第三章 动植物细胞培养产酶

• ⑸大多数细胞适宜采用贴壁培养，来自 血液、淋巴组织的细胞、肿瘤细胞和杂 交瘤细胞可以采用悬浮培养。
• ⑹动物细胞培养基成分复杂，一般要添 加血清或其代用品，产物的分离纯化过 程较复杂，成本高
• ⑺原代细胞培养50代后，即会退化死亡， 需要重新分离细胞。
三、wk.baidu.com物细胞培养方式
• 大部分动物细胞具有四大生物学特征： • 锚地依赖性：细胞必须附在固体上或固
• 1、大蒜愈伤组织的诱导
• 选取结实、饱满、无病虫害的大蒜蒜瓣， 在4℃冰箱中放置3周，以打破休眠。去除 外皮，先用70％乙醇消毒20s，再用0.1％ 氯化汞消毒10min，再用无菌水漂洗3次。
• 在无菌条件下，切成0.5cm的小块，植入 含有3mg/L2，4－D（2，4－二氯苯氧乙 酸）和1.2mg/L6-BA(苄基酰嘌呤)的半固 体MS培养基中，25℃，600lux,12h/d光照 的条件下培养18d，诱导得到愈伤组织。
●非贴壁依赖型细胞：无需附着于固相表 面即可生长，包括血液、淋巴组织细胞、 许多肿瘤细胞及某些转化细胞。
1、悬浮培养
• 是指细胞在反应器中自由悬浮生长的过程。 主要用于非贴壁依赖型细胞培养，如杂交 瘤细胞等；是在微生物发酵的基础上发通 起来的。 无血清悬浮培养是用已知人源或动物来源 的蛋白或激素代替动物血清的一种细胞培 养方式，它能减少后期纯化工作，提高产 品质量，正逐渐成为动物细胞大规模培养 的研究新方向。
某些方向能够得到比较多的光通量，以增加这一
方向被照面上的照度。例如摄像、摄影照明灯、 手电筒和汽车前灯等都装有反光镜。
• 以下是各种环境照度值：单位 lux 黑夜 0.001 - 0.02 月夜 0.02 - 0.3 阴天室内 5 - 50 阴天室外 50 - 500 晴天室内 100 - 1000 夏季中午太阳光下的照度 约为109 阅读书刊时所需的照度 50 - 60 电视演播室所需照度 300 – 2000 家用摄像机所需最小照度 0.3 - 1 家用摄像机标准照度 1400
• 动物细胞培养主要用于生产：疫苗、激素、多 肽生长因子、酶、单克隆抗体、非抗体免疫调 节剂。
• 白介素与机体免疫功能有关，白介素-2促进淋 巴细胞分化增殖。乙型肝炎疫苗，预防乙肝。 集落刺激因子，可减轻化疗时副作用，可用于 爱滋病、白血病。肿瘤坏死因子，可损伤癌细 胞。研制更新一代的药物和更新的应用方法， 集落刺激因子和白介素的基因构建到酵母细胞 中，使之产生融合蛋白质，药效增强。生产方 法从利用重组DNA的微生物生产转向利用动 植物来生产蛋白质类药物，构建新型多价活疫 苗。
思考：植物细胞的特性？
• ⑴体积大 • ⑵生长速率和代谢速率比微生物低 • ⑶营养要求简单 • ⑷要求一定的光照时间和光照强度 • ⑸对剪切力敏感，这在生物反应器的研
制和培养过程通风、搅拌方面要严加控 制 • ⑹目的产物不同
二、植物细胞培养的特点
• 1、提高产率 • 实例 日本三井石油化学工业公司于
• 大规模细胞培养生物反应器 市场 前景及经济效益分析 :以年产
能力50公斤紫草宁为例，国际市场价 （精品干粉）每公斤价格为5000-7000 美元，预计每年新增利税25-35万美元。 除此之外，紫草宁因其色泽鲜艳，附
着力强被国际誉为红色素之王，可作
为保健食品、保健饮品、保健化妆品 的添加剂。
• 2、缩短周期 细胞培养倍增时间一般为 12～60h，一般生产周期15～30d，与完整 植株比较，大大缩短了生产周期。
1983年在世界上首次成功采用紫草细胞 培养生产紫草宁，750L反应器，培养 23天，细胞中紫草宁的含量达到细胞干 重的14％，比紫草根中紫草宁的含量高 10倍。
• P70
• 紫草是我国传统中草药，其中的有效成分为一系 列萘醌类化合物，具有凉血、活血、解毒和透疹 的作用。用于子宫颈炎、外阴炎、尿布性皮炎、 中耳炎、烫伤、刀伤、湿疹、水疱及其他皮肤病。 紫草辅助米非司酮可提高流产成功率。具有抗垂 体促性腺激素的作用，可以用于经期综合征，可 以预防麻疹，有消肿作用，避孕作用。
• 美国Genentech公司应用SV40为载体，将乙 型肝炎病毒表面抗原基因插入哺乳动物细
胞内进行高效表达，已生产出乙型肝炎疫 苗。英国Wellcome公司采用8000L Namalwa细胞生产α干扰素。英国Celltech 公司用气升式生物反应器生α、β和γ干扰素； 用无血清培养液在10000L气升式生物反应 器中培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体。美 国Endotronic公司用中空纤维生物反应器大 规模培养动物细胞生产出免疫球蛋白G、A、 M和尿激酶、人生长激素等。
• 已实现商业化的产品有：口蹄疫疫苗、狂 犬病疫苗、牛白血病病毒疫苗、脊髓灰质 炎病毒疫苗、乙型肝炎疫苗、疱疮病毒疫 苗、巨细胞病毒疫苗、α及β干扰素、血纤 维蛋白溶酶原激活剂、凝血因子Ⅷ和Ⅸ、 促红细胞素、松弛素、生长激素、蛋白C、 免疫球蛋白、尿激酶、激肽释放酶及200种 单克隆抗体等。其中，口蹄疫疫苗是动物 细胞大规模培养方法生产的主要产品之一。 1983年，英国Wellcome公司就已能够利用 动物细胞进行大规模培养生产口蹄疫疫苗。
• 然后在无菌条件下，经过筛网将小细 胞团或单细胞转入含有3mg/L2，4－D （2，4－二氯苯氧乙酸）和1.2mg/L6BA(苄基酰嘌呤)的液体MS培养基中， 25℃，600lux,12h/d光照的条件下培养 18d。
• 3、酶的分离纯化
• 4、细胞培养完成后，收集细胞，经过 细胞破碎、提取、分离得到超氧化物 岐化酶。
第三节 动物细胞培养产酶
• 所谓动物细胞大规模培养技术（large-scale culture technology）是指在人工条件下（设定ph、温度、溶 氧等），在细胞生物反应器（bioreactor）中高密度 大量培养动物细胞用于生产生物制品的技术。
• 目前可大规模培养的动物细胞有鸡胚、猪肾、猴肾、 地鼠肾等多种原代细胞及人二倍体细胞、cho（中华 仓鼠卵巢）细胞、BHK-21(仓鼠肾细胞)、Vero细胞 (非洲绿猴肾传代细胞，是贴壁依赖的成纤维细胞)等， 并已成功生产了包括狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗、甲 型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、红细胞生成素、单克 隆抗体等产品。
2、贴壁培养
• 贴壁培养（attachment culture）是指细胞 贴附在一定的固相表面进行的培养。 ⑴.生长特性：贴壁依赖型细胞在培养时要 贴附于培养（瓶）器皿壁上，细胞一经贴 壁就迅速铺展，然后开始有丝分裂，并很 快进入对数生长期。一般数天后就铺满培 养表面，并形成致密的细胞单层。
⑵.贴壁培养的优点：
• （一）、工艺流程 • 外植体------细胞获得（直接分离、
诱导愈伤组织等 ）-------细胞培养 -------- 分离纯化 --------酶
植物细胞的获取
➢直接分离法 ➢诱导愈伤组织诱导法 ➢原生质体再生法
（二）、植物细胞培养的培养基
• 1、植物细胞培养基的特点 • 分析几种常用的植物细胞培养基，说明 • 植物细胞培养基的特点 ？
增强子） • 4.抗原诱导抗体酶的生物合成 • 抗体酶 • 诱导法（半抗原诱导法 酶蛋白诱导法）
第二节 植物细胞培养产酶
• 植物细胞培养主要产物？ • ——色素、药物、香精、酶等。
酶
糖苷酶 过氧化物酶 糖化酶 木瓜蛋白酶 超氧化物岐化酶 菠萝蛋白酶
产酶植物细胞（年份）
胡萝卜细胞（1981） 甜菜细胞1983，大豆 细胞1989 甜菜细胞1988 番木瓜细胞1990 大蒜细胞1993 菠萝细胞1995
• ●容易更换培养液；细胞紧密黏附于固相表 面，可直接倾去旧培养液，清洗后直接加入 新培养液。
●容易采用灌注培养，从而达到提高细胞密 度的目的；因细胞固定表面，不需过滤系统。
●当细胞贴壁于生长基质时，很多细胞将更 有效的表达一种产品。 ●同一设备可采用不同的培养液/细胞的比例。 ●适用于所有类型细胞。
一、植物细胞的特性
细胞种类 植物细胞 微生物细胞
细胞大小 20～300 1～10 /µm
倍增时间 >12 /h
0.3~0.6
动物细胞 10～100
>15
营养要求 简单
简单
光照要求 大多要求 不要求
对剪切力 敏感 的敏感性
大多数不敏感
复杂 不要求 敏感
主要产物 色素、药 醇、氨基酸、抗生素、 疫苗、激素、单 物、香精 核苷酸、有机酸、酶等 克隆抗体、酶等
定的表面，才能生长分裂。 • 血清依赖性：细胞必须具有生长因子，
才能生长。 • 接触抑制性：细胞与细胞接触后，生长
便受到抑制。 • 形态依赖性：细胞称扁平状，并有长纤
维网状结构。
• 依据在体外培养时对生长基质依赖性差异， 动物细胞可分为两类： ●贴壁依赖型细胞：需要附着于带适量电 荷的固体或半固体表面才能生长，大多数 动物细胞，包括非淋巴组织细胞和许多异 倍体细胞均属于这一类。
第三章 动植物细胞培养产酶
➢ 第一节 动植物细胞中酶生物合 成 的调节
➢ 第二节 植物细胞培养产酶 ➢ 第三节 动物细胞培养产酶
第一节 动植物细胞中酶生物合成的调节
• 1.细胞分化改变酶的生物合成（端粒酶） • 2.基因扩增加速酶的生物合成（中国田鼠P66） • 3.增强子促进酶的生物合成（胰岛素基因的
• 3、易于管理，减轻劳动强度
• 4、提高产品质量 产物浓度较高，杂质少； 污染少，易于分离纯化。
• 5、缺点 与微生物相比，植物细胞对剪切力 敏感，生产周期长，需光照。这些会在植 物细胞生物反应器的设计和工艺条件控制 等方面引起一系列的问题，必须考虑和解 决。
三、植物细胞培养产酶的工艺条件及其控制
二、动物细胞培养的特点
• ⑴动物细胞培养主要用于各种功能蛋白质 的生产
• ⑵生长较慢，细胞倍增时间15－100h
• ⑶为防止微生物污染，在培养过程中，需 要添加抗生素。
• ⑷动物细胞体积大，无细胞壁保护，对剪 切力敏感，所有在培养过程中，必须严格 控制温度、PH、渗透压、通风搅拌等条件， 以免破坏细胞
• 2、大蒜细胞悬浮培养
• 将上述在半固体MS培养基上培养18d的 愈伤组织在无菌条件下转入含有 3mg/L2，4－D（2，4－二氯苯氧乙酸） 和1.2mg/L6-BA(苄基酰嘌呤)的液体培 养基中，加入灭菌的玻璃珠，25℃， 600lux,12h/d光照的条件下震荡培养培 养18d，使愈伤组织分散成小细胞团或 单细胞。
• 光照度与勒克斯： 光照度是表明物体被照明程度的物理量。光照度
与照明光源、被照表面及光源在空间的位置有关，
大小与光源的光强和光线的入射角的余玄成正比，
而与光源至被照物体表面的距离的平方成反比。 光照度可用照度计直接测量。 光照度的单位是
勒克斯，英文lux的音译，也可写为lx 。被光均 匀照射的物体，在1平方米面积上所得的光通量 是1流明时，它的照度是1勒克斯。有时为了充分 利用光源，常在光源上附加一个反射装置，使得
• 其中紫草宁具有抗肿瘤及活性，对Ｈｅｌａ细胞 增殖有一定的抑制作用。减少自发性乳癌的发病 率，对肝癌和Ｌｅｗｉｓ肺癌有一定的放射增敏 作用。紫草宁可以提取红色素，紫草油以及紫草 可生产紫草ＳＯＤ等紫草系列保健品。可以作为 如化妆品口红、胭脂、粉饼、食品饮料、熏肉、 医药胶囊、防晒制品及印染等着色剂和添加剂。
一、动物细胞的特性
• ⑴没有细胞壁，适应环境的能力差，脆弱
• ⑵体积比微生物大几千倍，但是稍小于植物 细胞的体积。
• ⑶在机体内相互粘连以集群形式形式存在， 在细胞培养中大部分细胞具有群体效应、锚 地依赖型、接触抑制性以及功能全能性。
• ⑷动物细胞的营养要求较复杂，必须供给各 种氨基酸、维生素、激素和生长因子等。动 物细胞培养基中一般需要加进5％－10％的 血清。
植物细胞培养产酶实例
• 据报道，已经研究过200多种植物细胞培 养，其产物超过400中。其中通过植物细 胞培养产生的酶有10多种。
• 阅读大蒜细胞培养生产SOD实例，说明 植物细胞培养产酶工艺过程及条件控制。
• SOD是催化超氧负离子进行氧 化还原反应的氧化还原酶，具 有抗辐射、抗氧化、抗衰老的 功效。SOD可以从动物、植物 和微生物细胞中提取分离得到。 郭勇教授从1992年开始进行大 蒜细胞培养生产超氧化物岐化 酶的研究取得可喜成果。工艺 过程简介如下。