病原学检查技术

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2.羊膜腔接种
羊膜腔接种主要用于从临床或现场材料（如患者 咽漱液等）中分离病毒。接种到羊膜腔中的接种物 能够被胚胎吞咽和进入呼吸管，可遍及各种组织和 细胞，使具有特定细胞亲嗜性的病毒被充分利用， 从而提高病毒繁殖的可能性。由于可收获的羊膜组 织或羊水较少，为了使病毒适应在尿囊内胚层生长， 从而获得大量的病毒，可将经羊膜腔接种分离到的 病毒再经尿囊腔传代。
卵窗
定位：
将胎盘部分及自然气室部分用
铅笔画出，在胎盘与蛋白交界
处（无血管区）画一直径约 1cm的等边三角形。
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绒毛尿囊膜
卵膜
气 室
羊膜腔
鸡 胚
卵黄囊
尿囊腔
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卵 白
3.绒毛尿囊膜接种
取卵壳：
消毒后取下所画三角形区域的卵壳，注意卵膜不要碰破， 于卵膜中央刺一小口（不要伤及绒毛尿囊膜），
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1.尿囊腔接种
尿囊腔接种常用于流感病毒、新城疫病毒和 腮腺炎病毒的适应和传代。进入尿囊腔的这些病 毒，能够在尿囊的内胚层细胞中大量繁殖，随后 释放到尿囊液中。由于这一接种途径可获得大量 的病毒，也常被用于大量制备抗原、疫苗等。
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1.尿囊腔接种
接种方法：
选 9 － 11 日龄鸡胚照检，标出气室边界和胚胎位置
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酒精，镊子，无菌生理盐水，毛细吸管，橡胶吸 头，液体石蜡，蜡和胶布等。
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（二）接种途径


1.尿囊腔接种：该途径一般用于流感、新城鸡瘟 病毒和腮腺炎的适应和传代。 2.羊膜腔接种：这途径主要用于临床材料（如患 者的鼻洗液及咽漱液）分离病毒。 3.卵黄囊接种：该接种途径主要用于抗流感病毒 药物实验。 4.绒毛尿囊膜—壳块培养法：该法可用于流感病 毒滴定、中和试验和药物实验。
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鸡胚接种技术

鸡胚的结构
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绒毛尿囊膜
气 室 卵膜
羊膜腔
鸡 胚
卵黄囊
尿囊腔
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卵 白
鸡胚接种技术
鸡胚的管理 （一）鸡胚的选择
首选健康受精卵，其壳洁白易于观察胚胎，其他受精 卵也可使用。接种病毒的受精鸡卵应未感染已知病毒 或其它微生物（如新城疫病毒或支原体等），最好来 自无特定病原体（ specified-pathogens free，SPF） 鸡群，接种立克次体的受精鸡卵应来自未食用高浓度 抗生素的鸡群。
病原学检查技术
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一、细菌性传染病病原检查

1、显微镜检查法 2、培养检查法 3、生化试验 4、动物试验 皮下接种、腹腔接种、肌肉接种、静脉注射
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二、病毒性传染病病原检查


1、病毒分离培养 （1）样品处理 将检疫材料制成混悬液，加入抗生素，离心 取上清液 （2）鸡胚接种 （3）动物组织培养
在胚胎面气室上方靠近边界2-3mm处，避开血管作一 标记，用碘酒消毒标记处卵壳，在标记处钻一孔
再次用碘酒消毒钻孔区，将注射器针头经孔刺入尿 囊腔，注入0.1－0.2ml接种物
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将蜡熔化封孔，33℃－35℃孵育48－72小时。每日 照检，24小时内死亡的应弃去。
1.尿囊腔接种
收获：
收获前先将鸡卵置4℃冷冻6－ 18 小时，如急于收获 也可将鸡胚置-20℃、1小时左右。冷冻后的鸡卵钝端 向上置于卵杯上，将气室上方卵壳用碘酒或70%的酒 精消毒后去除，暴露壳膜，用无菌镊子小心地将壳膜 从绒毛尿囊膜上撕下，不要损伤绒毛尿囊膜。用注射 器或吸管经绒毛尿囊膜刺入尿囊腔，吸出尿囊液，置 低温保存。同时做无菌培养。
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2.羊膜腔接种
接种方法：
选10－12日龄鸡胚检卵后，标出气室边界和胚胎位置。 用碘酒消毒鸡卵钝端（气室上方）的蛋壳，在气室上方靠近 胚胎侧的卵壳上钻一孔，钻孔区再次用碘酒消毒。用无菌眼 科小剪子沿钻孔周围剪去少许，开一小窗，勿损伤内层壳膜， 经小窗向气室内滴入一滴无菌液体石蜡。将卵置照卵灯上， 可清楚地看到胚胎的位置。将注射器瞄准胚胎的腭下胸前， 刺入后注入0.1－0.2ml接种物。用沾有碘酒通过火焰的小块 胶布将窗口封上。接种后的受精卵根据接种的病毒在 33 ℃、 35℃或37℃的条件下孵育48－72小时。
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鸡胚接种技术
接种前后都要检卵。接种前检卵是要了解 鸡胚的存活情况，标记气室边界和胚胎位置；接 种后检卵是为了观察接种后胚胎的状况。
9源自文库
鸡胚接种技术
（一）材料准备
1、受精鸡卵 2、孵卵箱或恒温箱 3、捡卵灯，照卵灯 4、砂轮、三棱针 5、卵盘、卵杯 6、其它：1ml注射器，针头，2.5%碘酒，75%
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鸡胚接种技术
检卵
在发育的早期，鸡胚不易辨认，要到4－5天后 才容易看见。因此，检卵要在孵育4－5天后进行。 活的鸡胚绒毛尿囊膜界线较明显，上面的血管清晰 可见、成网状，可看到明显的胚胎自主运动。如果 胚胎活动呆滞或不能自主运动，血管模糊、变细、 折断脱落，绒毛尿囊膜界线模糊，说明鸡胚已濒临 死亡或已经死亡。
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鸡胚接种技术 鸡胚的孵育
受精鸡卵孵育时不要擦洗，以免受细菌污染。最好用能自 动调节温度、湿度、气流及翻卵的孵卵箱孵育。如没有， 也可用普通恒温箱，但要在温箱中放一盛满水的方盘，以 保持适当的湿度。孵育应在37℃－39℃、40%―70%的相 对湿度下进行。湿度太高会使气室发育过度，而湿度过低 又会导致气室发育不良，甚至造成鸡胚死亡。通气也很重 要，如果空气不流通，也可造成鸡胚死亡。为了避免胚胎 膜粘连和胚胎发育不均匀，应每隔一段时间转动一次受精 鸡卵。
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3.绒毛尿囊膜接种
绒毛尿囊膜接种常常用于分离和繁殖在绒毛尿囊膜上产生斑 和痘的病毒，如牛痘、天花、单纯疱疹和鸟痘病毒。可在绒 毛尿囊膜上滴定这些病毒，因为感染性病毒颗粒的量可以通 过产生的斑和痘的数目来计算。还可用于抗体滴定试验，因 为斑和痘的个数减少的程度与抗体浓度有关。
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3.绒毛尿囊膜接种
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2.羊膜腔接种
收获：
收获前先将鸡卵置4℃冷冻6－18小时，时间不能过长， 过长会引起散黄。冷冻后的鸡卵钝端向上置于卵杯上，将 气室上方卵壳用碘酒或 75%的酒精消毒后去除，暴露壳膜， 用无菌镊子小心地去除壳膜，使其与绒毛尿囊膜分开，不 要损伤绒毛尿囊膜。用注射器或吸管经绒毛尿囊膜刺入尿 囊腔，吸出尿囊液。然后，一只手持镊子将羊膜轻轻提起， 另一只手持注射器或吸管刺入羊膜腔吸取羊水，置低温保 存。同时做无菌培养。