实验十讲义五：酸性磷酸酶的显示
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• 2．细胞化学技术要求：保持样品的形态结构不发生改变；保存 细胞内生前化学成分及酶的活性；显示成分的化学反应必须对将 被显示的化学物质有高度特异性和高度灵敏性；反应所生成的产 物要在原位沉淀、显色明显、不溶、不扩散，并在重复实验中结 果一致。
• 3．染色的作用：由于正常的生物组织是无色透明的，因此无法 在光镜下进行观察。因此必须要对样品进行染色；染色剂可以渗 透到组织的间隙中，细胞中的蛋白质等成份可以吸附不同的色素 粒子；染色剂中的阳离子和阴离子可分别与细胞中的酸性、碱性 物质相结合。染色就是根据这些原理，利用染色剂与细胞内含物 的物理作用与化学作用，将细胞和组织染成各种不同的颜色；由 于染色剂的化学性质不同，以及固定材料时所用的固定剂不同， 染色剂对被染色的组织有一定的选择性，从而使某些部位染色很 清楚，而另一些部位可能完全不着色。例如，有些染色剂可染细 胞核，有些染色剂可染细胞质。
• 4．染色的方法：（1）利用化学原理进行的染色方法：金属沉淀 法：利用酶催化反应形成的分解产物与金属化合物反应，最终生 成有色沉淀，借此辨认所要检查的酶的活性。偶氮偶联法：用人 工合成的酶底物在酶的作用下产生分解产物，后者与重氮盐结合
形成不溶性的偶氮色素。Schiff反应法：游离的醛基可使Schiff试 剂中的无色品红变为紫红色产物，这种反应通常用于显示多糖类
精品
实验十五：酸性磷酸酶的显示
• 【目的要求】 • 1．熟悉酸性磷酸酶显示方法的原理及操作步骤 • 2．观察酸性磷酸酶在细胞中的分布
• 【基本原理】
• 1．细胞化学：细胞化学是在保持细胞原有形态结构的基础上， 利用已知的化学反应原位显示细胞内的某种化学成分，然后通过 显微镜进行定性、定位、定量研究的科学。
谢途径和细胞增殖周期；（3）利用免疫学原理的染色方法：大 分子物质具有免疫原性可制备特异抗体。用各种标记物如荧光素 、辣根过氧化物酶和胶体金等标记该抗体，利用免疫学抗原抗体
反应原理，用标记抗体显示相应抗原。
• 5．酸性磷酸酶的显示方法：酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）主要存在于巨噬细胞，定 位于溶酶体内。在溶酶体膜稳定完整时，底物不 易渗入，ACP活力微弱或无活性，经固定，在合 适pH条件下，膜本身变为不稳定，逐渐改变其渗 透性，底物可以渗入，酶活力被显示。ACP在酸 性条件下（pH4.7）可使作用液中的底物β-甘油磷 酸钠的磷酸根解离出来，进而与溶液中硝酸铅结 合形成磷酸铅沉淀，因其是难溶解的无色沉淀物 ，需要与黄色的硫化铵作用，生成棕黑色PbS沉 淀而被显示出来。
灭菌的3%淀粉溶液1ml注射于小鼠腹腔内，每天 一次。 • 2．颈椎脱臼处死小鼠，打开腹腔。 • 3．吸取少量腹腔液，在玻片上涂层一薄层，室温 晾干。 • 4．将涂片滴置于温盒中，滴加适量ACP作用液， 37℃作用30分钟。取出后，蒸馏水漂洗。用10% 甲醛钙溶液后固定5min。 • 5．玻片入2%硫化胺溶液作用2～3min，进行显 色。取出后蒸馏水漂洗，镜检。 • 6．对照组的作用液中不加β-甘油磷酸钠，而以蒸 馏水代替；或入作用液前先用高温（50）处理 30min，使酶失去活性，作好标记，然后同时进 行上述实验。
• β-甘油磷酸钠 甘油+PO3-
• PO4 +Pb（NO3)2
Pb2（PO4)2
• Pb2（PO4)4 +（NH4)2S PbS
• 【实验用品】
• 1．器材：注射器、解剖用具、恒温水浴锅、载玻 片、盖玻片
• 2．试剂：3%淀粉溶液；ACP作用液；2%硫化铵
• Gomori硝酸铅作用液
• 0.05mol／L醋酸缓冲液（pH5)
（PAS反应）和脱氧核糖核酸（Feulgen反应）。联苯胺法：过 氧化物酶分解H2O2产生氧，后者再将无色联苯胺氧化成联苯胺 蓝，进而变成棕色化合物。四唑盐显示脱氢酶；（2）利用物理 学原理进行的染色：脂溶染色法：借苏丹染料溶于脂类而使脂类 显色。荧光分析：借某些物质可被紫外线激发产生可见荧光而被 显示。也可用荧光染色法将特定的荧光染料对细胞中的化学成分 染色，在荧光显微镜下对这些成分进行直接观察。放射自显影技 术：用放射性核素标记化合物，使其在细胞中参与代谢，将带有 标记的代谢产物通过放射自显影技术显示出来，借以探测物质代
• 【实验结果】
• 酸性磷酸酶活性结构呈棕黄色至棕黑色。
• 对照：在处理过程中，在作用液中不加入甘油磷酸钠而加 入蒸馏水，则呈 阴性。
THANK YOU
lOOml
• 0.6醋酸加蒸馏水200ml、取其
Fra Baidu bibliotek
42ml
• 醋酸钠1.36g加蒸馏水200ml，取其158ml共
200ml
• B-甘油磷酸钠
2g
• 醋酸铅
2g
• 5％氯化镁
5ml
• 以上作用液在临用时配制，最终在pH5～5.2，过 滤使用。
• 3．材料：小鼠腹腔液涂片
• 【方法步骤】 • 1．免疫动物：实验前4～6天用无菌注射器取已
• 3．染色的作用：由于正常的生物组织是无色透明的，因此无法 在光镜下进行观察。因此必须要对样品进行染色；染色剂可以渗 透到组织的间隙中，细胞中的蛋白质等成份可以吸附不同的色素 粒子；染色剂中的阳离子和阴离子可分别与细胞中的酸性、碱性 物质相结合。染色就是根据这些原理，利用染色剂与细胞内含物 的物理作用与化学作用，将细胞和组织染成各种不同的颜色；由 于染色剂的化学性质不同，以及固定材料时所用的固定剂不同， 染色剂对被染色的组织有一定的选择性，从而使某些部位染色很 清楚，而另一些部位可能完全不着色。例如，有些染色剂可染细 胞核，有些染色剂可染细胞质。
• 4．染色的方法：（1）利用化学原理进行的染色方法：金属沉淀 法：利用酶催化反应形成的分解产物与金属化合物反应，最终生 成有色沉淀，借此辨认所要检查的酶的活性。偶氮偶联法：用人 工合成的酶底物在酶的作用下产生分解产物，后者与重氮盐结合
形成不溶性的偶氮色素。Schiff反应法：游离的醛基可使Schiff试 剂中的无色品红变为紫红色产物，这种反应通常用于显示多糖类
精品
实验十五：酸性磷酸酶的显示
• 【目的要求】 • 1．熟悉酸性磷酸酶显示方法的原理及操作步骤 • 2．观察酸性磷酸酶在细胞中的分布
• 【基本原理】
• 1．细胞化学：细胞化学是在保持细胞原有形态结构的基础上， 利用已知的化学反应原位显示细胞内的某种化学成分，然后通过 显微镜进行定性、定位、定量研究的科学。
谢途径和细胞增殖周期；（3）利用免疫学原理的染色方法：大 分子物质具有免疫原性可制备特异抗体。用各种标记物如荧光素 、辣根过氧化物酶和胶体金等标记该抗体，利用免疫学抗原抗体
反应原理，用标记抗体显示相应抗原。
• 5．酸性磷酸酶的显示方法：酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）主要存在于巨噬细胞，定 位于溶酶体内。在溶酶体膜稳定完整时，底物不 易渗入，ACP活力微弱或无活性，经固定，在合 适pH条件下，膜本身变为不稳定，逐渐改变其渗 透性，底物可以渗入，酶活力被显示。ACP在酸 性条件下（pH4.7）可使作用液中的底物β-甘油磷 酸钠的磷酸根解离出来，进而与溶液中硝酸铅结 合形成磷酸铅沉淀，因其是难溶解的无色沉淀物 ，需要与黄色的硫化铵作用，生成棕黑色PbS沉 淀而被显示出来。
灭菌的3%淀粉溶液1ml注射于小鼠腹腔内，每天 一次。 • 2．颈椎脱臼处死小鼠，打开腹腔。 • 3．吸取少量腹腔液，在玻片上涂层一薄层，室温 晾干。 • 4．将涂片滴置于温盒中，滴加适量ACP作用液， 37℃作用30分钟。取出后，蒸馏水漂洗。用10% 甲醛钙溶液后固定5min。 • 5．玻片入2%硫化胺溶液作用2～3min，进行显 色。取出后蒸馏水漂洗，镜检。 • 6．对照组的作用液中不加β-甘油磷酸钠，而以蒸 馏水代替；或入作用液前先用高温（50）处理 30min，使酶失去活性，作好标记，然后同时进 行上述实验。
• β-甘油磷酸钠 甘油+PO3-
• PO4 +Pb（NO3)2
Pb2（PO4)2
• Pb2（PO4)4 +（NH4)2S PbS
• 【实验用品】
• 1．器材：注射器、解剖用具、恒温水浴锅、载玻 片、盖玻片
• 2．试剂：3%淀粉溶液；ACP作用液；2%硫化铵
• Gomori硝酸铅作用液
• 0.05mol／L醋酸缓冲液（pH5)
（PAS反应）和脱氧核糖核酸（Feulgen反应）。联苯胺法：过 氧化物酶分解H2O2产生氧，后者再将无色联苯胺氧化成联苯胺 蓝，进而变成棕色化合物。四唑盐显示脱氢酶；（2）利用物理 学原理进行的染色：脂溶染色法：借苏丹染料溶于脂类而使脂类 显色。荧光分析：借某些物质可被紫外线激发产生可见荧光而被 显示。也可用荧光染色法将特定的荧光染料对细胞中的化学成分 染色，在荧光显微镜下对这些成分进行直接观察。放射自显影技 术：用放射性核素标记化合物，使其在细胞中参与代谢，将带有 标记的代谢产物通过放射自显影技术显示出来，借以探测物质代
• 【实验结果】
• 酸性磷酸酶活性结构呈棕黄色至棕黑色。
• 对照：在处理过程中，在作用液中不加入甘油磷酸钠而加 入蒸馏水，则呈 阴性。
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• 0.6醋酸加蒸馏水200ml、取其
Fra Baidu bibliotek
42ml
• 醋酸钠1.36g加蒸馏水200ml，取其158ml共
200ml
• B-甘油磷酸钠
2g
• 醋酸铅
2g
• 5％氯化镁
5ml
• 以上作用液在临用时配制，最终在pH5～5.2，过 滤使用。
• 3．材料：小鼠腹腔液涂片
• 【方法步骤】 • 1．免疫动物：实验前4～6天用无菌注射器取已