并研究基因的表达和调控。
下面是原位杂交的详细步骤：1.样品处理：首先，需要提取并处理样品中的细胞或组织。
这一步骤通常包括细胞固定、组织切片和蛋白酶处理等。
细胞固定能够保持细胞的形态和结构，而组织切片则能够使得样品更容易进行观察和分析。
蛋白酶处理的目的是通过消化蛋白质来提高核酸的可达性。
2.探针设计：在进行原位杂交之前，需要准备一个能够与目标DNA或RNA序列互补配对的探针。
这个探针通常是由DNA或RNA序列构建而成的，可以通过人工合成或PCR扩增获得。
在设计探针时，一般要考虑到探针的长度、碱基组成和互补性等因素。
3.标记探针：为了便于后续的检测，需要将探针标记上报告标记物。
常用的报告标记物有荧光染料、放射性同位素和酶等。
标记探针的方法通常包括非放射性标记和放射性标记两种方式，具体选择哪一种方法取决于实验的需求和要求。
4.杂交反应：将标记好的探针与样品中的DNA或RNA序列进行杂交反应。
这种反应通常在固定样本上进行，样品和探针会在适当的杂交缓冲液中反应一段时间。
杂交反应的温度和时间会根据探针的长度和互补性等因素进行调节。
反应结束后，通常需要进行洗涤以去除未结合的探针和杂交缓冲液。
5.可视化和分析：经过洗涤之后，探针与目标DNA或RNA序列杂交形成的杂交体可以通过其中一种方法进行可视化和分析。
常用的方法包括荧光显微镜观察、放射性测量和酶活性检测等。
通过这些方法，可以确定目标序列在样品中的分布情况和数量。
除了上述的基本步骤，还可以根据实验的具体要求进行一些改进和优化。
例如，可以采用双标记法来同时检测不同序列的分布情况；可以使用探针混合标记法来提高检测的灵敏度和特异性；可以用信号扩增技术来增加检测的信号强度等。
总体来说，原位杂交是一种常用的实验方法，可以用于研究基因的定位和表达。
原位杂交技术的操作详解及小贴士
原位杂交技术的操作详解及小贴士原位杂交技术是一种重要的遗传学技术，用于研究基因组的结构、组织和表达。
它可以帮助科学家确定特定基因在染色体上的位置，探索基因在细胞和组织中的活性等信息。
本文将详细介绍原位杂交技术的操作步骤，并分享一些实验中常见的小贴士。
原位杂交的基本原理是将一段与所研究基因序列互补的DNA探针标记上荧光分子等信号物质，然后与待测细胞或组织样品进行杂交反应。
通过观察探针与靶DNA的结合情况，可以确定所研究基因在染色体的位置和组织中的表达情况。
下面是一般的原位杂交实验步骤：1.样品处理：首先，需要准备待测细胞或组织样品。
可以选择直接从动植物或细菌中提取DNA，或采用组织切片的方式。
样品处理的目的是提高探针与靶DNA的结合效率。
2.探针的制备：制备一段与所研究基因互补的DNA探针。
可以通过PCR扩增、化学合成或转录反应等方法制备探针。
为了方便后续观察，可以将探针标记上荧光物质如荧光染料、辣椒素或金纳米颗粒等。
3.免疫组化：为了提高探针与样品中的靶DNA的杂交效率，可以进行免疫组化步骤。
这一步主要是使用特定抗体识别并结合待测物质，如甲醛固定、蛋白酶K处理等。
4.模板DNA的制备：将样品中的DNA固定在载玻片上，通常使用甲基化醛或戊二醛确定DNA在载玻片上的位置。
5.杂交反应：将制备好的探针与固定在载玻片上的DNA进行杂交反应。
这一步通常需要对探针和靶DNA进行变性和再结合等步骤。
6.信号检测：通过显微镜观察杂交产物，在适当的波长下观察荧光信号。
可以使用荧光显微镜或共聚焦显微镜等设备。
接下来，我们来分享一些原位杂交技术的小贴士：1.设计合适的探针：选择合适的探针非常重要。
探针的长度应该足够长，以确保与靶DNA的特异性结合。
此外，为了提高信号强度，可以选择多个标记物如荧光染料标记在同一个探针上。
2.优化杂交条件：杂交时间和温度是影响杂交效率的重要因素。
可以通过调整这些条件来提高杂交效果。
此外，添加高浓度的盐类和保护剂可以提高杂交的特异性和效率。
原位杂交实验具体步骤及详细方法
原位杂交实验具体步骤及详细方法原位杂交组织(或细胞)化学(In situ Hybridization Histochemistry，ISHH) 简称原位杂交(In Situ Hybridization)，属于固相分子杂交的范畴，它是用标记的DNA或RNA为探针，在原位检测组织细胞内特定核酸序列的方法。
根据所用探针和靶核酸的不同，原位杂交可分为DNA-DNA杂交，DNA-RNA杂交和RNA-RNA杂交三类。
根据探针的标记物是否直接被检测，原位杂交又可分为直接法和间接法两类。
直接法主要用放射性同位素、荧光及某些酶标记的探针与靶核酸进行杂交，杂交后分别通过放射自显影、荧光显微镜术或成色酶促反应直接显示。
间接法一般用半抗原标记探针，最后通过免疫组织化学法对半抗原定位，间接地显示探针与靶核酸形成的杂交体。
原位杂交最初是以同位素标记探针进行的。
尽管同位素标记(如35S，3H，32P 等)仍然广泛使用，但非同位素标记探针的迅速发展(尤其是生物素标记探针和地高辛标记探针)，更引起科技工作者的极大兴趣。
一、基本要求组织取材：组织取材应尽可能新鲜。
由于组织RNA降解较快，所以新鲜组织和培养细胞最好在30min内固定。
固定目的是：(1)保持细胞结构；(2)最大限度地保持细胞内DNA或RNA的水平；(3)使探针易于进入细胞或组织。
最常用的固定剂是多聚甲醛，与其它醛类固定剂(如戊二醛)不同，多聚甲醛不会与蛋白质产生广泛的交叉连接，因而不会影响探针穿透入细胞或组织。
增强组织的通透性和核酸探针的穿透性：(1)稀酸处理和酸酐处理：为防止探针与组织中碱性蛋白之间的静电结合，以降低背景，杂交前标本可用0.25%乙酸酐处理10min，经乙酸酐处理后，组织蛋白中的碱性基团通过乙酰化而被阻断。
组织和细胞标本亦可用0.2M HCl处理10min，稀酸能使碱性蛋白变性，结合蛋白酶消化，容易将碱性蛋白移除。
(2)去污剂处理：去污剂处理的目的是增加组织的通透性，利于杂交探针进入组织细胞，最常应用的去污剂是Triton X-100。
微生物荧光原位杂交实验技术
微生物荧光原位杂交实验技术背景微生物荧光原位杂交实验技术是在原位杂交技术的基础上发展而来的。
原位杂交技术最早应用于染色体分析，后来逐渐应用于微生物检测领域。
随着荧光标记技术的不断发展，人们开始利用荧光标记探针进行原位杂交，从而提高了检测的灵敏度和特异性。
原理微生物荧光原位杂交实验技术的原理是利用特定的荧光标记探针与细胞中的微生物进行杂交，从而将微生物定性和定量地检测出来。
该技术的基本原理是碱基互补配对原则，即探针的序列与待测微生物的序列互补，从而形成稳定的杂交双链。
利用荧光检测仪器检测荧光信号，从而实现对微生物的定量和定位分析。
实验方法样品的制备：将待测样品进行处理，使微生物细胞分离并保持活性。
探针的制备：将特定的DNA或RNA片段进行标记，形成荧光探针。
杂交反应：将样品和探针在一定条件下进行杂交反应，形成杂交双链。
洗涤和干燥：去除未结合的探针和杂质，保持杂交信号的特异性。
荧光检测：利用荧光检测仪器检测样品的荧光信号，并对数据进行处理和分析。
实验结果通过微生物荧光原位杂交实验技术，我们可以得到样品的定性和定量数据。
实验的成功率较高，特异性较强，能够清晰地检测出目标微生物的存在和数量。
该技术的灵敏度较高，可以检测出低拷贝数的微生物基因，为研究提供了有力的工具。
实验讨论微生物荧光原位杂交实验技术具有许多优势，如高特异性、高灵敏度和能够保持细胞结构的完整性等。
然而，该技术也存在一些不足之处，如探针制备过程较为繁琐、杂交反应条件要求较高以及荧光检测仪器价格昂贵等。
荧光探针的稳定性也可能影响实验结果的可靠性。
因此，在应用该技术时需要注意这些因素，并选择合适的探针和实验条件，以保证实验结果的准确性和可靠性。
结论微生物荧光原位杂交实验技术在研究领域具有广泛的应用前景。
除了在微生物检测方面的应用，该技术还可以应用于其他领域，如基因表达分析、细胞凋亡研究等。
虽然该技术存在一些不足之处，但随着技术的不断发展和优化，相信未来会有更多的应用前景等待着我们去探索和发现。
分子生物学实验中的原位杂交技术使用方法介绍
分子生物学实验中的原位杂交技术使用方法介绍分子生物学是一门研究生物分子结构、功能和相互作用的科学。
原位杂交技术是其中一种常用的实验方法，用于研究DNA或RNA在细胞或组织中的位置和表达情况。
本文将介绍原位杂交技术的使用方法，包括样品准备、探针设计、杂交条件和信号检测等方面。
一、样品准备在进行原位杂交实验前，首先需要准备样品。
样品可以是细胞、组织或整个生物体。
对于细胞和组织样品，需要进行固定和切片处理。
固定可以使用甲醛或乙醛等化学试剂，切片则需要使用显微刀或切片机。
对于整个生物体样品，需要进行组织切片或冰冻切片处理。
二、探针设计探针是原位杂交实验中的重要部分，用于与目标DNA或RNA序列特异性结合。
探针可以是DNA或RNA，通常标记有荧光染料或放射性同位素。
在设计探针时，需要考虑目标序列的长度、GC含量、互补性和特异性等因素。
同时，还需要选择适当的标记方法和标记物，以便在实验中检测到探针的信号。
三、杂交条件杂交条件是决定原位杂交实验结果的关键因素之一。
杂交温度、盐浓度和杂交时间等参数需要根据目标序列的特性进行优化。
通常情况下，较高的杂交温度和适当的盐浓度有助于提高探针与目标序列的互补性结合。
杂交时间一般在数小时到数天之间，具体根据实验需要进行调整。
四、信号检测信号检测是原位杂交实验中的最后一步，用于观察和记录探针与目标序列的结合情况。
常用的信号检测方法包括荧光显微镜观察、放射性计数和原位杂交染色等。
荧光显微镜观察是最常见的信号检测方法，可以通过荧光染料的发射和目标序列的位置来确定探针的结合情况。
放射性计数则是使用放射性同位素标记的探针进行测量，通过探针的放射性衰减来判断探针与目标序列的结合情况。
原位杂交染色是一种较为传统的信号检测方法，通过染色剂与探针结合来观察目标序列的位置和表达情况。
原位杂交技术在分子生物学研究中具有广泛的应用。
它可以用于研究基因表达、基因定位、基因组结构和染色体变异等方面。
通过合理设计实验方案和优化实验条件，原位杂交技术可以提供有关生物分子在细胞和组织中的空间分布和功能调控的重要信息。
荧光原位杂交实验具体步骤及详细说明
荧光原位杂交实验具体步骤及详细说明荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）是一种用于确定DNA或RNA序列在细胞或组织中的位置的技术。
下面将详细介绍荧光原位杂交的具体步骤和相应的详细说明。
1.细胞准备首先，需要准备细胞样本。
可以选择使用原代细胞，细胞悬液或切片等。
2.固定将细胞固定在载玻片或载玻片上面。
固定通常使用的试剂是乙酸乙酯和甲醇的混合物，通常比例为1:33.水合将载玻片中的组织或细胞水合处理。
这一步可以通过将载玻片浸泡在去离子水或缓冲液中进行。
4.处理将载玻片进行预处理，以使DNA或RNA序列更易于杂交。
常用的预处理方法有：-煮沸：将载玻片浸泡在2×SSC（1×SSC：0.15MNaCl,0.015MNa3C6H5O7·2H2O,pH7.0）中，然后置于热盖板上加热至100°C，持续约10-20分钟。
-碱性水解：将载玻片浸泡在10%NaOH中，进行碱性水解，然后在盐溶液中冲洗。
5.杂交探针准备荧光探针或荧光标记的引物。
探针的选择取决于要检测的DNA或RNA序列。
探针的设计通常基于目标序列的序列信息，并且通过化学修饰和荧光标记以增加其杂交效率和检测灵敏度。
6.杂交将探针加到载玻片上的样本上，并与目标序列进行杂交。
杂交过程中，探针与目标序列进行互补配对，形成探针-目标复合物。
杂交的温度取决于探针的碱基组成和目标序列的GC含量。
7.洗涤将载玻片在洗涤缓冲液中进行洗涤，以去除未与目标序列杂交的探针。
8.检测使用荧光显微镜观察载玻片上的标记。
荧光标记的探针将通过荧光显微镜检测获得荧光信号。
根据荧光信号的数量和强度，可以确定目标序列的位置和数量。
9.成像和分析通过拍摄荧光显微镜图像来记录荧光信号。
使用图像处理软件进行图像分析，包括亮度分析和定量信号分析。
总结：荧光原位杂交是一种用于确定DNA或RNA序列在细胞或组织中位置的强大技术。
原位杂交演示实验讲义
原位杂交演示实验讲义一、组织标本以及器皿的处理1. 实验动物心脏灌流，一方面是除去血液中物质的干扰，另一方面可以更好的保持组织形态。
2. 玻璃器皿常规洗净后应用RNA酶抑制剂，如0.1%的DEPC水溶液，浸泡处理若干小时，然后高压灭菌除去DEPC，最后180℃烘烤4h。
3. 载玻片预处理：常规处理步骤后，180℃烘烤4h，然后APES粘片。
4. 冰冻切片制备。
二、RNA探针制备流程1.总RNA的提取以及反转录制备cDNA：（1）将台式离心机置于4度冰箱预冷；（2）匀浆器头使用前后须作如下处理：a. 3％ H2O2浸泡15-30min；b. 灭菌水冲洗2次，甩净，晾干；c. 匀浆；d. 匀浆后用浓度不高于0.5％的SDS洗液清洗，再用灭菌水冲洗至无白沫；e. 无水乙醇浸泡，干燥，防止生锈；（3）取1ml TIRZOL加入小试管中，同时加入组织块100mg。
若组织块大于100mg，使两者比例保持为1ml ：100mg；（4）匀浆。
匀浆时应将匀浆器转速调到最大，每次转10秒钟，转多次，以防止匀浆器及其内液体过热，导致RNA降解；（5） EP管中匀浆液在室温下放置5min，4度12000×g离心10min；（6）按每1ml TRIZOL液加入0.2ml氯仿，用力振荡15s，混匀后室温放置2-3min，4度12000×g离心15min；（7）将上清液移入另一DEPC处理过的EP管中，按每1ml TRIZOL液0.5ml异丙醇的比例加异丙醇，混匀，室温放置10min；（8） 4度12000×g离心10min后，去净上清；（9） 75％乙醇洗涤沉淀，4度7500×g离心5min，然后去掉乙醇；（10）加适量（40ul） DEPC水或去离子甲酰胺溶RNA，用分光度计测OD260值，计算RNA 含量。
RNA含量（ug/ul）＝OD260×40×稀释倍数/1000。
10实验四五(三)蛋白质原位杂交
附：Ehrich苏木精中染色 Ehrich苏木精中染色
1、前面片经95％、各级的酒精中入水洗后。 、前面片经95％、各级的酒精中入水洗后。 2、Ehrich苏木精中染色10分钟。 Ehrich苏木精中染色10分钟。 3、在清水中冲洗10min。材料由红色变为兰色， 、在清水中冲洗10min。材料由红色变为兰色， 4、1％伊红Y滴液得2－3分钟。 ％伊红Y滴液得2 5、流水冲洗10－30min。 、流水冲洗10－30min。 6、30％、50％、70％、80％、90％、95％、 30％、50％、70％、80％、90％、95％、 100％的酒精中顺次脱水，每级3 5min。 100％的酒精中顺次脱水，每级3－5min。 7、纯酒精和松节油的混合液（1：1）中5min。 、纯酒精和松节油 松节油的混合液（1 ）中5min。 8、入松节油5min。 、入松节油 松节油5min。 9、用加拿大树胶封藏。
四、显色： 显色： 加显色液反应20 30分钟避光 20- 分钟避光）。 加显色液反应20-30分钟避光）。
五、封片 1、脱水 蒸馏水，50%乙醇 乙醇， 乙醇， PBS ，蒸馏水，50%乙醇， 70% 乙醇， 80%乙醇 乙醇， 90%乙醇 95%乙醇 乙醇， 乙醇， 80%乙醇， 90%乙醇，95%乙醇， 100%乙醇，100%乙醇各10分钟。 100%乙醇，100%乙醇各10分钟。 乙醇 乙醇各10分钟 透明½无水乙醇） 1/2松节油 松节油， 2、透明½ 无水乙醇） 1/2松节油， 松节油I 松节油II 10分钟 封片。 II各 分钟， 松节油I，松节油II各10分钟，封片。 4、镜检
6、Solution A洗四次，15分钟/次。 A洗四次 15分钟 洗四次， 分钟/ 加二抗2小时。 7、加二抗2小时。 A洗四次 洗四次， 15分钟 分钟/ 8、Solution A洗四次， 15分钟/次。
荧光原位杂交实验具体步骤及详细说明
荧光原位杂交实验具体步骤及详细说明用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。
由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。
1. 探针变性将探针在75℃恒温水浴中温育5 min，立即置0℃，5～10 min，使双链DNA探针变性。
2. 标本变性（1）将制备好的染色体玻片标本于50℃培养箱中烤片2～3 h。
（经Giemsa 染色的标本需预先在固定液中退色后再烤片）。
（2）取出玻片标本，将其浸在70～75℃的体积分数70% 甲酰胺/2x SSC的变性液中变性2～3 min。
（3）立即按顺序将标本经体积分数70%、体积分数90%和体积分数100%冰乙醇系列脱水，每次5 min，然后空气干燥。
3. 杂交将已变性或预退火的DNA探针10 uL 滴于已变性并脱水的玻片标本上，盖上18x18盖玻片，用Parafilm封片，置于潮湿暗盒中37℃杂交过夜（约15～17 h）。
由于杂交液较少，而且杂交温度较高，持续时间又长，因此为了保持标本的湿润状态，此过程在湿盒中进行。
4. 洗脱此步骤有助于除去非特异性结合的探针，从而降低本底。
（1）杂交次日，将标本从37℃温箱中取出，用刀片轻轻将盖玻片揭掉。
（2）将已杂交的玻片标本放置于已预热42～50℃的体积分数50%甲酰胺/2xSSC中洗涤3次，每次5 min。
（3）在已预热42～50℃的1xSSC中洗涤3次，每次5 min。
（4）在室温下，将玻片标本于2xSSC中轻洗一下。
（5）取出玻片，自然干燥。
（6）取200 uL复染溶液（PI/antifade或DAPI/antifade染液）滴加在玻片标本上，盖上盖玻片。
5. 杂交信号的放大（适用于使用生物素标记的探针）（1）在玻片的杂交部位加150 uL封闭液I，用保鲜膜覆盖，37℃温育20min。
实验5 原位杂交-2
7. 洗涤：（1）弃除抗体， 用PBS洗涤胚胎， 4 次， 每次6 min；
（2） TMNT buffer 浸洗胚胎 10 min 500ul/管
8. 显色 用NBT/BCIP 显色液显色，室温， 500ul/管
TAA
ATT
5’
3’ 5’ Sp6
如果插入方向如图A，则反义探针的合 成，应用限制性内切酶在靠近T7启动子 的位置将质粒线性化，然后用SP6 RNA 聚合酶来合成探针
TAC
ATG
5’
5’
TTA
3’
AAT
3’
3’
CAT
3’
GTA
5’
5’
T7
B
Sp6
如果插入方向如图B，则反义探针的合成， 应用限制性内切酶在靠近SP6 启动子的位 置将质粒线性化，然后用 T7 RNA聚合酶 来合成探针
核酸分子杂交技术
实验对象：海蜇胚胎 -横裂体和碟状体
杂交技术的原理
杂交：核苷酸序列通过Watson-Crick碱 基配对原则形成稳定的杂合双链核酸分 子的过程，称为杂交。
杂交的三种形式：DNA-DNA,DNA-RNA 和RNA-RNA，其稳定性依次增大。
检测对象：提纯的核酸和细胞内的原位 的核酸。
核酸分子杂交具有很高的灵敏度和高度 的特异性。
主要应用有：克隆基因的筛选、酶切图 谱的制作、基因组中特定基因序列的定 位、定性、定量检测、特定基因的时空 表达模式和疾病的诊断等方面。
1、模板的制备
方法一、制备质粒模板 方法二、PCR法： 在引物中引入启动子序列，聚合酶选用高 保真、末端不加A的酶。
原位杂交实验流程
原位杂交实验流程
原位杂交实验是一种将核酸探针与细胞或组织切片上的DNA或RNA进行杂交，从而对特定核酸进行定位和定量分析的方法。
以下是原位杂交实验的一般流程：
1. 样品制备：获得待检测的样品，可以是细胞、组织、细胞核或染色体等。
样品需要进行处理，包括固定、脱水和烘干等步骤，以便于后续的处理。
2. 探针制备：探针是一段具有特定序列的DNA或RNA，用于检测样品中的特定序列。
可以通过化学合成或PCR扩增等方法制备探针。
探针需要标记一定的标记物，如荧光素或辐射性核素等，以便于检测。
3. 杂交反应：将制备好的探针与处理好的样品进行杂交反应。
反应条件包括温度、盐浓度、pH值等，需要根据探针和样品的特性进行调整。
杂交后，探针会与样品中的特定DNA序列结合，并形成探针-目标DNA复合物。
4. 洗涤：杂交后，需要用洗涤液将未结合的探针洗去，以减少背景信号。
洗涤条件需要根据探针和样品的特性进行选择。
5. 检测：在洗涤后，通过特定的检测方法对探针-目标DNA复合物进行检测。
常用的检测方法包括荧光显微镜观察、放射自显影、免疫组织化学染色等。
6. 结果分析：根据检测结果，对杂交信号进行分析和解释。
通常需要比较杂交信号与已知标准品的信号，以确定样品中是否存在目标核酸序列。
7. 实验重复：为了确保结果的可靠性和准确性，通常需要进行重复实验，并对不同实验条件下的结果进行比较和分析。
总之，原位杂交实验需要精心设计和严格控制实验条件，以确保结果的准确性和可靠性。
实验5 原位杂交
体外转录法合成RNA探针
A、质粒提取（彻底抽提蛋白，避免有机溶剂残留）
B、酶切（酶切位点的选择原则）： 使合成的探针长度在200bp-1000bp； 尽量选常见的酶；分清编码链和模板链。
C、酶切产物的回收 胶回收或沉降回收（回溶或洗脱时要用DEPC 处理的水，切勿混入超过0.1M的EDTA）。
试剂及材料 溶于DEPC处理水中的线性化质粒 含DIG标记的NTP Mix 转录缓冲液（10×） RNA聚合酶（SP6、T7或T3） RNA酶抑制剂
混匀后37℃ 2.5小时 加2ul DNase 1 (RNase-free)，37℃ 20分钟，消化DNA模板 加入1ul EDTA（pH8.0）终止反应。
胚胎原位杂交
实验方法
3、杂交 将探针加入杂交液中，并作用于胚胎。 杂交条件：60度，12－20hr。
胚胎原位杂交
实验方法
4、杂交后洗脱（温度和盐浓度）
杂交液 60°C 15 min
Wash1
5×SS C 2×SS C 2×SS C
50% 甲酰胺 0.5%SD S 50% 甲酰胺 0.4%SD S
实验操作
1)从胚胎中除去hybridization buffer。探针回 收，-20°C 保存 2)Wash 1 洗涤胚胎2 次，60°C，每次20 分钟 3)Wash 2 洗涤胚胎2 次，60°C，每次20 分钟 4)Wash 3 洗涤胚胎2 次，60°C，每次20 分钟 5)Wash 4 洗涤胚胎2 次，60°C，每次20 分钟 6)加入MAB，6min。
10分钟后可观察一下，如显色较慢，可 间隔时间较长再观察，如显色较快，需 经常观察。
实验注意事项
原位杂交实验操作步骤
原位杂交实验操作步骤撰写人：范为民一、实验原理原位杂交是指借助于核酸分子杂交的方法，在显微镜水平检测和定位特异的核苷酸片段。
现在原位杂交已经成为在分子水平研究肿瘤和遗传性疾病的发生，发展和调控等根本性问题的有力工具。
二、试剂盒本实验室常用的原位杂交试剂盒是博士德公司生产的敏感加强型原位杂交检测试剂盒，此试剂盒分为两种，一种为过氧化物酶（POD）检测（MK1030型），一种为碱性磷酸酶(AP)检测系统（MK1032型），用于mRNA的杂交。
过氧化物酶（POD）检测的最终信号为棕黄色，而碱性磷酸酶(AP)检测的信号为紫色，因后者信号比较突出，所以一般采用后一种检测方法。
两种检测方法的实验步骤相差不多，所用洗脱缓冲液也大同小异。
用于杂交的探针也可以分为两种，一种是DNA探针，即是用DNA与组织中的mRNA杂交，另一种是RNA 探针，即用RNA与组织中的mRNA杂交。
DNA探针处理操作简单，但杂交信号一般不如RNA探针强烈，所以条件允许的话一般采用RNA探针。
下面先介绍碱性磷酸酶(AP)检测试剂盒，采用RNA作为探针的操作步骤。
三、实验步骤原位杂交实验主要包括三大部分，即组织冰冻切片、RNA探针标记、原位杂交三部分。
（一）组织冰冻切片1. 实验准备（1）原位杂交专用载玻片：用多聚赖氨酸处理后的载玻片，使切片紧密粘附在玻片上，可以用于后面的洗脱。
一般一张载玻片上可以贴至多十张切片（可以是不同组织的切片），所以需要玻片的数目需要根据实验的要求而定。
这种专用载玻片可以从中杉金桥公司购买，目前价格是每片2.2元，玻片有一面的一端是毛玻璃，用于标记组织名称等，切片应该贴在此面，切勿贴到反面。
（2）缓冲液配备1.1器具准备剪刀、镊子各三把，开壳钳一把，100ml量筒一个，磁力搅拌子一个；100ml试剂瓶一个，250ml试剂瓶三个。
以上器具均洗净后置于180摄氏度以上烘烤6小时以上。
铅笔、显微镜、冰、吸水纸、一次性塑料手套等。
植物原位杂交实验报告
一、实验目的本实验旨在通过植物原位杂交技术，对藜属植物染色体组进行核型分析，以揭示藜属植物染色体组的基本特征，为藜属植物的遗传育种和分类学研究提供理论依据。
二、实验材料与试剂1. 实验材料：- 5种藜属植物（灰绿藜、藜、菊叶香藜、杂配藜及藜麦）- 5S rDNA和45S rDNA探针2. 实验试剂：- 甲醛- 乙醇- 盐酸- 染色剂（如醋酸洋红）- 封片剂三、实验方法1. 材料处理：- 将藜属植物根尖或叶片固定于甲醛溶液中，室温下放置24小时。
- 将固定后的材料置于乙醇溶液中，梯度脱水。
- 将脱水后的材料进行酸解处理，以使染色体解旋。
2. 染色：- 将酸解后的材料进行染色，使用醋酸洋红染色剂进行染色体染色。
3. 探针标记与杂交：- 将5S rDNA和45S rDNA探针进行标记，标记方法采用地高辛标记试剂盒。
- 将标记后的探针与染色后的染色体进行杂交，杂交条件为60℃、24小时。
4. 洗涤与显色：- 将杂交后的染色体进行洗涤，去除未结合的探针。
- 使用地高辛标记试剂盒中的显色剂进行显色。
5. 显微镜观察与拍照：- 使用荧光显微镜观察杂交后的染色体，记录核型特征。
- 使用数码相机拍照，记录实验结果。
四、实验结果与分析1. 核型分析：- 通过荧光显微镜观察，发现藜属植物中存在二倍体（2n2x18）和四倍体（2n4x36）两种倍性。
- 藜麦和灰绿藜为四倍体，其余3种为二倍体。
- 核型公式分别为：藜麦（2n4x3634m）、灰绿藜（2n4x3632m）、藜（2n2x1816m）、菊叶香藜（2n2x1818m）、杂配藜（2n2x1816m2sm）。
2. 染色体特征：- 染色体主要由中部着丝粒染色体（m）和近中部着丝粒染色体（sm）组成。
- 核型类型除菊叶香藜为1B类型外，其余均为2B类型。
3. 双随体分布：- 在藜麦、灰绿藜及藜中，具有分布位置不同、数量不等的双随体。
4. 5S rDNA和45S rDNA位点：- 藜麦和灰绿藜的染色体上存在2对5S rDNA位点和1对45S rDNA位点。
原位杂交实验原理
原位杂交实验原理原位杂交实验是一种常用的分子生物学技术，用于研究DNA序列在染色体上的位置和表达情况。
它通过将标记有特定探针的DNA 与细胞或组织切片进行杂交，然后通过检测探针的信号来确定目标DNA序列的位置和表达水平。
原位杂交实验的原理基于亲和性杂交。
在实验中，首先需要合成特定的DNA探针，该探针可以与目标DNA序列的互补序列特异性结合。
探针可以标记有放射性同位素、荧光染料或酶等标记物，以便在实验中进行检测。
实验开始时，需要将细胞或组织切片固定在载玻片上，并进行脱水和去脂处理，以提高标记物的进入和探针的杂交效率。
然后，在固定的细胞或组织切片上加入标记有特定探针的杂交液，使探针与目标DNA序列杂交。
杂交条件包括温度、时间和盐浓度等因素，需要根据不同的实验目的进行优化。
杂交完成后，需要对样品进行洗涤以去除非特异性结合的探针。
然后，可以使用放射自显影、显微镜观察或荧光显微镜等方法来检测探针的信号。
放射自显影法通过探针标记的放射性同位素发出的射线来产生影像，显微镜观察法通过探针标记的荧光染料在显微镜下显示出特定的荧光信号，以及酶标法通过探针标记的酶的底物产生的显色反应来检测探针信号。
原位杂交实验可以应用于多种研究领域。
在基因组学中，可以用于定位和标记染色体上的特定基因或DNA序列，从而帮助我们了解基因组结构和功能。
在肿瘤学中，可以用于检测癌基因的放大、缺失或融合，从而为肿瘤的诊断和治疗提供依据。
在发育生物学中，可以用于研究基因在胚胎发育过程中的表达模式和时空分布。
总结起来，原位杂交实验是一种重要的分子生物学技术，通过标记特异性探针与目标DNA序列杂交，可以确定DNA序列在染色体上的位置和表达情况。
该实验原理简单易懂，应用广泛，为我们深入了解基因组结构和功能，以及疾病发生机制提供了重要的工具和方法。
rna原位杂交的主要实验过程及应用
rna原位杂交的主要实验过程及应用RNA原位杂交（in situ hybridization）是一种用于检测细胞或组织中特定RNA序列的方法。
它主要包括以下实验过程：1. RNA样本固定：细胞或组织样本通常需要被固定在载玻片上，常用的固定剂包括乙醛、乙酰丙酮、PFA等。
2. 去除脂质：在固定的样本中，脂质会干扰RNA与探针的结合，因此需要用脱脂剂去除脂质。
3. 探针制备：选择目标RNA序列的互补序列作为探针，并进行标记，通常标记方式有放射性同位素标记（例如32P、35S）和非放射性标记（例如荧光标记、酶标记）。
4. 杂交：将探针与样本进行杂交，杂交通常在高温下进行，以促进RNA与探针的结合。
5. 洗脱：为了去除非特异性结合的探针，通常进行一系列的洗脱步骤，洗脱条件可以根据具体的实验目的进行调整。
6. 可视化与检测：如果探针采用放射性标记，可以将载玻片放置于感光胶片上，在放射性衰变的辐射下使胶片曝光，然后显影胶片以检测探针的信号；如果探针采用非放射性标记，可以直接通过荧光显微镜观察探针的发光信号。
RNA原位杂交主要应用于以下领域：1. 研究基因表达：可以确定细胞或组织中特定基因的表达模式，帮助揭示基因的功能和调控机制。
2. 分析细胞类型和结构：可以确定细胞或组织中特定RNA序列的分布情况，帮助研究细胞类型和组织结构。
3. 病理学研究：可以检测病理变化相关基因的表达水平，帮助了解疾病的发生机制和进展过程。
4. 发育生物学研究：可以追踪特定RNA序列在发育过程中的表达变化，帮助研究胚胎发育和器官形成的分子机制。
综上所述，RNA原位杂交是一种重要的实验技术，可以用于研究细胞和组织中特定RNA序列的表达模式及其在生物学和医学领域的应用。
RNA原位杂交是一种研究基因表达的常用技术，通过将标记有特定探针的RNA与细胞内目标RNA进行杂交反应，用于确定RNA在组织或细胞中的位置和表达水平。
其主要实验过程如下：1. 制备RNA探针：根据研究对象的RNA序列设计合适的探针，可以使用放射性标记，如32P或35S，或非放射性标记，如荧光标记（如FITC，Cy3等）。
原位杂交实验方法
探针设计方案
4，模板序列：
2，适用种属：
5，探针序列：
1，探针名称 ：
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探针杂交原理
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02
03
04
05
06
07
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A-石蜡切片mRNA原位杂交步骤
二，碱性磷酸酶显色系统
一，过氧化物酶显色系统
三，荧光显色方法
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B-冰冻切片mRNA原位杂交步骤
一，过氧化物酶显色系统
二，碱性磷酸酶显色系统
三，荧光显色方法
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适用方法 荧光检测系统 过氧化物酶检测系统 碱性磷酸酶检测系统
石蜡切片
冰冻切片
细胞涂片和 细胞爬片
产品年终工作总结
原位杂交实验方法
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演讲人姓名
mRNA 原位杂交前实验准备
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05
1，无RNA酶水的处理
2，无RNA酶载玻片的处理
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C-细胞爬片或涂片mRNA原位杂交步骤
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二，碱性磷酸酶显色系统
一，过氧化物酶显色系统
三，荧光显色方法
附录
3
2
4
1，DAB的配制和使用方法
4，核固红的配制和使用方法
NBT/BCIP的配制和使用方法
3，苏木素的配制和使用方法
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流式细胞仪
D-悬浮细胞的mRNA原位杂交细胞流式细胞仪步骤
3，标本的防RNA酶的固定
4，探针的稀释和保存
5，DNA探针需变性
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原位杂交溶液的配制
1，预杂交液和杂交液的配制 2，20Xssc， 2Xssc， 0.2Xssc缓冲液的配制 3，0.1mol PBS缓冲液的配制 4，0.1mol 枸橼酸缓冲液的配制 5，0.1mol TBS缓冲液的配制 6，复合消化液的配制 7，组织细胞打孔液的配制 8，杂交漂洗液 9，过氧化氢封闭液
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原位杂交组织(或细胞)化学(In situ Hybridization Histochemistry，ISHH) 简称原位杂交(In Situ Hybridization)，属于固相分子杂交的范畴，它是用标记的DNA或RNA为探针，在原位检测组织细胞内特定核酸序列的方法。
根据所用探针和靶核酸的不同，原位杂交可分为DNA-DNA杂交，DNA-RNA杂交和RNA-RNA杂交三类。
根据探针的标记物是否直接被检测，原位杂交又可分为直接法和间接法两类。
直接法主要用放射性同位素、荧光及某些酶标记的探针与靶核酸进行杂交，杂交后分别通过放射自显影、荧光显微镜术或成色酶促反应直接显示。
间接法一般用半抗原标记探针，最后通过免疫组织化学法对半抗原定位，间接地显示探针与靶核酸形成的杂交体。
原位杂交最初是以同位素标记探针进行的。
尽管同位素标记(如35S，3H，32P等)仍然广泛使用，但非同位素标记探针的迅速发展(尤其是生物素标记探针和地高辛标记探针)，更引起科技工作者的极大兴趣。
一、基本要求
组织取材：组织取材应尽可能新鲜。
由于组织RNA降解较快，所以新鲜组织和培养细胞最好在30min内固定。
固定目的是：
(1)保持细胞结构；
(2)最大限度地保持细胞内DNA或RNA的水平；
(3)使探针易于进入细胞或组织。
最常用的固定剂是多聚甲醛，与其它醛类固定剂(如戊二醛)不同，多聚甲醛不会与蛋白质产生广泛的交叉连接，因而不会影响探针穿透入细胞或组织。
增强组织的通透性和核酸探针的穿透性：
(1)稀酸处理和酸酐处理：为防止探针与组织中碱性蛋白之间的静电结合，以降低背景，杂交前标本可用0.25%乙酸酐处理10min，经乙酸酐处理后，组织蛋白中的碱性基团通过乙酰化而被阻断。
组织和细胞标本亦可用0.2M HCl处理10min，稀酸能使碱性蛋白变性，结合蛋白酶消化，容易将碱性蛋白移除。
(2)去污剂处理：去污剂处理的目的是增加组织的通透性，利于杂交探针进入组织细胞，最常应用的去污剂是Triton X-100。
注意：过度的去污剂处理不仅影响组织的形态结构，而且还会引起靶核酸的丢失。
(3) 蛋白酶处理：蛋白酶消化能使经固定后被遮蔽的靶核酸暴露，以增加探针对靶核酸的可及性。
常用的蛋白酶有蛋白酶K(proteinase K)，还有链霉蛋白酶(pronase)和胃蛋白酶(pepsin)等。
杂交缓冲液孵育：
杂交前用不含探针的杂交缓冲液在杂交温度下孵育2hr，以阻断玻片和标本中可能与探针产生非特异性结合的位点，达到减低背景的目的。
防止污染：
由于在手指皮肤及实验室用玻璃器皿上均可能含有RNA酶，为防止其污染影响实验结果，在整个杂交前处理过程中都需要戴消毒手套，实验所用玻璃器皿及镊子都应于实验前一日置高温烘烤(180℃)以达到消除RNA酶的目的。
杂交前及杂交时所用的溶液均需经高压消毒处理。
双链DNA探针和靶DNA的变性：
杂交反应进行时，探针和靶核酸都必须是单链的。
如果用双链DNA探针进行杂交(包括检测RNA时)，双链DNA探针在杂交前必须进行变性。
探针变性后要立即进行杂交反应，不然解链的探针又会重新复性。
杂交液：
杂交液内除含一定浓度的标记探针外，还含有较高浓度的盐类、甲酰胺、硫酸葡聚糖、牛血
清白蛋白及载体DNA或RNA等。
杂交液中含有较高浓度的Na+可使杂交率增加，可以减低探针与组织标本之间的静电结合。
甲酰胺可使Tm降低，杂交液中含每1%的甲酰胺可分别使RNA:RNA，RNA:DNA，DNA:DNA 的杂交温度降低0.35℃，0.5℃和0.65℃。
所以，杂交液中加入适量的甲酰胺，可避免因杂交温度过高而引起的组织形态结构的破坏以及标本的脱落。
硫酸葡聚糖能与水结合，从而减少杂交液的有效容积，提高探针有效浓度，以达到提高杂交率的目的(尤其对双链核酸探针)。
在杂交液中加入牛血清白蛋白及载体DNA或RNA等，都是为了阻断探针与组织结构成分之间的非特异性结合，以减低背景。
探针的浓度：
探针浓度依其种类和实验要求略有不同，一般为0.5-5.0μg/ml(0.5-5.0ng/μl)。
最适宜的探针浓度要通过实验才能确定。
探针的长度：
一般应在50-300个碱基之间，最长不宜超过400个碱基。
探针短易进入细胞，杂交率高，杂交时间短。
原文地址:/biotech/exp/molbio/DNA/2010/t81926753_1.html。