核酸定量的常用方法

核酸定量的常用方法、原理、优缺点等。

紫外分光光度法：利用核酸中的嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键，在紫外光的照射下在260nm处有最大吸收峰的原理对核酸进行定量和定性的方法。是实验室内较为常用的方法。

优点：操作简单，设备要求低。

缺点：灵敏度不够高，只能测定总核酸量，不能区分核算种类；易受样品中其他杂质的干扰（如pH值、残留的提取剂等）。

荧光染料法：基于荧光染料与核酸分子结合，发出的荧光信号强度与结合的核酸分子数成正比的原理设计的。常用的荧光染料有嗅化乙锭、SYBR系列染料等。优点：灵敏度高，所需样品量少，可重复性高。

缺点：染料一般都含有较高毒性，检测结果受染料与核酸的结合率影响。

实时荧光定量PCR法：

在反应体系内加入荧光基团，通过荧光基团发出荧光信号经积累来实时检测PCR的反应过程，最后通过相对定量或者绝对定量的方法对未知浓度的核酸进行定量分析。常用的检测方法有TaqMan探针和荧光染料两种。

TaqMan探针法：利用Taqman酶在特异性引物上增加一条荧光双标记的探针，分别标记有荧光信号基团R和淬灭基团Q，当二者都存在的时候R基团受Q基团影响不发出荧光信号，而在PCR反应过程中，聚合酶将探针的碱基水解，R 与Q基团分离，R基团发出荧光信号，模板每扩增一次，就产生一次荧光信号，通过对荧光信号的检测和绘制荧光信号曲线，与标准曲线对比分析，可对核酸进行定量。优点是特异性强，缺点是探针序列设计时需要强特异性，以及成本相对较高。

DNA结合荧光染料法：常用的荧光染料为SYBR Green Ⅰ，该技术通过在PCR 反应体系中加入过量的荧光染料，染料会特异性的与dsDNA结合并发出荧光信号，而未与dsDNA结合的不会发出荧光信号，在PCR过程中仪器通过检测荧光信号增强的曲线图，与标准品进行对比分析进行核酸定量。优点是成本相对于Taqman探针法较低，可以做熔解曲线了解引物的Tm值，缺点是染料能与非特

异性的dsDNA结合对实验结果产生干扰。特异性比探针法低。

检测DNA分子量大小的常用方法：

琼脂糖凝胶电泳：DNA分子在琼脂糖凝胶中涌动时，有电荷效应与分子筛效应。前者由分子所带净电荷量的多少而定，后者主要与分子大小及其构型有关。DNA 分子在高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。电泳结束后在紫外照射下，DNA分子与核酸染料结合可被激发出荧光，根据DNA Marker的已知分子量大小可检测出目的DNA的大概分子量。主要用于对DNA分子量的粗测。

Agilent 2100检测DNA分子量：通过微流体技术对样品进行分离。当加入电压时，与荧光染料结合的样品便在芯片上的显微蚀刻管道进行分离。样品流动过程中不同，DNA 片段根据其大小被分离，并通过激光激发荧光，使其被仪器检测到。需要根据已知分子量及含量的Ladder计算DNA迁移时间和size的函数关系，根据公式计算样品的对应分子量及浓度。