实验四 肝组织中核酸的提取和鉴定

实验四 肝组织中核酸的提取与鉴定

【目的】

验证核酸的三大组成成分。熟悉组织中核酸的提取与鉴定的基本操作方法。 【原理】

动物组织细胞中的核糖核酸(RNA)与脱氧核糖核酸(DNA)大部分与蛋白质结合而形成核蛋白。被三氯醋酸沉淀的核蛋白,先用95%的乙醇加热去除附着在沉淀上的脂类杂质,再用1、7mol/L NaCl 溶液提取出核酸的钠盐,然后加入乙醇即可使核酸钠盐沉淀析出。

RNA 与DNA 均可被硫酸水解产生磷酸、含氮碱基(嘌呤与嘧啶)及戊糖(RNA 为核糖,DNA 为脱氧核糖)。此三类物质分别可按照下述原理鉴定。

1、磷酸 磷酸与钼酸铵试剂作用生成黄色磷钼酸,磷钼酸中的钼在有还原剂(硫酸亚铁)存在时可被还原成蓝色的钼蓝。根据此呈色反应即可鉴定磷酸的存在。

2、嘌呤碱 根据嘌呤碱能与硝酸银产生灰褐色的絮状嘌呤银化合物而鉴定。

3、戊糖 根据核糖经浓盐酸或浓硫酸作用则生成糠醛,后者能与3,5二羟甲苯缩合而形成绿色化合物而鉴定。

CHO C H C H C H 2OH

OH OH OH O

CHO

O

H CH 3

C

O

CH 3

O

C

H 3OH

-H 2O

核糖

3，5-二羟甲苯

糠醛

绿色化合物

脱氧核糖在浓酸中生成ω-羟基-γ-酮基戊醛,它与二苯胺作用生成蓝色化合物。

CHO C H C H C 2OH

H H O -H 2O

脱氧核糖

蓝色化合物

CHO C H C H C H CH 2OH

H OH OH ω-羟基-γ-酮基戊醛

【器材】

剪刀、镊子、玻棒、滤纸、试管、试管架、蒸发皿、匀浆器、离心机、沸水浴箱。 【试剂 1、生理盐水。

2、 0、12 mol/L三氯醋酸溶液。

3、 95% 乙醇。

4、 10% NaCl溶液

NaCl 10g溶于蒸馏水中,加至100ml。

5、 0、92 mol/L H2SO4

取浓H2SO4(比重1、84,含量98%)5ml加入蒸馏水中,加水至100ml 。

6、钼酸铵试剂

钼酸铵3g,溶于70ml蒸馏水中,逐渐加入浓 H2SO4 14ml ,冷却后再加至100ml,混匀备用。

7、硫酸亚铁试剂

硫酸亚铁10、6g,硫脲5g,加蒸馏水溶解并加水至500ml,冰箱内保存备用。

8、浓氨水。

9、 0、29mol/L AgNO3

取AgNO3 5g加蒸馏水溶解并稀释至100ml,于棕色瓶避光保存。

10、 3,5二羟甲苯试剂

取浓盐酸100ml,加入FeCl3·6H2O 100mg 及二羟甲苯100mg混匀溶解后,置于棕色瓶中。临用前配制,冰箱保存。(市售3,5二羟甲苯不能直接使用,必须用苯重结晶1～2次,并用活性碳脱色后方可使用)。

11、二苯胺试剂

取1g纯的二苯胺溶于100ml冰乙酸中,加入2、75ml浓硫酸,盛于棕色瓶中,临用前配制。

【操作】

1、核酸的提取与分离:

(1)将新鲜猪肝剪碎置于匀浆器中,加入等量的生理盐水,制成匀浆。

(2)将5ml肝匀浆置于离心管内,立即加入0、12mol/L三氯醋酸5ml,用玻棒搅匀,静置8分钟后离心。

(3)倾去上清液,加95% 乙醇5ml,用玻棒搅匀,再用带有长玻管的木塞塞紧离心管口,在水浴中煮沸2分钟,冷却后离心。

(4)将离心管倒置于滤纸上,使滤纸吸干乙醇。沉淀中再加入10% NaCl溶液4ml,置于沸水浴中加热8分钟,并用玻棒不断搅拌,取出冷却后再离心。

(5)将上清液倾入另一离心管内,再离心一次,去除可能存在的微量残渣。将上清液倒

入烧杯内。

(6)取等量的在水浴中冷却过的95% 乙醇逐滴加入小烧杯内,即可见白色沉淀逐渐析出。静置10分钟后,将小烧杯中沉淀物移入离心管内离心,弃去上清液即得到核酸钠的白色沉淀。

2、核酸的水解

在含有核酸钠的离心管内加入0、92mol/L的H2SO4 4ml,用玻棒搅匀,再用带有长玻管的软木塞塞紧管口,在沸水浴中加热15分钟。

3、核酸组成成分的鉴定

(1)磷酸的鉴定:按下表操作。

表3-3 核酸中磷的鉴定

加入物(滴) 测定管对照管

核酸水解液5滴－

0、92mol/L H2SO4溶液－5滴

钼酸铵试剂3滴3滴

硫酸亚铁试剂10滴10滴

(2)嘌呤碱的鉴定:按下表操作。

表3-4 嘌呤碱的鉴定

加入物(滴) 测定管对照管

核酸水解液10滴－

0、92mol/L H2SO4溶液－10滴

浓氨水数滴(使呈碱性) 数滴(使呈碱性)

0、29mol/L AgNO35滴5滴

观察加入AgNO3后有何变化。静置15分钟后,再比较两管的沉淀、

(3)核糖的鉴定:按下表操作。

表3-5 核糖的鉴定

加入物(滴) 测定管对照管

核酸水解液4滴－

0、92mol/L H2SO4溶液－4滴

3,5-二羟甲基试剂6滴6滴

混匀,放沸水浴中加热10分钟,观察两管颜色有何不同。

(4)脱氧核糖的鉴定:按下表操作。

表3-6 脱氧核糖的鉴定

加入物(滴) 测定管对照管

核酸水解液10滴－

0、92mol/L H2SO4溶液－10滴

二苯胺试剂15滴15滴

混匀,放沸水浴中加热10分钟,观察两管有何不同。

【结果及分析】

观察各测定管颜色及沉淀的生成情况,并与对照管相比有何不同,并解释其原理。【思考题】

1.RNA与DNA的组成成分有何异同？

2.DNA二级结构有何特点？