噬菌体的快速检测与防治

噬菌体快速检测方法
一、目的要求
1.定期检测生产车间空气中和二级种子罐培养液中的噬菌体污染度，观察噬菌斑的形态和大小。

2.学会快速检查发酵液中是否被噬菌体污染的方法。

二、基本原理
噬菌体是一类专性寄生于细菌和放线菌等微生物细胞的病毒，某种噬菌体往往只能感染一种或与它相近的某种细菌。

按其感染细菌的过程分两类：大多数烈性噬菌体侵染细菌后迅速引起敏感细菌裂解，释放出大量子代噬菌体，因而可在含有敏感细菌的平板上出现肉眼可见的噬菌斑如图1。

温和噬菌体侵染细菌后呈原噬菌体（或称前噬菌体）状态，一般不引起细菌裂解，使宿主成为溶源性细菌。

在肉膏蛋白胨双层琼脂平板上产生透明噬菌斑中心的菌落，即为溶源性细菌。

了解噬菌体的特性，快速检查噬菌体，在生产和科研工作中防止噬菌体污染具有重要作用。

图1 敏感细菌的平板上出现肉眼可见的噬菌斑
空气中和二级种子罐培养液中的噬菌体污染度是预防噬菌体的一个措施。

在连续使用特定菌株进行赖氨酸发酵时，首先是空气中的噬菌体浓度增加，数月后
种子罐的噬菌体浓度也急剧增加，随之主发酵罐发酵液中的噬菌体检出浓度也就增加；当空气中的噬菌体浓度上升到每个平板达10～20PFU/ml（噬菌斑生成单位）时，二级种子罐的噬菌体浓度为40～50 PFU/ml；之后迅速增加，达到102 PFU/ml的程度，终于在主发酵罐发生溶菌。

经常检测赖氨酸分厂环境中，特别是空气中与种子罐二级种子液中的噬菌体数，就能知道环境的噬菌体污染程度，也就能预知主发酵罐中会不会发生噬菌体的污染。

噬菌体是病毒的一种，是一种极其微小的生物，体积是细菌的1/1000左右，它可以通过细菌过滤器，只有在电子显微镜下才能看到。

噬菌体具有非常专一的寄生性，只能在特异性寄主细胞中增殖。

由于噬菌体缺乏独立代谢的酶体系，不能脱离寄生而自行生长繁殖，因而噬菌体的繁殖必须依存于寄生菌的繁殖，只能在活的正在繁殖阶段的细胞中进行增殖。

在死的、衰老的、处于休眠状态的细胞中以及在代谢产物或培养基上都无法繁殖。

噬菌体的繁殖过程可分为：吸附→侵入（注入DNA）→复制→成熟→裂解五步，寄生细胞裂解后释放出来的成熟子代噬菌体随时又侵染其他细菌，开始新的生活循环。

赖氨酸发酵中污染噬菌体，由于侵染时间和感染量的不同，以及噬菌体“毒力”和菌株敏感性的差异，表现症状是不一样的，一般泡沫多、pH偏高、OD基本不长甚至下降，轻度感染或后期感染常看不出异常变化，可用快速检测法。

三、实验材料
（一）菌种
赖氨酸生产菌。

（二）噬菌体来源
赖氨酸发酵异常发酵液。

（三）培养基
平板培养基、种子罐培养基。

（四）仪器
台式离心机、721型分光光度计、显微镜、恒温水浴、培养箱、冷藏箱等。

（五）其他物品
培养皿、试管、吸管、玻璃涂棒、离心管、方瓶等。

四、实验内容
（一）噬菌体污染快速检查方法
生产或科研中使用的菌株，若被噬菌体污染，常有异常表现：接种的斜面或克氏瓶生长的菌苔上出现不长菌的透明区；液体发酵过程镜检菌体染色不均匀，细胞形态不整齐或膨大呈将破裂状，活细菌数目减少；发酵过程糖消耗减慢，氨基氮和pH变化异常；发酵液稀薄，发酵终产物产率降低等异常状况，以上多为被噬菌体侵染的现象。

目前采用生物测定法进行噬菌体检查，约需12h左右，这样不能及时判断是否有噬菌体污染，无法针对情况迅速采取必要的措施。

快速检查大致确定是否被噬菌体污染可采用以下方法：
1．显微镜直接检查：
定时取发酵液进行涂片染色，在显微镜下检查有无异常菌体。

取赖氨酸发酵正常发酵液和异常发酵液，涂片染色，显微镜观察菌体形态及生长情况。

2．离心分离加热法：
根据微生物细胞被噬菌体裂解后，其高分子内容物从细胞逸出的特点，采用发酵液离心分离后的上清液加热来快速检测噬菌体。

原理是基于正常发酵液离心后菌体沉淀，离心后的上清液若蛋白含量不多，加热后仍清亮；侵染噬菌体的异常发酵液离心后的上清液因含高分子内含物，加热后自裂解菌中逸出有活性蛋白沉淀，在光线照射下出现丁达尔效应而不清亮。

此法简单、快速，对发酵液污染噬菌体的判断亦较准确。

但不适于溶源性细菌及温和噬菌体的诊断，对侵染噬菌体较少的一级种子培养液，也往往不适用。

离心分离加热法快速、便捷、准确，半小时就能确定料液是否污染噬菌体。

具体操作步骤：
取赖氨酸发酵正常发酵液和异常发酵液，4000r／min离心20min，分别取两组发酵液离心后的上清液（A1），在721型分光光度计上测定OD650光密度值OD1650；再分别将两组发酵液离心后的上清液（A1）5ml于试管中，置沸水浴中煮沸2min （A2），检测A2溶液OD650光密度值OD2650。

判断：（1）OD1650 ≈OD2650 ，正常；OD1650 «OD2650说明污染噬菌体。

（2）目视比浊：A1清亮；A2若有浑浊或明显浑浊或明显大块悬浮物则说明污染噬菌体。

但当出现明显浑浊后，悬浮物下沉料液清亮，这时若检测OD值可能会比A1的还低，出现误判断。

这就要求料液煮沸冷却后必须目视比浊，若有轻微浑浊无法判断，过1h取样检测比较混浊度再做判断。

3. 平板交叉划线法：
取平皿按常规倒入培养基，制成平板，然后取指示菌液划线，再取与其交叉划线。

37.5℃恒温培养10～12h左右。

这种交叉划线检查法，当噬菌体较少时能发现噬菌斑，如果噬菌体较多，则发现交叉处透明，同时可见到由含噬菌体胶液
线向敏感菌线析展的一条亮线（噬菌带）。

此法既可检查噬菌体，又可检查杂菌污染。

4．单层平板法：
单层平板法是液体和空气检测的常规方法。

具体操作步骤：
无菌操作下吸取待测样品1ml，指示菌液0.5ml，加入平皿内，将冷却至45℃的培养基倒入8ml，摇匀后，于37.5℃恒温箱中培养18～24h，细心观察有无噬菌空斑。

实验一：
（1）方法：取指示菌划线平板0h（1#）和培养24h以后（2#）平皿各一块，在划线处分开各滴3d噬菌体污染液，于37.5℃恒温箱中培养18～24h，细心观察有无噬菌空斑。

（2）结果：1#无变化，2#有三个明显噬菌空斑。

实验二：
（1）方法：1＃平皿：车间活化后培养96h平皿
2＃平皿：车间活化后培养24h又冷藏24h平皿
3＃平皿：刚活化0h平皿
往三个平皿中各滴入3d噬菌体污染液于37.5℃恒温箱中培养18～24h，细心观察有无噬菌空斑。

（2）结果：1#、2#无变化，3#有三个明显噬菌空斑。

实验三：
（1）方法：1＃平皿：分别沾取指示菌液与污染噬菌体液交叉划线，
2＃平皿：指示菌划线培养48h后沾取污染噬菌体液与之交叉划线。

于37.5℃恒温箱中培养18～24h，细心观察有无噬菌空斑。

（2）结果：1#有亮斑或亮线（见图2）
2#无变化。

图2 敏感细菌的平板上出现亮斑或亮线
由上述可以证实：噬菌体只侵染正在繁殖的敏感细菌，在死的、衰老的、处于休眠状态的细胞中以及在代谢产物或培养基上都无法繁殖。

这就可以解释分厂发酵罐污染噬菌体，而平皿却检查不出环境污染噬菌体的现象。

（三）噬菌体污染快速检查注意事项：
1.检验噬菌体的细菌，必须是敏感细菌纯种；加入培养皿中的对数中期菌悬液，应在皿中均匀形成菌层（每皿细菌密度约109个）。

2.钙、镁等离子帮助噬菌体尾丝吸附于细菌表面，用自来水配制的肉膏蛋白胨培养基和蛋白胨水即可满足噬菌体增殖和检测需要，不必另外添加无机离子。

培养基中的琼脂浓度对噬菌斑大小有显著影响，底层琼脂浓度以1.5％～2.0％，上层琼脂浓度以0.8％～1.0％为宜。

3.噬菌体对温度极其敏感，一般噬菌体60℃ 5min绝大部分失活。

对氧化物敏感，可被酸碱致死。

此外，凡能引起蛋白质变性的化学药品（如0.5%的甲醛、1%的新洁尔灭、0.5%的苯酚或漂白粉等）都可使噬菌体失活，但是值得注意的是，噬菌体在干燥状态比湿润状态稳定，能长时间以活性状态浮游于空气中，这是生产车间受噬菌体污染的一个重要原因。

4.为保证获得单个、彼此分离的噬菌斑，培养皿盖上和培养基表面不得有凝结水滴，平置培养，不能倒放，每皿中噬菌体数量不能太多，维持100～300个为宜，否则噬菌斑不能分开而连成一片。

（四）污染噬菌体的处理
抗生素等产品发酵过程中有时出现噬菌体污染,轻者造成生产能力大幅度下降,重者造成停产。

一般噬菌体污染后往往出现发酵液突然转稀,泡沫增多,早期镜检发现菌体染色不均匀，在较短时间内菌体大量自溶,最后仅残留菌丝断片,平皿培养出现典型的噬菌斑,溶氧浓度回升提前,营养成分很少消耗,产物合成停止等现象。

发酵过程中污染噬菌体后，一般做如下处理：1.发酵液用高压蒸汽灭菌后放掉,严防发酵液任意流失；2.全部停产,对环境进行全面的清洗和消毒,断绝噬菌体的寄生基础；3.更换生产菌种,不断筛选抗噬菌体菌种,防止噬菌体的重复污染。

污染烈性噬菌体时出现上述现象。

如果污染温和噬菌体时,其反应温和,平皿培养不出现明显的噬菌斑,只出现部分菌体自溶,生化指标变化不显著,生产能力降低,对生产的危害亦是严重的,但不易被发现。

防止温和噬菌体污染的方法同上所述。