病原真菌的分离与培养

（3）消毒分离用具 凡是和分离材料接触的器皿和材料都要保持无菌。将分离用具
浸于70%乙醇中，使用时在灯焰上烧去乙醇灭菌，如此3次（刀、 剪、镊等不宜烧时过长，以防退火），再次使用时必须重复灭菌。 2、选择分离材料
分离材料应尽量新鲜，减少腐生菌混入的机会。从受病组织 边缘靠近健全组织的部分分离，可减少污染，同时这部分病原生 物处于较为活跃的状态，生长快，易分离成功。
高压灭菌锅操作过程
加水 装锅 盖盖 加热 当压力升为0.5kg/cm2时排 放冷空气 正式升压 保压（1.1kg/cm2，121℃，保持 20-30min） 停止加热 自然降压至零 排放余汽 开 盖 取出灭菌物品 趁热摆斜面 检验灭菌效果。
约50℃
倒平板
灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基
防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染
3.切取病组织小块（叶斑病类）：取真菌叶斑病的新鲜病叶(或其他分离 材料)，选择典型的单个病斑，用解剖刀从病斑边缘(病健交界处)切取 小块(边长3--4mm)病组织数块。 提示：选择新患病的组织作为分离的材料，可以减少腐生菌混入 的机会。腐生菌一般在发病很久而已经枯死或腐败的部分滋生，因此， 一般斑点病害应在临近健全组织的部分分离。
果实、块茎和枝杆等组织内部的病原菌可用脱脂棉蘸70%酒精涂拭病 部表面，通过火焰烧去表面酒精，重复进行2-3次，达到表面消毒。
提示：先用70％的酒精浸2、3s是为了消除寄主表面的气泡，减少表 面张 力，70％的酒精亦用于表面消毒，处理的时间较短(一般数秒lmin)。 升汞溶液消毒的时间因材料而异，可自30s至30min不等，一般情况下， 需时间3，5min。
常压蒸汽
不宜用高压蒸汽灭菌的 培养基
煮沸
玻璃器皿
用30W、253.7nm波长的紫外灯照 无菌室、无菌箱、衣物
射20-30min.
等空气及物体表面
70%乙醇、2%煤酚皂（来苏水）、 无菌室、无菌箱 5%石碳酸液等喷雾
0.25%新洁尔灭、0.5%次氯酸钙 （漂白粉）擦拭
玻璃器皿、金属和木质 器皿等
70%乙醇、0.1%新洁尔灭、0.1%升 手（不可用升汞），分
四、病原真菌的分离方法： （一）组织分离法：
1.培养皿准备：取灭菌培养皿一个，置于湿纱布上，在皿盖上注 明分离日期、材料和分离人姓名。
2.培养皿平板制作：无菌操作法向培养皿中加入25%乳酸1-2滴 （减少细菌污染），然后将熔化而冷至45℃左右的马铃薯琼脂 培养基倒入培养皿中，轻轻摇成平面（分离细菌时则不能加乳 酸）。
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三、内容与方法 分离是将病原物从发病组织上与其他微生物分开；培养是将
分离的病原物移到可以让这种病原物正常生长的营养基质（培养 基）上，从而获得其纯培养。 （一）分离前的准备工作
1.工作环境和分离用具的清洁和消毒 （1）常用的消毒方法：
常用消毒方法及其使用范围
方法 湿热法
辐射法 化学药品法
操作
使用范围
5.接种：用无菌操作法将病组织移至平板培养基上，每皿内放4--6块。 提示：在将病组织小块移放到平板表面之前，应将其在无菌吸水纸上
吸去多余的水，以大大减少病组织附近出现细菌污染。
(6) 培养：将培养皿倒置放人26-28℃左右恒温箱内培养。一般3—4d后 观察待分离菌生长结果。
马铃薯琼脂培养基（PDA培养基）的制作：
配方：土豆200g，葡萄糖20g，琼脂15～20g，水1000mL，pH值自然。 （1）称量和熬煮：药品实际用量计算后，按培养基配方逐一称取去皮土豆。
土豆切成小块放入锅中，加水1000ml，在加热器上加热至沸腾，维持 20－30min，用可用2层纱布趁热在量杯上过滤，滤渣弃取。滤液补充 水分到1000ml。 （2）加热溶解：把滤液放入锅中，加入葡萄糖20g，琼脂15～20g（提前 搞碎），然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒不断搅拌，以防琼脂 糊底或溢出，待琼脂完全溶解后，再补充水分至所需量。 （3）分装：按实验要求，将配制的培养基分装入试管或500ml三角瓶内。 分装时可用三角漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上造成污染。
4.表面消毒：将病组织放人70％酒精中浸3—5s后，按无菌操作法将病组 织移人0．1％升汞液中分别表面消毒0．5、1、2、3、5min(也可使 用其他表面消毒剂,如漂白粉精片1-2片，研磨后加灭菌水20mL，消毒 5-10min。)，如植物组织柔嫩，则表面消毒时间宜短；反之则可长些。 然后放入灭菌水中连续漂洗三次，除去残留的消毒剂。
园艺作物病虫害防治
学习情境1 蔬菜病虫害防治
子学习情境2:侵染性病害防治
病原真菌的分离与培养
一、目的要求 掌握病原真菌分离培养的基本原理、学会消毒、灭菌、倒平板、病原
真菌的组织分离和稀释分离的基本方法。 二、材料、用具和药品
新鲜的真菌病害分离材料、PDA的斜面与平板培养基、无菌室、超净 工作台或无菌操作箱（接种箱）、恒温箱、紫外线灭菌灯、酒精灯、火柴、 吸管、剪刀、镊子、接种环、接种针、福尔马林、70%乙醇、0.1%升汞、 无菌水和记号笔等。
灭菌与消毒：
任何一种培养基一经制成就应及时彻底灭菌，以备纯培养用。一般 培养基的灭菌采用高压蒸汽灭菌。
常用的灭菌的方法有：干热灭菌、高压蒸汽灭菌、常压蒸汽灭菌、 常压间歇式灭菌、超高温灭菌、过滤除菌、辐射灭菌、化学药品灭菌等方 法。
本实验培养基的灭菌常使用的是高压蒸汽灭菌，它是利用高温湿热空气 使菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的。
汞浸泡、擦拭
离材料
（2）清洁和消毒工作环境 为了避免污染，分离工作要求在无菌条件下进行，无菌室、超净工作台或
无菌操作箱（接种箱）是分离工作不可缺少的设施。在分离前，无菌室内用 紫外灯照射20-30min，以杀死室内空气中的大多数细菌。无菌操作箱可在分 离前用化学消毒剂清除箱内微生物。
若分离工作只能在普通房间进行时，必须对房间进行彻底清洁，关闭门 窗，避免空气流动，经过喷雾或在地上多洒些水，以除去空气及地面灰尘后 进行操作，也可获得较好的结果。工作前擦净桌面，最好铺上湿毛巾自认清 洁或纱布上，尽量避免工作过程中临时取物带来污染。工作人员要注意清洁， 工作前用肥皂洗手，分离前还要用70%乙醇擦拭双手。