目的基因(COR)转入细菌细胞的方法及其检测

目的基因（COR）转入细菌细胞的方法及其检测

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（XXX农业与生物技术学院，XXX XXX，XXX）

摘要：以PGEM-T-easy质粒为载体，将氨苄青霉素抗性基因导入大肠杆菌，通过含有氨苄青霉素的培养基筛选出具有氨苄青霉素抗性基因的大肠杆菌，对筛选出的大肠杆菌进行质粒DNA提取,并对质粒进行PCR扩增和酶切，将产物进行琼脂糖凝胶电泳图谱分析。结果表明：氨苄青霉素抗性基因被导入大肠杆菌中并在大肠杆菌中得到表达。

关键字：PCR扩增氨苄青霉素抗性基因大肠杆菌

引言：随着生物科技的飞速发展，越来越多的生物技术被广泛的应用于各类应用领域。如PCR技术、基因重组、DNA连接等等已被人们广泛的应用于生物体内基因的扩增及新的生物性状的研究。然而，对于氨苄青霉素抗性基因在大肠杆菌染色体上整合及表达尚未见研究。本研究借助于PCR、DNA连接转化、琼脂糖凝胶电泳对氨苄青霉素抗性基因在大肠杆菌染色体上整合及表达进行了研究。旨在为氨苄青霉素抗性基因在大肠杆菌染色体上整合及表达提供一定的理论依据。

1 材料和方法

1.1 试剂与器材

1.1.1 材料试剂：大肠杆菌；PGEM-T-easy质粒；Taq酶；引物(正向、反向；10umol/ml)；模板DNA；10×RCRbuffer；ddH2O；dNTP（

2.5mol/L）；T4DNAligase；Cacl2（0.1mol/L）；LB培养基；氨苄青霉素（50mg/ml）；溶液Ⅰ（葡萄糖，50mmol/L；Tris-HCl，25mmol/L；EDTA，10 mmol/L）；溶液Ⅱ（0.4mol/LNaOH和2%SDS用前等体积混合）；溶液Ⅲ（5mol/L乙酸钾，60ml；冰醋酸，11.5ml；水，28.5ml）；TE缓冲液（pH8.0）；0.5mol/LEDTA；70%乙醇；氯仿：异戊醇（V:V，24：1）；Tris饱和酚：氯仿：异戊醇（V:V：

V，24：24：1）；琼脂糖。

1.1.2 器材：PCR扩增仪；移液枪；电泳仪；紫外检测仪；恒温摇床；恒温水浴器；恒温培养箱；低温离心机；超净工作台；冰箱；离心管；小指管；酒精灯；牙签；培养皿、试管若干。

1.2 方法

1.2.1 PCR基因扩增

1.2.1.1 加样：

在PCR管中加入ddH2O(35μl)；DNA 样品（1μl）；10×PCR 缓冲液（5μl）；2.1mmol/L dNTP （4μl）；正向引物（2μl）；反向引物（2μl），振荡混匀。

1.2.1.2 PCR反应

(1) 94℃预变性5min

(2) 94℃变性1min

(3) 55℃退火1min

(4) 72 ℃延伸2min。

(5) 重复(2)-(4) 30次

（6）72 ℃延伸10min。

（7）4℃保存

1.2.1.3 琼脂糖凝胶电泳检测PCR的结果：取10μl PCR扩增产物，琼脂糖凝胶电泳检测。电泳结束后，用EB染色15min，紫外灯下观察。

1.2.2 DNA重组

1.2.2.1 配制连接体系：

T4 DNA ligase（1.0ul）；buffer（1.0ul）；PGEM-T-easy（0.5ul）；DNA （7.5ul）

1.2.2.2 将配制的连接体系保温过夜。

1.2.3大肠杆菌感受态细胞的制备及转化

1.2.3.1从大肠杆菌平板上用镊子夹取牙签挑取一个单菌落接于3mlLB液体培养基试管中，37℃振荡过夜。

1.2.3.2将培养液1ml分装入1.5ml离心管中，在冰上冷却10--30min于4℃离心，4000r/min×10min，弃去上清。

1.2.3.3用冰浴的0.1mol/LCaCl220µl悬浮细胞，立即放入冰上冰浴30min，0-4℃，4000r/min离心10min。

1.2.3.4弃去上清，加入冰浴的0.1mol/LCaCl2溶液200μl悬浮细胞，立即放入冰上冰浴30min。4℃，4000r/min离心10min，弃去上清。

1.2.3.5 弃去上清，加入冰浴的0.1mol/LCaCl2溶液100μl悬浮细胞，即制成了感受态细胞。加入10l连接体系，轻轻混匀，冰上放置30分钟。

1.2.3.6于42℃水浴保温90s，迅速转移至冰浴中，冷却2min

1.2.3.7立即向上述管中加0.8ml LB培养液，37℃振荡培养50min，使受体菌恢复生长状态，并使转化体表达抗生素基因产物。

1.2.3.8取转化细胞200ul涂于含氨苄青霉素5mg/L的LB固体培养基平板上，37℃恒温培养8-12h。

1.2.4质粒DNA的提取及酶切

1.2.4.1 提取质粒

1.2.4.1.1 根据LB固体培养基上生长的菌落，挑取单一菌种接种于2.0mlLB

含抗生素的液体培养基，37℃震荡培养过夜。

1.2.4.1.2 取1.5ml培养物倒入微量离心管中，室温4000r/min离心2min。

1.2.4.1.3吸去上清液，将细胞悬浮于100μl（5 mg/ml 溶菌酶）预冷的溶液Ⅰ，剧烈震荡使菌体悬浮，混合，室温放置10min。

1.2.4.1.4加入200μl新鲜配置的溶液Ⅱ，轻轻混匀，冰浴5 min。

1.2.4.1.5 加入150μl的溶液Ⅲ，混匀，见絮状沉淀，冰浴 5 分钟，12000r/min，离心15min，取上清。

1.2.4.1.6 向上清液中加入450ul苯酚/氯仿/异戊醇混合物混匀，12000r/min离心10min。

1.2.4.1.7 吸取上清液，加2倍体积预冷的无水乙醇，充分混匀，室温放置5——10min。4℃120000 r/min离心5 min。

1.2.4.1.8 用400ul70℅乙醇洗涤质粒DNA沉淀2次，4℃8000 r/min离心7 min，弃上清，将沉淀室温下晾干。

1.2.4.1.9 加20ul TE 37℃水浴30min，使DNA完全溶解。

1.2.4.1.10对质粒进行琼脂糖凝胶电泳。

1.2.4.2 酶切

取5ul DNA 溶液，EcoRα（0.5ul），H×buffer（1.0ul），ddH2O(3ul),加入微量管中酶切1h，用移液枪加样进行凝胶电泳，分析质粒DNA的限制性酶切图谱。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增目的基因的电泳图结果