紫外分光光度法的应用

5.信号处理显示器：放大较弱的电信号，并在检流计上显示出来。
比色皿：玻璃VS石英杯
• 适用的波长范围不一样 • 石英的范围更广,波长最小可以到达210nm,可以用在紫外光程, 一般测核酸和蛋白都用石英比色皿,基本上测什么试剂都可以, 但价格高,一般一个都要在几百块人民币 • 玻璃的局限性大一些,主要用于可见光程,相对便宜 现在市场上 塑料比色皿也在流行起来,但主要还是欧美地区使用的最多,特 点是价格便宜,不怕摔,可以一次性试用,省时省力,也更安全,也分 不同材质,但波长范围仍然还是比石英比色皿小一些 • 光学玻璃适用透过率：320nm-2500nm • 紫外石英适用透过率：190nm-2500nm
紫外-可见百度文库光光度法的基本原理
一、透光率（透光度）和吸收度 ①透光率T
Ir
Ia t 透过光 吸收光 反射光
I0 = It + Ia + Ir
T 取值为0.0 % ~ 100.0 % T = 0.0 % ： 光全吸收 T = 100.0 % ：光全透过
定义：
It T= I ×100% 0
显然，T↑，溶液吸收度↓；T ↓，溶液吸收度↑。 即透光率T反映溶液对光吸收程度，通常用1/T反映吸光度。 ②吸光度（吸收度）A
四、吸收光谱（吸收曲线） 1．定义：以A为纵坐标， λ为横坐标，绘制的λ~A曲线。
2．吸收光谱术语： ①吸收峰→λmax ,②吸收谷→λmin ③肩峰→λsh , ④末端吸收 ⑤强带： max>104，弱带： max<103
特征值
定性、定量分析： 在吸收曲线λmax 处测吸光度A。 ●同一物质的吸收光谱特征值相同, (每一波长处吸光系数相同)。
紫外分光光度法的应用
一、物质对光的选择性吸收
●物质的颜色由物质与光的相互作用方式决定。 ●人眼能感觉到的光称可见光，波长范围是：400~760nm。 ●让白光通过棱镜，能色散出红、橙、黄、绿、蓝、紫等各色光。 ●单色光：单一波长的光 ●复合光：由不同波长的光组合而成的光，如白光。 ●光的互补：若两种不同颜色的单色光按一定比例混合得到白光，
分光光度计外观 分光光度原理图:
0.575
光源
单色器
吸收池
检测器
信号处理及显示
一、主要部件
1.光源： —紫外光源 200~360nm 2.单色器：包括狭缝、准直镜、色散元件 狭缝：进出光狭缝。 最佳宽度:减小狭缝宽度而溶液吸光度不变。 准直镜：复合光→平行光→色散后→聚集狭缝 棱镜 色散元件 对不同波长的 光折射率不同
称这两种单色光为互补色光，这种现象称为光的互补。
物质的颜色：是由于物质对不同波长的光具有选择性吸收而产生。
即物质的颜色是它所吸收光的互补色。
物质的本色
无色溶液：透过所有颜色的光 有色溶液：透过光的颜色 黑色： 吸收所有颜色的光 白色： 反射所有颜色的光
物质的颜色与光的关系
光谱示意
完全吸收
复合光
表观现象示意
例1：阿司匹林在空气中容易吸收水分产生水杨酸，阿司匹林在 280nm处有强吸收峰，而水杨酸的吸收峰迁移到312nm，只要检测在 312nm处是否有吸收峰，即可判断有无水杨酸。
例2：无水乙醇精制过程中要用苯，测定无水乙醇中是否残留苯，测 定其吸收光谱，乙醇在210 ~600nm之间无吸收峰，而苯在250、254 nm有吸收峰，以纯无水乙醇为参比，对样品进行光谱分析，如果在 250、254nm处出现吸收峰，则说明有苯残留。
I0 1 定义：A = lg T = -lgT = lg I t
A=-lgT , T=10-A
③T与A关系： A∝1/T，T=0，A=∞ ，T=100%，A=0
二、光的吸收定律 朗伯(Lambert)和比尔(Beer)分别于1760年和1852年研究吸光度 Ａ与溶液厚度Ｌ和其浓度Ｃ的定量关系：
朗伯定律： 比尔定律：
黑色
完全透过
无色
吸收黄光
蓝光
二、紫外-可见分光光度法
基于物质吸收紫外或可见光引起分子中价电子跃迁、产 生分子吸收光谱与物质组分之间的关系建立起来的分析方 法，称为紫外可见分光光度法（UV-vis）。
（1）灵敏度高，可测到10-7g/ml。 （2）准确度好，相对误差为1%-5%，满足微量组分测定要求。 （3）选择性好，多种组分共存，无需分离直接测定某物质。 （4）操作简便、快速、选择性好、仪器设备简单、便宜。 （5）应用广泛，无机、有机物均可测定。
咖啡因样品用紫外光谱定性和定量，上：标准 品；下：样品
1、对比吸收光谱特征数据：λmax、 λmin、 λsh ①不同基团化合物可能有相同的λmax值，但εmax有明显差别； ②有相同吸光基团同系物，其λmax、 εmax值接近 ，但分子量不同 1% ，E 1cm差别大。
2、对比吸光度（或吸光系数） A1/A2=E1/E2
溶剂对紫外光谱的影响
在测定有机物的紫外可见吸收光谱时，在溶解度容许范围内，应 尽量选择非极性溶剂或极性较小的溶剂（烷、烯烃，如正己烷、正 庚烷），以获得吸收光谱的精细结构。 与标准样品或标准图谱进行对比时，必须用相同的溶剂。所选择 的溶剂在所研究的光谱区域内应该没有明显的吸收；并且不含有其 它干扰物质；与溶质没有相互作用。否则会使光谱线产生移动，低 于此波长时，溶剂的吸收不可忽略。
M 十 R ＝ MR （被测物）（显色剂）（有色配合物）
(1) 定量反应、选择性要好； 干扰少。 (2) 灵敏度要高，摩尔吸光系数ε大。 (3) 有色化合物的组成要恒定，化学性质要稳定。 (4) 有色化合物与显色剂的最大吸收波长之差≥60nm。 (5) 显色反应的条件要易于控制。
三、参比溶液（空白溶液）的选择 用于调节100%T，若选择不适当，对测量读数的影响较大。 主要是消除溶液中其他组分对光的吸收等带来的影响。 1. 溶剂参比液 当试液、试剂、显色剂均无色时，用溶剂(通常
A=k1 ×L A=k1 ×C
朗伯-比尔定律:
A=k C L
吸光 一束平行单色光通过一均匀、非散射的吸光物质溶液时，在入 浓度 系数 射光的波长、强度以及溶液温度等保持不变时，该溶液的吸光度 A L→2L时，A、T →？ A=-lgT , T=10-A=10-kcL 与其浓度C及液层厚度L的乘积成正比。 2A T2
同一物质相同浓度的吸收曲线重合。
●同一物质不同浓度，其吸收曲线形状相似,λmax相同。（定量） ●不同物质相同浓度，其吸收曲线形状,λmax不同。（定性）
吸收光谱 特征值：
λmax λmin λsh
吸收曲线的讨论：
（1）同一种物质对不同波长光的吸光度不同。吸光度最大处对应 的波长称为最大吸收波长λmax （2）不同浓度的同一种物质，其吸收曲线形状相似λmax不变。而 对于不同物质，它们的吸收曲线形状和λmax则不同。 （3）③吸收曲线可以提供物质的结构信息，并作为物质定性分析的 依据之一。
依据Beer定律，A与C关系应 为经过原点的直线
偏离Beer定律的主要因素表 现为以下两个方面： （一）化学因素 （二）光学因素
（一）化学因素
朗—比耳定律假定所有的吸光质点之间不发生相互作用；
该定律适用于稀溶液，溶质的离解、缔合、互变异构及化学变化 也会引起偏离。 尤其浓度过高(>0.01mol/L)会使C与A关系偏离定律： ①粒子相互作用加强，吸光能力改变。 ②溶液对光的折射率显著改变。 • 故：朗伯—比耳定律只适用于稀溶液。 溶液中存在着离解、聚合、互变异构、配合物的形成等化学 平衡时。使吸光质点的浓度发生变化，影响吸光度。 • 例： 铬酸盐或重铬酸盐溶液中存在下列平衡： CrO42- ＋2H＋ = Cr2O72- ＋H2O 溶液中CrO42-、 Cr2O72-的颜色不同，吸光性质也不相同。 故此时溶液pH 对测定有重要影响。
玻璃棱镜:适用于可见区 石英棱镜:适用于紫外区
钨灯或卤钨灯 氢灯或氘灯
—可见光源 350~1000nm
光栅 衍射和干涉,不同波 长的投射方向不同
高度抛光的玻璃上刻有 等宽、等距平行条痕
3.吸收池：比色皿、比色杯，装样品溶液。有玻璃、石英杯两种 4.检测器：光→电，光电池(硒,硅)，光电管(红,紫)，光电倍增管。
例3：如药典规定VB12的E1%max，361nm，1cm =207，上述VB12注射液原 标示浓度为0.05%，求实际浓度，方法：药液用重蒸水精确稀释 20倍， 水做参比，用361nm测定的吸光度为0.512，其含量为： 1%∶207=x%∶0.512 ，x%=0.00247%，浓度 =0.00247%×20=0.049%
（4）不同浓度的同一种物质，在某一定波长下吸光度 A 有差异，在
λmax处吸光度A 的差异最大。此特性可作为物质定量分析的依据。 （5）在λmax处吸光度随浓度变化的幅度最大，所以测定最灵敏。吸收 曲线是定量分析中选择入射光波长的重要依据。
2014-1-13
五、偏离光的吸收定律原因
朗伯-比尔定律：A=k C L
• （二）光学因素 1．非单色光的影响：入射光为单色光是应用该定律的重要前提： 2．杂散光的影响：仪器本身缺陷；光学元件污染造成。
3．反射和散色光的影响：散射和反射使T↓，A↑，吸收光谱变形。 通常可用空白对比校正消除。 4．非平行光的影响：使光程↑，A↑，吸收光谱变形。
紫外-可见分光光度计
依据朗伯-比尔定律，测定待测液吸光度A的仪器。（选择不同波 长单色光λ、浓度）
二、分光光度计类型
单波长 分光光度计 单光束 分光光度计 可见光区: 721型
仪器简单，单 色光误差大
可紫外-见光区: 751，754型
双光束 分光光度计
760型 普遍采用的 光路
双波长 wfz800-S,日本 分光光度计 岛津UV-300型
特定情况（背景、共 存组分干扰）下使用
仪器简单，要求 光强度稳定高
1% 2、百分吸光系数 / 比吸光系数 E1 ： cm 一定λ下,c=1%(W/V)，L=1cm时的吸光度。单位：100ml/g.cm
3、两者关系:
1g/100ml
4、吸光系数的意义:
M 1% E1 cm 10
（1）一定条件下是一个特征常数。 （2）在温度和波长等条件一定时，ε仅与物质本身的性质有关，与 待测物浓度c和液层厚度L无关； （3）定性和定量分析依据：同一物质在不同波长时ε值不同。 不同物质在同一波长时ε值不同。 εmax表明了该物质在最大吸收波长λmax处的最大吸光能力。
定性与定量分析
紫外-可见分光光度法主要用于有机物分析。 定性分析：比较吸收光谱特征可以对纯物质进行鉴定及杂质检查； 定量分析：利用光吸收定律进行分析
一、 定性分析 （一）定性鉴别：
对比法：比较样品化合物的吸收光谱特征与标准化合物的吸收 光谱特征；或与文献所载的化合物的标准谱图进行核对。
同一物质有相同吸收光谱图，反之不一定是同一物质。
相同条件下，同一物质吸光度比值是吸光系数的比值。 3、对比吸收光谱的一致性 将试样与已知标准样品用同一溶剂配制成相同浓度的溶液，在同 一条件下分别扫描吸收光谱，核对其一致性。
（二）纯度检查 1、杂质检查：有杂质时，吸收光谱变形。 2、杂质限量检查：①以某一波长吸光度值表示； ②以峰谷吸光度比值表示。
是蒸馏水)作参比液；
2. 试样参比液 如果试样中的其他组分也有吸收， 但不与显色剂 反应，则当显色剂无吸收时，可用试样溶液作参比溶液。
3. 试剂参比液
如果显色剂或其他试剂略有吸收，可用不含待测 组分的试剂溶液作参比溶液。
4. 平等操作参比液 用不含待测组分的溶液，在相同条件下与待 测试样同时进行处理，此为平行操作参比溶液。
各种分光光度计使 用《化学教学网》 视频操作
第四节 分析条件的选择
一、 测量条件的选择 1.吸光度的范围： T ∈ 20%~65%，A∈0.2～0.7之间 2.测定波长的选择： 吸收最大的波长为入射光，干扰最小 二、显色反应条件的选择 显色反应：将试样组分转变成有较强吸收的有色化合物的反应。 显色剂：与被测组分化合生成有色物质的试剂。 1. 显色反应的条件：
液层 厚度
注意! 适用范围
①入射光为单色光，适用于可见、红外、紫外光。 ②均匀、无散射溶液、固体、气体。 ③吸光度A具有加和性。Aa+b+c= Aa + Ab + Ac
三、吸光系数
A=k c L
k = A /c L
1、摩尔吸光系数或Em： 在一定λ下，c=1mol/L，L=1cm时的吸光度。单位：L/(mol.cm)