单克隆抗体亲和层析一步纯化重组人生长激素

单克隆抗体亲和层析一步纯化重组人生长激素陈登鸿　严　鼎　(中国科学院上海生物工程研究中心,上海200233) 中国图书分类号　R393233

单克隆抗体亲和层析技术可用来从体液、组织抽提液、细胞培养液中,特别是从基因工程菌体破碎液等复杂组成物中分离出微量蛋白质和多肽。由于其特异性高,操作简便而迅速,在高价值蛋白质和治疗用多肽的下游处理过程中,作为一种良好的分离纯化工具,有较广泛的适用性。本文运用该技术从人生长激素(hGH)基因工程菌发酵破碎液中一步分离制备高纯度并具有生物活性的重组hGH。

1　材料与方法

111　试剂　Protein A2Sepharose C L4B,Sepharose4B 及C NBr(均系SIG M A产品),小鼠抗hGH、兔抗hGH IgG2HRP本室自制,重组hGH基因工程菌发酵破碎液由中心生化工程室提供。

112　方法

11211　抗单克隆抗体的纯化　用hGH的单抗细胞株3H3[1]制得的腹水,经(NH4)2S O4及Protein A2 Sepharose C L4B亲和柱纯化,制得小鼠抗hGH IgG。11212　双层亲和层析柱的制备　将纯化的小鼠抗hGH IgG通过C NBr法偶联到Sepharose4B珠上,制成亲和层析柱。在柱上层平面加入115cm高的Sephadex G75,成为纯化hGH的双层亲和层析柱。11213　hGH的纯化　将离心后的hGH基因工程菌发酵破碎液加入到3×315cm免疫亲和层析柱上,在洗脱hGH前,先用30倍床体积的P BS(含有012% TRIT ON2100)洗取不吸附的杂蛋白和非特异性结合的蛋白质,再用20倍床体积的P BS洗涤,最后用甘氨酸2HCl洗脱hGH。

11214　hGH纯度的鉴定　亲和层析法纯化的重组hGH纯度由HP LC鉴定,Western Blot分析及与兔抗hGH血清免疫双扩散试验。

11215　hGH的生物活性测定　采用兔肝细胞受体结合的免疫酶标检测法[2]测定hGH的生物活性。2　结果

211　单克隆抗体的纯化　收集到腹水105ml,纯化得到396mg抗体,用E LIS A法测定亲和常数为3×10-9,亚型试验为IgG1型。

作者简介:陈登鸿,男,59岁,副研究员,主要从事免疫化学、细胞免疫和单克隆抗体的研究212　hGH纯度鉴定　396mg的抗hGH IgG1单抗偶联到21ml Sepharose4B珠上,每毫升的Sepharose4B 连接有1817mg单抗蛋白,偶联率为9817%。基因工程菌液325ml经Lowry法测定含741mg蛋白,用3B10和3H3二个单克隆抗体夹心E LIS A测定每ml 含01109mg hGH,总共35143mg。经过亲和层析柱洗脱共得64170ml的hGH产物,共含32156mg hGH,回收率为9119%。每层析1次可从基因工程菌液中纯化23mg左右的重组hGH。经HP LC分析,描绘出一单峰;经Western Blot分析,图谱呈现分子量较接近的2条主带,其中1条实为裂解带,经与兔抗hGH血清的免疫双扩散试验呈现1条清晰的沉淀带。表明获得高纯度的hGH产物。

213　hGH生物活性的测定　亲和层析纯化的hGH 经酶标兔肝细胞GH受体法测定(表1),

表明纯化

重组hGH能与兔肝细胞膜受体结合,生物活性较

好。

表1　纯化的hGH与受体结合反应结果

T ab11　Binding results of purified hGH with receptor

hG H(μg)101000510002150011250016250131201156C ontrol

OD4921118711038019480174201548014580138401330

3　讨论

本法制成的单克隆抗体免疫亲和层析柱,可以

直接从基因工程菌体破碎液中一步分离制备高纯度

的并具有生物活性的重组hGH,其特异性高,操作简

便,活性损失小,产物回收率高等特点。同时本法针

对从发酵破碎液一步分离提取的特点,在亲和层析

方法上作了一点改进,用Shphadex G75(上层)/抗体2

Sepharose4B(下层)双层方法。减小因大量、多次层

析而造成的污染,既增强了柱的使用效率,也延长了

柱的使用寿命,有较大的实用性。

4　参考文献

1　魏　欣,陈登鸿,金静芬et al.人血清生长激素单克隆抗体放射

免疫测定法1中华内分泌代谢杂志,1990;6(3):169

2　H itary F C1An investigation of sites that bind human s omatetropin in the

liver of the pregnant rabbit1Biochem J,1981;198:605

[收稿2000201211　修回2000206229]

(编辑　张　慧)

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陈登鸿等　单克隆抗体亲和层析一步纯化重组人生长激素　第12期