核酸定量方法及原理
高中生物 实验五、核酸定量测定
设波长，置空白，调零，置“吸光度”，读出样品吸光度 ↓
重复上步读出各标准溶液吸光度 ↓
以各样品中已知含量及读得吸光度绘制坐标图，并画出相关 最佳的曲线
↓ 读未知样品的吸光度，在曲线表上找出对应浓度
标准曲线的制作 表5-1
试管
1
标准DNA溶液（mL） 0
蒸馏水（mL）
5
DNA浓度(ug/ml) 0
A260
0
2 3 4 5 67 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1 4.9 4.8 4.6 4.4 4.2 4
混匀后以1号试管为空白在260nm处测定光吸收值A，以标准DNA 溶液的浓度为横坐标、A为纵坐标在坐标纸上绘制出标准曲线，
它是一条直线。
2、核酸最大紫外吸收波长（λｍ）的确定：
以上5-1表中的７号试管为测定对象，以1号试管 为空白，在240～290nm范围内每隔10nm分别 测定光吸收值A。注意，每次换了波长之后都需 要用空白重新调校“0％T”和 “100％T”。以A 为纵坐标、λ（nm）为横坐标作一条平滑曲线， 找出最高峰处所对应的波长λｍ。
3、样品测定
取一支试管，编号8，加入6mL左右待测的DNA 溶液，仍以1号试管为空白，分别在260nm和 280nm处测定其光吸收A，用A260在标准曲线上 查出DNA溶液浓度C1
根据公式计算出待测DNA溶液的浓度C2 （g/mL）。
根据A260/A280的值来判断该待测的DNA样品是否 纯净。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
如果已知待测的核酸样品不含酸溶性 核苷酸或可透析的低聚多核苷酸，即可将 样品配制成一定浓度的溶液(20～ 50ug/mL)，在紫外分光光度计上直接测定。
核酸定量仪使用说明书
核酸定量仪使用说明书一、引言核酸定量仪是一种广泛应用于分子生物学实验室的仪器，它可以用于测量核酸的浓度和纯度。
本使用说明书旨在介绍核酸定量仪的操作方法、注意事项以及常见故障排除方法，帮助用户正确、高效地使用该仪器。
二、仪器概述1. 外观描述核酸定量仪外观简洁大方，采用触摸屏设计，操作便捷。
仪器较小巧便携，适合于实验室内移动使用。
2. 技术原理核酸定量仪采用紫外可见分光光度法，通过测量核酸吸光度与浓度之间的线性关系来计算样品的核酸含量。
三、操作方法1. 准备工作首先，确保核酸定量仪已连接电源，并等待仪器启动完成。
同时，准备好以下实验材料：核酸样品、恰当的稀释缓冲液、试管或石英比色皿、移液器和无纺布。
2. 样品测量a) 使用移液器取适量的稀释缓冲液放入比色皿中，作为空白对照。
b) 清洁比色皿内外壁，并用无纺布擦干。
c) 使用移液器分别向比色皿中加入待测样品和空白对照，注意避免出现气泡。
d) 将比色皿放入核酸定量仪的样品槽中。
e) 在仪器界面上选择核酸定量功能，并按照屏幕提示进行测量操作。
f) 测量完成后，将比色皿取出并丢弃，及时清洁仪器和配件。
3. 结果解读根据仪器显示屏上的结果，可以获得待测样品的核酸浓度和纯度。
四、注意事项1. 样品准备使用前务必保证核酸样品已经充分溶解，无颗粒悬浮物，并在所选波长范围内具有明显的吸光度峰。
注意避免污染样品，使用无菌移液器和无菌比色皿，并避免接触样品溶液外部容器。
2. 仪器操作a) 仪器启动后，请勿随意触摸显示屏和光路部分，以免影响测量精度。
b) 观察仪器故障指示灯，如有异常情况，请查阅故障排除部分。
c) 根据操作界面提示，正确选择检测波长和样品类型，以获得准确的测量结果。
d) 使用完毕后，及时关闭仪器电源，并进行适当清洁。
3. 故障排除故障：仪器无法启动。
解决方法：检查电源是否接触良好，插座是否正常工作，确保电源是否打开。
故障：测量结果异常。
解决方法：检查是否选用正确的波长和样品类型，确保样品制备正确，如有必要，请参阅仪器操作手册。
核酸定量测定实验报告
一、实验目的1. 掌握核酸定量测定的原理和方法。
2. 熟悉紫外分光光度法和定磷法在核酸定量中的应用。
3. 提高实验操作技能，培养科学思维和实验数据分析能力。
二、实验原理核酸（DNA和RNA）是生物体内重要的生物大分子，其含量与生物体的生命活动密切相关。
核酸定量测定是生物学、医学和分子生物学等领域的重要研究手段。
1. 紫外分光光度法：核酸、核苷酸及其衍生物具有共轭双键系统，能吸收紫外光。
DNA和RNA在260 nm波长处的紫外吸收峰较强，可用于定量测定核酸含量。
2. 定磷法：核酸分子中含有一定比例的磷，DNA和RNA的含磷量分别为9.2%和9.0%。
通过测定核酸中磷的含量，可间接计算出核酸的量。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：粗核酸、DNA标准品、RNA标准品、样品待测液、蒸馏水等。
2. 仪器：紫外分光光度计、电子天平、恒温水浴锅、移液器、试管、吸管等。
四、实验步骤1. 紫外分光光度法测定核酸含量（1）配制核酸标准溶液：准确称取一定量的DNA和RNA标准品，用蒸馏水配制成一定浓度的标准溶液。
（2）测定样品核酸含量：将样品待测液稀释至一定浓度，取适量样品溶液，在260 nm波长处测定其吸光度。
（3）绘制标准曲线：以DNA或RNA标准溶液的浓度为横坐标，对应的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
（4）计算样品核酸含量：根据样品溶液的吸光度，从标准曲线上查得相应的核酸浓度，计算样品中核酸的量。
2. 定磷法测定核酸含量（1）配制标准磷溶液：准确称取一定量的磷酸二氢钾，用蒸馏水配制成一定浓度的标准磷溶液。
（2）测定样品核酸中磷含量：将样品待测液加入强酸，使核酸分子中的有机磷转化为无机磷，与钼酸铵反应生成磷钼酸铵。
在还原剂存在下，磷钼酸铵被还原生成钼蓝，用分光光度法测定其在660 nm处的吸光度。
（3）绘制标准曲线：以标准磷溶液的浓度为横坐标，对应的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
（4）计算样品核酸含量：根据样品溶液的吸光度，从标准曲线上查得相应的磷浓度，乘以核酸的含磷量，计算样品中核酸的量。
定量PCR基本原理及方法
FRET 定量分析，熔解曲线分析，基因型分析
Ampliflour Probe，LUX 定量分析
➢ 基因型分析
利用扩增信号的种类来分型 —— Taqman 根据熔解曲线的不同来分型 —— FRET, Molecular Beacon
➢ 荧光定量PCR的定量原理
RePaCl-Rti的m理e论C方he程m：isYt=rxie×s(1+ Ev)n
Y：扩增物数量； X ：起始模板数量；Ev：扩增效率；n：扩增循环数
1. 终点法定量原理 前提：在最佳实验、循环次数n一定、Ev相同 原理：根据扩增产物的量计数反应物中原始分子数，即： lnx=lnY-n×ln(1+Ev)=lnY - b (b为常数)
R
3’
3’
3’
5’
QQQ
Q
5’
分子信标（Molecular Beacon Probe）
R ExcitatEiomnission Q
Excitation
荧光共振能量传递（FRET Probe）
Oligo 1: Fluorescein Excitation
Transfer
Oligo 2: LC Red 640 Emission
2. 实时检测法定量原理 前提：在最佳实验、相同Ev以、扩增产物量相同 原理：反应物中原始分子数（X）与其所需要的扩增循环次数（n）成反比， 由此计算出标本中靶分子的准确含量，即： LgX=LgY–n×Lg(1+Ev)=b - n×a (a、b为常数)
✓ n: 扩增循环数的确定
PCR efficiency =[10(-1/slope)]-1 Where slope=1/m
核酸的定量测定(定磷法)
⑨吸量管。
⑩分光光度计。
2．试剂：
以下试剂均用分析纯，溶液要用重蒸水配制。
①标准磷溶液：将分析纯磷酸二氢钾（KH2PO4）预先置于105℃烘箱烘至恒重。然后放在干燥器内使温度降到室温，精确称取0.2195克（含磷50毫克），用水溶解，定容至50毫升（含磷量为1毫克/毫升），作为贮存液置冰箱中待用。测定时，取此溶液稀释100倍，使含磷量为10微克/毫升。
五、结果与讨论：
1．绘制出标准曲线。
2．计算
RNA的含磷量为9.5%，因此可以根据磷含量计算出核酸量，即1微克RNA磷相当于10.5微克RNA。将测得的总磷量减去无机磷量即RNA磷量。如样品中含有DNA时，RNA磷量尚需减去DNA磷量，才得到RNA磷量。DNA的含磷量平均为9.9%。
3．测无机磷量：取4支离心管，于2支中各加水0.5毫升，另2支中各加0.5毫升制备的RNA溶液，然后于4支离心管中各加0.5毫升沉淀剂，摇匀，以3500转/分离心15分钟，取0.1毫升上清液，加2.9毫升水和3毫升定磷试剂，同上法比色，由标准曲线查出无机磷的微克数，再乘以稀释倍数即得每毫升样品中的无机磷量。
取4支硬质玻璃试管，分成两组，分别加入1毫升上述消化后定容的样品和空白溶液，如前法进行定磷比色测定。测得的样品光密度减
去空白光密度，并从标准曲线中查出磷的微克数，再乘以稀释倍数即得每毫升样品中的总磷量。
②定磷试剂3mol·L-1硫酸∶水∶2.5%钼酸铵∶10%抗坏血酸=1∶2∶1∶1（体积比）]：配制时按上述顺序加试剂。溶液配制后当天使用。正常颜色呈浅黄绿色，如呈棕黄色或深绿色不能使用，抗坏血酸溶液在冰箱放置可用1个月。
③沉淀剂：称取1克钼酸铵溶于14毫升70%过氯酸中，加386毫升水。
定量PCR 简介
定量PCR简介聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）是微量核酸扩增的有效工具，由于其灵敏、特异、快速等优点，在医学上已广泛应用与病毒、细菌病原体及遗传病、肿瘤的早期诊断。
随着PCR技术的发展，特别是病毒或肿瘤的治疗监测、疾病的诊断、机体基因表达调控方面，不仅需要检测其存在是否；而且还需要得知扩增前标本中的模板的数量，因而必须对PCR进行定量检测，即定量PCR技术，本文将对定量PCR的定量原理、技术类型以及相关进展方面综述如下：一、定量PCR的基本原理：在PCR实验条件下（Mg++、缓冲液、Taq酶、dNTP、引物、模板），经变性→退火→延伸的一个循环，引物在退火阶段与相应的模板结合，在延伸阶段进行复制，此时产物为：Yn=Yn-1×(1+Ev) ,Yn:n个PCR循环后PCR产物的分子数；Yn-1:为n-1个热循环后PCR产物的分子数；Ev:为扩增效率,0≤Ev≤1；若n个热循环中其Ev是一致的话，经n个循环后的扩增产物的分子数（Y）和反应物中原始分子数（X）之间关系，可描述为：Y=x×(1+ Ev)n。
1. 终点法定量原理：在最佳实验、循环次数n一定、Ev相同的前提下，根据扩增产物的量可以计数出反应物中原始分子数，若核酸提取效率相同（与标准品），进而计算出标本中靶分子的准确含量，即：lnx=lnY-n×ln(1+Ev)=lnY - b (b为常数)2. 实时检测法定量原理：在最佳实验、相同Ev以及相同扩增产物的情况下，反应物中原始分子数（X）与其所需要的扩增循环次数（n）成反比，若核酸提取效率相同（与标准品），进而计算出标本中靶分子的准确含量，即：LgX=LgY–n×Lg(1+Ev)=b - n×a (a、b为常数)3. 扩增效率（Ev）的影响因素：以上所述的定量原理均假定反应体系中扩增效率是不变，但是，实际上，Ev在不同的扩增管之间和同一扩增管的不同循环次数之间是不同，如何控制及解决Ev的变异以及标本制备的可靠性是PCR定量的可靠性所在，也是定量PCR的发展方向，那么，Ev的影响因素有：a. 引物和靶序列的结合能力（G+C%及突变），扩增产物的长度，G+C含量。
核酸的定量分析方法
光
分
析
DNA
法
AO-ST体系能 量发生荧光猝 灭
DNA浓度与荧光 猝灭强度呈线性 关系
检出限 2.6× 10-7mol/L
线性范围为 0～ 1.1× 10-6mol/L
1.DNA促进AO-ST间的荧光能量转移
下图表明ST的电子吸收光谱与AO的荧光发射光谱重叠。AO的荧
光在ST存在时明显地被淬灭，说明两者在水溶液中存在能量的转
准确、分析适应性广等特点。
DNA电化学生物传感器：基本原理
电
电压
ssDNA
化
（单链DNA）
学 法
杂交反应
电流
待测溶液
（样品中与之互补 的另一条DNA）
电导
样品中DNA的结构 和含量的测定
差分脉冲和方波伏安法研究亲和素-生物素固载ssDNA的生物传感器
Pt电极预 处理（抛光）
ssDNA在铂 电极表面的 固定化
核酸(DNA或RNA)在中性至碱性介质中由于核苷酸上磷酸基的离 解而能以有机 离子形式存在，因此能用某些碱性染料对其加以 测定。
定
以后所测得的含磷量，以及该样品的无机磷含量，即样品未经消化
磷
法
直接测得的含磷量。将总磷量减去无机磷才是该有机磷物质的含磷
量。
定磷法简单、快速、灵敏度高，但是受蛋白质和核苷酸的影响。
核苷、核苷酸、核酸的组成成分中都有嘌呤、嘧啶碱基，这些碱基
紫
都具有共轭双键 （ -C-C=C-C=C-），在紫外光区的250-280nm处有强烈
紫 外
RNA的质量浓度(mg/L)＝ A260nm 稀释倍数
吸
0.024 L
收
DNA的质量浓度（mg / L) A260nm 稀释倍数
定量PCR基本原理及方法-PPT精品文档
成反比，由此计算出标本中靶分子的准确含量，即：
LgX=LgY–n×Lg(1+Ev)=b - n×a (a、b为常数)
Ampliflour Probe，LUX
定量分析
基因型分析
利用扩增信号的种类来分型 —— Taqman
根据熔解曲线的不同来分型 —— FRET, Molecular Beacon LC Green
利用扩增信号的种类来分型 双Taqman探针法检测野生型和突变型
在基因型分析中，可采用两种不同的Taqman探针（分别针对野生型和突变型)，即一个突 变型探针以一种荧光素（Flr）标记，而野生型探针则用不同的荧光物（Tet）标记。如果只有 一种信号被扩增出来，则样本为对应的基因型（野生型或突变型）的纯合子；如二者都被有效 地扩增出来，则样本为杂合型。
后来用与双链DNA有更强结合力的SYBR Green I取代EB
荧光定量PCR的定量原理
PCR的理论方程： Y=x×(1+ Ev)n Real-time Chemistries
Y：扩增物数量； X ：起始模板数量；Ev：扩增效率；n：扩增循环数
1. 终点法定量原理
前提：在最佳实验、循环次数n一定、Ev相同
定量PCR基本原理及方法
基因有限公司 黄妤
内 容
一． 荧光定量PCR基本原理 二． 荧光定量PCR标记方法 三． 荧光定量PCR不同方法学的应用
一．荧光定量PCR基本原理
实验七 核酸的定量
成分测定
取200mg提取的核酸，加入3mol/L硫酸10ml，在沸 水浴中加热10min制成分解液并进行组分的鉴定。
1、嘌呤碱 取水解液1ml加入过量浓氨水，然后加 入约1ml 0.1mol/L硝酸银溶液，观察有无嘌呤碱的 银化合物沉淀。
2、核糖 取一支试管加入水解液1ml、三氯化铁浓 盐酸溶液2ml和苔黑酚乙醇溶液0.2ml。放沸水浴中 10min。注意溶液是否变成绿色，说明核糖的存在。
二、器材与试剂
1、试剂的配制 钼酸铵-过氯酸沉淀剂[0.25%钼酸按-2.5%过
氯酸溶液]：取3.6ml 70%过氯酸和0.25g钼酸 铵溶于96.4ml蒸馏水中。 样品DNA 2、器材 容量瓶（50ml）、离心管、离心机、紫外分 光光度计。
三、操作步骤
取两支1.0ml小离心管，甲管加入0.5ml样品 和 0.5ml 蒸 馏 水 ； 乙 管 加 入 0.5ml 样 品 和 0.5ml钼酸铵-过氯酸沉淀剂，摇匀，在冰浴 中放置15min，以3000r/min离心10min，分 别取上清液0.75ml在量筒中定容到25ml，备 用。
干扰因素
蛋白质由于含有芳香氨基酸，因此也能 吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在 280nm波长处，在260nm处的消光值仅为核 酸的十分之一或更低，故核酸样品中蛋白质 含量较低时对核酸的紫外测定影响不大。 RNA的260nm与280nm消光值的比值在2.0以 上；DNA的260nm与280nm消光值的比值则 在1.8左右。当样品中蛋白质含量较高时比 值即下降。
2、二苯胺试剂为什么要溶于浓醋酸? 3、请分析自己的DNA样品。
三、操作 1、提取 称取干酵母粉2g于50mL三角瓶内。加
10% NaCl溶液10mL，搅拌均匀，然后于沸水浴 中提取半小时。 2.分离 将上述提取液取出，用自来水冷却，分装 在离心管内，以3500r/min离心10min，使提取 液与菌体残渣等分离。 3.沉淀RNA 将离心得到的上清液倾于50mL烧杯 内，并置于有冰块的250mL烧杯中冷却。待溶液冷 至10℃以下时，在搅拌下小心地加入等体积的酸性 乙醇，随着酸性乙醇的加入，溶液的逐步下降，溶液 中白色沉淀也逐渐增加，当 pH=2.5（RNA 等电 点）时沉淀量最多（注意严格控制pH值），继续于 冰浴中静置10min，使沉淀充分，颗粒变大。
核酸的定量测定—定磷法
溶液呈无色可淡蓝色为止，稍冷却，加1ml水，于100 ℃加热10分钟使焦磷酸转变为磷酸。冷至室温，用蒸 馏水定容到50ml。与样品消化的同时做空白对照，空 白瓶中不加样品，用水替代，其它完全相同。 取稀释后的消化液1ml，加水2ml，定磷试剂3ml， 摇匀，45 ℃放置20分钟，于660nm处读取OD值。空白 对照同样操作。 3. 样品中无机磷含量测定： 取未消化的核酸样品液1ml用水定容到50ml。从中取 1ml，加2ml水，3ml定磷试剂，摇匀后保温，然后读
核苷酸的消化和核酸一样。此外嘌呤类核苷 酸可用1.5mol/L的HCL，100℃ 水解1小时脱磷； 嘧啶类核苷酸可用10mol/L H2 SO4 消化1—2个小 时脱磷。
二，试剂
1.标准磷试剂（含磷5µg/ml）:准确称取恒重 （105℃ ）的 KH2 PO4 0.4389g,用水定容到100ml，此液 的浓度为1mg/ml，用前再稀释200倍，即为5µg/ml。 2.定磷试剂： (1)6mol/L硫酸：取17ml浓硫酸（比重1.84）缓缓加 入83ml水中。 (2)2.5%钼酸铵：2.5g钼酸铵溶于100ml水中 (3)10%抗坏血酸溶液：取10g抗坏血酸溶于100ml水 中。棕色瓶4 ℃ 贮藏。溶液应为淡黄色，深黄色或棕 SO •5H O）：硫酸钾
4 2
（ K2 SO4）=1：4（W/W）,研成细末。 4. 30%过氧化氢，浓硫酸
三，操作方法
1.制作磷标准曲线： 取标准磷酸溶液（ 5µg/ml ）0，0.5，1.0，1.5，2.0， 2.5，3.0ml，用水补足到3ml，含磷量分别为0，2.5，5， 7.5，10，12.5，15 µg，加定磷试剂3ml后摇匀，45 ℃ 放置20分钟，测 。以含磷量为横坐标， 为 OD660 纵坐标制作标准曲线。 OD660 2. 核酸中总磷量的测定： 取1ml被测样品液（约含2.5—5mg核酸，也可取固 体样品），置于消化瓶中，加入1ml浓硫酸及50mg催 化剂，在消化炉上加热至发白烟，样品由黑变成淡黄 色，取下稍冷，加数滴30%过氧化氢液，继续加热至
1定量PCR基本原理
1定量PCR基本原理定量PCR（Quantitative Polymerase Chain Reaction）是一种利用DNA复制技术进行定量测定DNA数量的方法。
它是PCR技术的一种改进，在遗传学、疾病诊断、药物研发等领域有广泛应用。
以下是定量PCR的基本原理的详细介绍：1.反应体系组成：定量PCR所需的反应体系包括DNA模板、引物、荧光探针、聚合酶、缓冲液、dNTPs和MgCl2等组分。
DNA模板是待测DNA的起始材料，引物是用于扩增特定DNA片段的寡核苷酸引物，荧光探针则会结合到PCR产物上生成荧光信号用于检测和计量。
2.PCR扩增步骤：定量PCR扩增过程包括三个主要步骤：变性、退火和延伸。
首先，将反应体系加热至95°C，使DNA双链解开变性为两条单链。
然后，将温度降低至特定的温度，使引物能够与DNA靶序列结合。
引物结合后，聚合酶开始在两条单链DNA上合成新的DNA链。
这一过程称为延伸。
随着循环的进行，PCR产物的数量呈指数增加。
3.荧光信号检测：定量PCR中使用特定的荧光探针来检测扩增产物的数量。
这些荧光探针一般由两个部分组成：探针序列和荧光染料。
探针序列与待测DNA的靶序列互补配对，而荧光染料则位于探针的末端。
在PCR过程中，引物扩增到接近探针的位置时，3'末端荧光染料会与5'末端的荧光信号发生共振能量转移（FRET），从而发出荧光信号。
通过测量这些信号的强度，可以推断PCR产物的数量。
4.标准曲线和计量：为了进行定量测定，标准曲线是必不可少的。
标准曲线是一系列已知浓度的标准品所构建的，通过对标准品进行PCR扩增并测量荧光信号的强度，可以建立起PCR产物浓度与荧光强度之间的关系。
通过测量待测样品的荧光强度，并根据标准曲线进行插值计算，可以得出待测样品中特定DNA序列的浓度。
5.分析和解释结果：定量PCR的结果可以通过多种途径进行分析。
一种常见的方法是计算待测样品和标准样品之间的CT值差，通过该差值来比较两者的浓度。
核酸的定量分析方法
核酸的定量分析方法核酸的定量分析方法主要包括吸光光度法、DNA染色剂法、荧光法和实时荧光定量PCR等。
这些方法具有灵敏度高、选择性好和操作简便等特点，广泛应用于核酸相关的科研和临床领域。
下面将详细介绍这些方法的原理和应用。
吸光光度法是一种常用的核酸定量方法。
其原理是通过测量核酸分子在紫外（UV）或可见光区域吸收的光的强度来确定其浓度。
核酸在UV区域（260 nm）有较高的吸收峰，可以根据表观摩尔吸光系数来计算核酸的浓度。
吸光光度法简单快捷，操作简便，但只能提供核酸总含量信息，无法区分DNA和RNA，并且对于样品中的杂质、蛋白质和其他分子也会产生吸光，进而影响测定结果。
因此，在使用吸光光度法进行核酸定量时，需要对样品进行纯化和质控处理。
DNA染色剂法是另一种常用的核酸定量方法。
该方法利用DNA染色剂如伯胺黑（Ethidium Bromide，EtBr）或 PI（Propidium Iodide）与DNA结合，形成可视化的荧光复合物。
这些染色剂在无核酸或DNA浓度极低时不发光，只有与DNA结合后形成复合物才发光。
通过测量荧光强度，可以确定DNA的浓度。
DNA染色剂法具有较高的选择性和灵敏度，可以用于测定DNA的含量、纯度和相对分子量，但无法区分DNA和RNA。
此外，染色剂法测定DNA浓度时，需要对样品进行染色，并在测量前对染色剂进行去除以避免干扰。
荧光法是一种基于荧光现象的核酸定量方法，常用荧光标记试剂有SYBR Green I和PicoGreen等。
这些试剂可与DNA特异性结合并发出特定波长的荧光。
荧光强度与DNA浓度呈线性关系，通过测量荧光强度可以精确测定DNA浓度。
相比于吸光光度法和DNA染色剂法，荧光法具有更高的灵敏度和特异性，可以实现DNA和RNA的定量分析。
荧光法还可用于检测特定序列的DNA，如PCR扩增产物以及基因表达分析中的定量RT-PCR 实验等。
综上所述，核酸的定量分析方法种类繁多，吸光光度法、DNA染色剂法、荧光法和实时荧光定量PCR是其中常用的方法。
12 生物化学实验--核酸的定量分析
核酸的定量分析【目的】1 ．掌握定糖法、定磷法和紫外吸收法分别定量分析 DNA 或 RNA 的方法。
2 ．熟悉定糖法、定磷法和紫外吸收法分别定量分析 DNA 或 RNA 的原理。
【原理】核酸分子中含有戊糖、磷酸与含氮碱，测定三者之一即可推算出核酸含量。
1 ．定糖法通过测定 DNA 或 RNA 分子中戊糖的含量，从而计算出 DNA 或 RNA 含量的方法。
RNA 在强酸环境中加热可水解产生核糖。
核糖在浓酸作用下脱水形成糠醛，糠醛能与 3 ， 5 - 二羟基甲苯（地衣酚）缩合成绿色化合物（反应式见第 3 篇实验 11 ），其最大吸收峰波长为 670nm ， fe 3+ 或 Cu 2+ 可作为催化剂催化反应，与同样处理的核糖标准液进行比色即可测定出 RNA 的含量。
DNA 在强酸环境中加热水解生成的脱氧核糖与浓酸共热脱水生成ω- 羟基γ- 酮基戊醛，后者与能与二苯胺反应生成蓝色化合物（反应式见实验 11 ），其最大吸收峰波长为 595nm ，与同样处理的脱氧核糖标准液进行比色即可测定出DNA 的含量。
2 ．定磷法通过测定核酸中磷的含量，从而计算出 DNA 或 RNA 含量的方法。
核酸含磷量平均为 8.73% （ RNA 含磷量为 8.5~9% ； DNA 含磷量为 9.2% ）。
用强酸使核酸分子中的有机磷消化成无机磷，在酸性溶液中磷酸与钼酸作用生成磷钼酸，后者在还原剂（如抗坏血酸、α-1 ， 2 ， 4- 氨基萘酚磺酸等）存在时，立即被还原为蓝色的钼蓝（反应式见实验 11 ），其最大吸收峰波长为660nm 。
当无机磷浓度在 2.5~25μg/ml 范围内时，溶液的吸光度值与磷含量成正比。
本法测得的磷含量为样品中的总磷量，需同时测定未消化样品中无机磷的含量，将测得的总磷量减去原无机磷含量即为样品中核酸的含磷量，进而计算核酸的含量。
3 ．紫外吸收法核酸分子中的嘌呤环和嘧啶环的共轭双键具有吸收紫外光的性能，最大吸收峰波长为 260nm ，不论是核苷、核苷酸或核酸，在此波段内都具有吸收紫外光的特性。
核酸的定量测定.
0
3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0
2. 将试管内溶液立即摇匀，置沸水浴内25-30分钟。取 出冷却至室温，于670nm处测定OD值。
3. 以0-5号管RNA浓度为横坐标，对应光密度为纵坐标 ，绘出标准曲线。
4. 根据6号管测得的OD值，从标准曲线求出RNA待测 液浓度。
2. 在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应灵敏 度。除DNA外，脱氧木糖，阿拉伯糖（五碳糖 ）也有同样反应。其它多数糖类，包括核糖在 内，一般无此反应。
• 三、 实验步骤
• 1. 取同样规格的试管7支，按下表顺序分别精 确地加入各试剂。
编号
1
2
3
4
5
6
7
ห้องสมุดไป่ตู้
DNA标准液(200ug/mL) 蒸馏水(mL)
（一）琼脂糖凝胶电泳
用于大片段DNA或RNA的分离，精度低，但分 离范围广。
电泳迁移率决定于： （1）核酸分子的大小 （迁移率与相对分子质量对数成反比） （2）胶浓度 （迁移率与胶浓度成反比，常用0.7～1%） （3）DNA的构象：超螺旋＞线状分子＞开环状分子
（4）电压 （一般5V/cm,电压与迁移率成正比) （5）碱基组成（影响不大） （6）温度（4～30℃都可以，常室温进行）
0.00 0.00 4.00 2.00
Y X
2. 将试管内溶液立即摇匀，于70℃恒温水浴内保温5060分钟。取出冷却至室温，于595nm处测定OD值 。
3. 以1-6号管DNA含量（微克）为横坐标，光密度为纵 坐标，绘出标准曲线。
4. 根据7号管测得的OD值，从标准曲线求出DNA待测 液中的DNA含量。
B
2. 将试管内溶液立即摇匀，于45℃恒温水浴内保温3045分钟。取出冷却至室温，于660nm处测定OD(光密 度)值。
核酸的定量测定定磷
总磷
3
无机磷
3 3 3
四、实验结果
总磷A660nm－无机磷A660nm= 有机磷A660nm 由标准曲线查得有机磷微克数（ X）。按下试 计算样品中核酸百分含量。
( X / 测定时取样的ml数 ) ×稀释倍数 × 11
核酸% = ——————————————————— ×100%
样品重量(g)
3、无机磷的测定：
吸取样品液（2mg/1ml）1.0 ml，置于100 ml容量瓶中， 加水至刻度，摇匀后，吸取3.0 ml置于试管中，加定 试剂3.0 ml，45℃水浴保温10分钟，冷却，测其光吸 收值。
管 号
试 剂 总磷样品液(ml) 无机磷样品液(ml) 定磷试剂(ml) A660nm
0
3(蒸馏水) 3 0
表1 核酸含量的测定——标准曲线的绘制 管 号
试 剂 标准磷溶液(ml) 蒸馏水(ml) 定磷试剂(ml)
0
0 3.0 3
1
0.2 2.8 3
2
0.4 2.6 3
3
0.6 2.4 3
4
0.8 2.2 3
5
1.0 2 3
A66ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱnm
0
2、总磷的测定：
准确称取样品（如粗核酸） 0.1 克，用少量水溶解， （如不溶，可滴加 5% 氨水调至 pH7.0），转移至 50ml 凯氏烧瓶中 , 加水至刻度。吸取上面的样品液 1.0mL，置于50ml凯氏烧瓶中，加入2.5毫升10mol/L H2SO4，将凯氏烧瓶接在凯氏消化架上（或在通风 橱内），在电炉上加热，至溶液透明，表示消化完 成。冷却，将消化液移入100ml容量瓶中，用少量蒸 馏水洗涤凯氏烧瓶两次，洗涤液一并倒入容量瓶， 再加水至刻度。混匀后，吸取3.0ml置于试管中，加 定磷试剂3.0 ml，摇匀，45℃保温10分钟，冷却。测 其A660nm。
定量pcr原理
定量pcr原理定量PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种利用DNA聚合酶链式反应技术量化检测目标DNA数量的方法。
该方法基于DNA的反链合成原理，通过多次反复复制目标DNA序列，将其扩增到可检测范围。
定量PCR主要包括准备试剂、反应体系的构建、PCR扩增条件的优化和PCR产物的检测四个步骤。
首先，准备试剂包括模板DNA、引物（前向引物和反向引物）、DNA聚合酶、dNTP（即四种脱氧核苷酸）、缓冲液和MgCl2等。
其次，构建反应体系。
通过将模板DNA、引物、DNA聚合酶、dNTP、缓冲液和MgCl2混合，得到PCR反应液。
引物是特异性序列，可与目标DNA的两个端点互补结合，成为PCR反应的开始和结束点。
然后，优化PCR扩增条件。
这涉及到温度条件和PCR循环数的调整。
PCR反应通常包括三个步骤：变性、退火和延伸。
在变性步骤中，PCR反应液在高温下使目标DNA双链解离为两条单链；在退火步骤中，引物与目标DNA的单链以互补碱基配对的方式结合；在延伸步骤中，DNA聚合酶将dNTP加入到引物的5'端扩增产物的3'端，从而合成一个新的DNA链。
最后，检测PCR产物。
这可以通过凝胶电泳、荧光定量PCR或实时定量PCR等方法进行。
实时定量PCR是一种通过荧光信号实时监测PCR反应进程的方法，可以准确地测量PCR产物的数量。
根据荧光信号的增加，可以定量计算出起始DNA 模板的数量。
总的来说，定量PCR是一种可靠且高敏感的方法，可以准确地测量目标DNA的数量。
它在医学诊断、基因表达研究、遗传学分析等领域具有广泛的应用价值。
核酸定量的方法和原理应用
核酸定量的方法和原理应用一、方法简介核酸定量是实验室中常用的一项技术，用于确定核酸样品中的DNA或RNA的浓度。
准确的核酸定量是许多分子生物学实验的基础，包括聚合酶链式反应(PCR)、脱氧核糖核酸测序和基因表达分析等。
本文将对常见的核酸定量方法和其原理应用进行介绍。
二、常见的核酸定量方法1. 吸光度法(Absorbance method)吸光度法是最常用的核酸定量方法之一。
该方法是基于核酸在紫外光区域的吸收特性来测定其浓度。
核酸样品溶液吸收紫外光的程度与其浓度成正比，可以通过测定吸光度来确定核酸的浓度。
通常使用比色杯、分光光度计或多功能酶标仪等设备进行测量。
2. 荧光染料法(Fluorometric method)荧光染料法是一种常用的核酸定量方法，适用于测定低浓度的核酸样品。
该方法通过加入荧光染料与核酸结合，形成荧光复合物并测量其荧光强度来定量核酸。
常用的荧光染料有SYBR Green、Ethidium Bromide等，可以使用荧光光度计来进行测量。
3. 核酸电泳法(Electrophoresis method)核酸电泳法是一种直接观察核酸浓度的方法。
通过将核酸样品在琼脂糖凝胶上进行电泳分离，根据核酸带的强度和大小来估算核酸的浓度。
该方法适用于检测纯度较高的核酸样品，并可同时检测DNA和RNA。
可以使用核酸电泳仪进行实验操作。
三、核酸定量原理应用1. 核酸质量浓度的计算核酸定量方法可以进一步应用于核酸质量的计算。
根据核酸浓度，通过知道样品的体积大小可以计算出样品中的核酸质量。
这对于实验中需要精确配制核酸样品的工作非常重要，同时也有助于确定实验所用核酸的最佳浓度。
2. 酶切反应的优化核酸定量方法可用于酶切反应的优化。
酶切反应是分子生物学研究中常用的方法之一，通过将核酸样品与特定酶酶解，可以切割特定的DNA或RNA序列。
根据核酸定量结果，可以确定切割反应中所需的核酸样品的最佳浓度，从而优化酶切反应的结果。
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核酸定量方法及原理
广泛用于测定制备物中核酸含量的方法有两类。
如果样品较纯（即蛋白质、酚、琼脂糖以及其他核酸等杂质含量较低时），可通过分光光度法测定其吸收紫外线的量，既简便又准确。
若样品中DNA或RNA含量较低或含有较多杂质，则可以通过溴化乙锭或Hoechst 33258等荧光染料所发出的荧光估测核酸的含量。
DNA或RNA的分光光度法测定
核酸的定量是分光光度计使用频率最高的功能。
可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸，单链、双链DNA，以及RNA。
核酸的最高吸收峰的吸收波长 260 nm。
每种核酸的分子构成不一，因此其换算系数不同。
定量不同类型的核酸，事先要选择对应的系数。
如：1OD 的吸光值分别相当于50μg / mL的dsDNA，37μg / mL的ssDNA， 40μg/mL的RNA，30μg/ mL的寡核苷酸。
测试后的吸光值经过上述系数的换算，从而得出相应的样品浓度。
测试前，选择正确的程序，输入原液和稀释液的体积，而后测试空白液和样品液。
然而，实验并非一帆风顺。
读数不稳定可能是实验者最头痛的问题。
灵敏度越高的仪器，表现出的吸光值漂移越大。
事实上，分光光度计的设计原理和工作原理，对应吸光值在一定范围内变化，即仪器有一定的准确度和精确度。
另外，还需考虑核酸本身理化性质和溶解核酸缓冲液的pH 值、离子浓度等。
在测试时，离子浓度太高也会导致读数漂移，因此建议使用pH 值一定、离子浓度较低的缓冲液（如TE）可大大稳定读数。
样品的稀释浓度同样是不可忽视的因素：由于样品中不可避免存在一些细小的颗粒，尤其是核酸样品。
这些小颗粒的存在干扰测试效果。
为了最大程度减少颗粒对测试结果的影响，要求核酸吸光值至少大于0.1A ，吸光值最好在0.1-1.5 A。
在此范围内，颗粒的干扰相对较小，结果稳定。
从而意味着样品的浓度不能过低，或者过高（超过光度计的测试范围）。
最后是操作因素，如混合要充分，否则吸光值太低，甚至出现负值；混合液不能存在气泡，空白液无悬浮物，否则读数漂移剧烈；必须使用相同的比色杯测试空白液和样品，否则浓度差异太大；换算系数和样品浓度单位选择一致；不能采用窗口磨损的比色杯；样品的体积必须达到比色杯要求的最小体积等多个操作事项。
除了核酸浓度，分光光度计同时显示几个非常重要的比值表示样品的纯度，如A260 / A280的比值，用于评估样品的纯度，因为蛋白的吸收峰是280 nm。
纯净的样品比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）。
假如比值低于1.8 或者2.0，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。
A230表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物、多肽、酚盐离子或硫氰酸盐等，较纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0 。
A320检测溶液的颗粒度、混浊度和其他干扰因子。
纯样品的A320一般是 0。
水饱和酚在270nm处有特征吸收，无酚的核酸制品A260/A270比值约为1：2。
各波长具体含义及相关问题
1．A260nm是核酸最高吸收峰的吸收波长，最佳测量值的范围为0.1至1.0。
假如不在此范围，稀释或浓缩样品，使之在此范围内；假如吸光度小于0.05，检查是否存在操作因素（如移液不准确，样品内有悬浮物等）影响。
朗伯－比尔定律：
A 吸光值
I0 入射光强度
I 投射光强度
c 吸光物质的摩尔浓度（mol/L）
d 光通过的液层厚度（cm）
ε摩尔吸光系数（Lmol-1cm-1）
2．A280nm是蛋白和酚类物质最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估：纯DNA的A260/A280比值为1.8，纯RNA为2.0。
假如比值低，表示受到蛋白（芳香族）或酚类物质的污染，需要纯化样品。
3．A230nm是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估：纯DNA和 RNA的A260/A230比值为2.5。
若比值小于2.0表明样品被碳水化合物（糖类）、盐类或有机溶剂污染，需要纯化样品。
4．A320nm或A340nm为检测溶液样品的浊度，该值应该接近0.0。
假如不是，标明溶液中有悬浮物，需要纯化样品。
5．核酸的吸光值受pH值和缓冲液离子浓度影响。
只有在一定的pH值和低离子浓度的条件下（如10 mM Tris-HCl pH 8.0），才能得到精确的检测结果。
核酸是一切生物都含有的存在于细胞核的重要成分,是生命现象中不可缺少的生物大分子,也是生物遗传信息的载体,它控制着蛋白质的合成和有机体细胞的机能,在生物的生长、发育、繁殖、遗传和变异等生命活动中占有极其重要的地位.随着分子生物学的广泛应用,核酸定量已经成为一种常规化的实验手段。
66
水的pH值不稳定，可能导致检测误差。
一些缓冲液在紫外范围内存在自身吸收，为了确保准确测量，请使用与悬浮或洗脱样品时相同的缓冲液。
6．在DNA样品的测定中，一些平行测定的样品会表现出测定浓度的变化，其可能原因为：①DNA样品的A260 吸光度值是否>0.1。
（请注重，这个值跟仪器无关，核酸的吸光度必需大于0.1，其值才有效和可靠，因为样品中的杂质和颗粒这些不纯物的干扰通常会对光有一定吸收，其值<0.1）；②待测样品是否经过了充分的混匀，这样才能保证测定值的均一；③待测样品中有相当含量的杂质。
A260/A280和A260/ A230是DNA纯度的指示值，纯度好的DNA，在pH7-8.5 下其比值应该在1.8 或2.5，A230是多肽、芳香基团、苯酚和一些碳氢化合物的吸光度，A280是蛋白质的吸光度。
7．A230产生负值主要是由于在很低DNA 浓度的溶液中的一些其他成分的干扰所导致的。
在下一个测定中，需要降低样品的稀释度，A230的负值会被校正。
同时需要注重的是A260 的读数也必需大于0.1 才能保证可靠的结果。
DNA/RNA的荧光测定
用荧光测定法分析核酸浓度操作简便而且比分光光度法灵敏，可测定纳克级水平的DNA。
由于Hoechst33258对小分子DNA的结合能力较弱，这种方法只能用来测定长度超过1kb 的DNA溶液的浓度。
测定时，讲浓度已知和未知的DNA制品与荧光染料保温，把未知样品的吸收值与一系列浓度已知样品的吸收值相比较，通过内推法，可得未知样品的浓度。
Picogreen染料是一种新型的dsDNA染料：其检测灵敏度高，可检测到pg级DNA；检测范围宽，可跨越４个数量级；特异性好，基本不受ssDNA和RNA的影响，并且可以耐受一定浓度的盐、尿素、乙醇、氯仿、去垢剂、蛋白等干扰。
目前使用Picogreen染料定量检测DNA已经广泛用于生物学检测，并被2010年版《中华人民共和国药典》选为药物残留DNA定量方法。
有时样品中DNA含量不足以通过分光光度法测定，有时DNA严重污染有吸收紫外射线的其他杂质而妨碍准确测定，一个快速的办法是利用溴化乙锭嵌入DNA分子中后由紫外激发的荧光来估测这种样品中DNA的含量。
由于荧光强度与DNA总量成正比，可通过比较样品和一系列标准溶液产生的荧光估测DNA含量。
RiboGreen RNA定量试剂是一种超灵敏的核酸荧光染料，使用这种染料可以对溶液中的RNA进行简单快速的定量。
常规定量RNA的方法是在260nm处检测溶液的光吸收度，但是这种定量方法灵敏度差（4μg/mL RNA），且易受溶液中寡核苷酸、蛋白、盐离子等的影响。
使用RiboGreen荧光染料可以避免上述这些问题。
当RiboGreen荧光染料处于溶液状态时，其几乎没有荧光活性；当RiboGreen与RNA结合，其荧光活性将增加1000倍。
RiboGreen-RNA复合物的荧光激发波长约500nm，发射波长约525nm。
使用RiboGreen荧光染料可以检测到2.5ng/mL的RNA，这比260nm吸收法要高出千倍。
67。