凝胶内沉淀试验p

重链（H链）:根据其抗原性的差异，人类Ig的H链分 为 链 链 链 链 链 重链决定Ig类别 IgG IgA IgM IgD IgE
IgG的特性与功能
1、 由淋巴结和脾脏的浆细胞产生。 2、 在血清中含量最高，占血清Ig总量的75-80%。 3、 是血液循环中主要的防御性抗体，能激活补体、 中和病毒、中和毒素、调理吞噬。
凝胶内沉淀试验
单向扩散试验
沉淀反应
沉淀反应是可溶性抗原与相应抗体在适 当条件下发生特异性结合所出现的沉淀 现象。
沉淀反应
液体内沉淀试验
双向扩散试验
凝胶内沉淀试验
单向扩散试验
液相内沉淀试验


一、絮状沉淀试验 二、免疫浊度试验
凝胶内沉淀试验
该试验利用可溶性抗原和相应抗体在凝胶中扩散， 形成浓度梯度，在抗原与抗体浓度比例恰当的位置 形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环。
4、能通过胎盘，对新生儿抗感染起重要作用。
5、 再次免疫应答产生IgG，为高亲和力抗体。 6、可与葡萄球菌蛋白A（SPA）结合，用于免疫诊断。
临床意义
1.血清多克隆Ig水平增高：各型Ig均增高，见于慢性 细菌感染、肿瘤及某些自身免疫病。
2.血清单克隆Ig水平增高：无活性，见免疫增殖性 疾病。 3.人血清中免疫球蛋白减低，见于免疫 缺陷性疾病。
免疫球蛋白
免疫球蛋白的结构
一、基本结构：四肽链结构 由两条相同的轻链 （Light Chain）和两 条相同的重链（Heavy chain）通过链间二硫 键连结形成。 分子式为：H2L2 四条肽链两端游离的 NH2和COOH方向一致 分别命名为N端和C端
（一）轻链和重链
轻链（L链） κ链 轻链决定型别 κ型 正常人κ：λ≈2 ：1 λ链 λ型
操作方法：
一、琼脂凝胶准备： 1.5%（15g/L）的琼脂凝胶 水浴中煮沸 置56℃水浴中备用 抗IgG血清１ml+59ml琼脂凝胶，置56℃备用。


二、制板: 取洁净干燥玻片，置于水平台上。 吸取琼脂液5ml浇于载玻片上，置室温冷却 凝固。 三、打孔： 待琼脂凝固后，用打孔器打孔。
4）抗血清、待检标本、参考血清的稀释及加样要 准确。沉淀环测量必须准确，若有误差，当乘以稀 释倍数后会成几十倍增长。 5）每批实验均应同步绘制标准曲线。决不可一次做 成，长期应用。
6）扩散时琼脂板应保持水平，以免沉淀环变形， 影响结果判定。
方法评价
免疫球蛋白定量测定较常用的方法有单向扩 散法与免疫浊度法， 前者较为简便，后者更为准确迅速， 免疫浊度法的出现，使沉淀反应达到快速、 微量、自动化的新阶段。
4.新生儿与婴幼儿免疫功能不成熟， 免疫球蛋白较 成人低。
思考题
１.单向琼脂扩散试验原理？
2. 单向扩散试验和双向扩散试验的区别？
结果判断
精确测量各试验孔沉淀环的直径，以各 稀释度工作标准的沉淀环直径为横坐标， 相应孔中IgG含量为纵坐标，在半对数 纸上绘制标准曲线。从标准曲线上可查 得待检血清相应的IgG含量，乘以稀释 倍数，即为待检血清中IgG的实际含量。
(抗原浓度 )
0
10 Fehcy曲线 25
50
100
(直径)
在检测标本的同时，用已 知含量的标准抗原作4～7 个稀释度，同时测量圈的 大小。取对数纸做标准曲 线图。
抗原含量与环径的关系有两种计算方法：


1.Fahey曲线：这种曲线适用于小分子抗原 和较短时间（24h）扩散的结果处理。使用半 对数划线，浓度的对数与扩散圈直径之间呈 线性关系。 用公式表示：logC/d＝K 式中C＝抗原浓度 d＝沉淀环直径， K＝常数。

四、加样： 将待检血清１：14稀释 (100ul血清+生理盐 水1400ul) ， 取稀释血清10ul加入相应的 试验孔中. 同时另入不同浓度的抗原标准品10ul (0.4 g/l 0.6g/l 0.8g/l 1.0g/l)

五、扩散： 将加样的琼脂凝胶板平放于湿盒内，置 37℃24h后观察结果。
适用于小分子量抗原和长时间扩散 （24小时）
实验讨论
注意事项： 1）浇制琼脂板时，抗血清与琼脂要充分混匀， 浇板要均匀、平整、薄厚一致，无气泡，布 满整张玻片。 2）加样孔打得圆整光滑，边缘不要破裂，底 部勿与载玻片脱离。 3）抗血清与溶化琼脂混合时，一定要把溶化 琼脂的温度控制在56℃条件下，如过高会使 抗体变性，过低则琼脂凝固不能浇板或浇板 不均匀，不平整。
要掌握哦！
最常用的凝胶为琼脂糖。适宜浓度的凝 胶可视为一种固相的液体，水分占98％ 以上，凝胶形成网络，将水分固相化。 抗原和抗体蛋白质在此凝胶内扩散，犹 如在液体中自由运动。由于琼脂网孔有 一定的限度，抗原抗体结合后，这种超 大分子则被网络在琼脂中，形成沉淀。
Байду номын сангаас
凝胶内沉淀试验可根据抗原与抗体 反应的方式和特性，分为单向扩散 试验和双向扩散试验。
双向扩散试验

在琼脂内抗原和抗体自由扩散，在 最恰当的比例处形成抗原抗体沉淀线。
单向扩散试验
本试验是在琼脂胶中混入一定 量抗体，使待测的抗原溶液从局 部向琼脂内自由扩散，在一定区 域内形成可见的沉淀环。
平板法
将抗体或抗血清混入1.5％琼脂内（约 50℃），未凝固前倾注成平板，凝固后在 琼脂板上打孔（一般直径约3～5mm），孔 中加入抗原溶液，放室温或37℃让其向四 周扩散，24～48h后可见周围出现沉淀环。 最后，测量沉淀环的直径。
要掌握哦！
各种蛋白质只要符合以下3条，几乎皆可用 SRID定量测定：①备有仅对某待测抗原的单 价特异抗血清；②备有已知含量的标准品； ③待测品含量在1.25μg/ml以上（单向扩散技 术的敏感度）。现在最常用于临床检测的项 目有IgG、IgA、IgM、C3、C4、转铁蛋白、 抗胰蛋白酶、糖蛋白和前白蛋白等多种血浆 蛋白
图Mancini曲线 T1为16-24h；T2为24～48h；T3为48h以上； 可见T3为直线，T1为反抛物线
单向免疫扩散
上排为5个不同的参考 中、下排为患者血清 下排右2为一异常病理血清
实验：单向琼脂扩散试验
实验原理： 将一定量抗体混匀于琼脂凝胶内，凝胶孔中 加入抗原，抗原向四周扩散的过程中与凝胶 中的抗体发生反应，在抗原与抗体比例合适 处出现白色沉淀环。沉淀环直径的大小与孔 中的抗原浓度相关，可从已知的标准曲线上 查出待测标本中抗原的含量。
沉淀环直径与抗原量相关，不是直线相关，而是对数关系。
图Fahey曲线 t1为16-24h；t2为24-48h；t3为48h以上 可见t1为直线，t3为抛物线

2．Mancini曲线适用于大分子抗原和长 时间扩散（＞48h）的结果处理。使用方格计 算纸划线，扩散环直径的平方与抗原浓度呈 线性关系（图12-3）。 利用公式表示：C/d2＝K