一种酵母原生质体的制备方法

南阳酵母原生质体制备与再生条件研究

摘要：究南阳酵母原生质体形成与再生的最佳条件。获取原生质体采用酶法，生采用双层高渗平板法，素重要性分析采用正交研再因试验。结果表明：龄ｌｈ以２％蜗牛酶加０％纤维素酶的混合酶液进行酶解破壁，解温度３￣酶解时间２ｈ以０６ｌＬ菌Ｏ，．０．５酶０Ｃ，．，．５ｍｏ・－蔗糖做再生培养基的渗透压稳定剂，生质体形成率９．％，原１０再生率１．％。进行预处理，试验条件下，南阳酵母原生质体形成４０５６不在对
Байду номын сангаас
ＰｒｐｒｔｏｎｇｎｒｔｎｏｏｏｌｓｓｏａｃａｏｃｓｅｅＢｉｅｅａａｉｎａｄＲｅｅｅａｉｆＰｒｔｐａｔｆＳｃｈｒｍｙｅＣｒｒａｏ
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耐高糖酿酒酵母原生质体制备与再生过程研究

耐高糖酿酒酵母原生质体制备与再生过程研究俞志敏;栾静;徐鹏;王继花;赵长新【期刊名称】《酿酒科技》【年(卷),期】2008(000)004【摘要】对1株耐高糖酿酒酵母的原生质体制备和再生条件进行了研究.结果表明,发酵7h后为对数生长中期,适宜原生质体化;L16(5)确定制备原生质体的最佳条件为蜗牛酶浓度(1.0%)、KCI高渗缓冲液(O.7mol/L)、酶解时间(1.5h)、预处理剂(0.1%B-巯基乙醇)和酶解温度(26℃),在此条件下原生质体形成率和再生率分别为80.84%和36.03%;原生质体形成后在7%蔗糖高渗培养基上夹层培养再生率较高(39.78%).【总页数】4页(P45-48)【作者】俞志敏;栾静;徐鹏;王继花;赵长新【作者单位】大连工业大学辽宁省发酵丁程重点实验室,辽宁,大连,116034;大连工业大学辽宁省发酵丁程重点实验室,辽宁,大连,116034;大连工业大学辽宁省发酵丁程重点实验室,辽宁,大连,116034;大连工业大学辽宁省发酵丁程重点实验室,辽宁,大连,116034;大连工业大学辽宁省发酵丁程重点实验室,辽宁,大连,116034【正文语种】中文【中图分类】TS261.1;T0925;TS262.2【相关文献】1.酿酒酵母和马克斯克鲁维酵母原生质体制备与再生研究 [J], 包伟霞;王静洁;王晓斐;陈由强;许旭萍2.酿酒酵母和酒类酒球菌原生质体制备与再生的条件优化 [J], 高年发;张颖3.安琪酿酒酵母与管囊酵母原生质体制备和再生 [J], 郑州;田辉;程金花;赵儒铭;李志军;姚娟;龚大春4.安琪超级酿酒酵母原生质体制备与再生条件研究 [J], 赵悦茗;杜跃超;罗晨5.酿酒酵母W5原生质体制备及再生条件的初步研究 [J], 孙红兵;宋刚;平文祥;葛菁萍因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

酵母原生质体的制备方法

酵母原生质体制备试剂盒货号：BB-3630 V2.16试剂盒储存条件：2-8℃保存。

开盖后组份按要求条件保存。

试剂盒组成：产品组成 BB-3631-1 BB-3631-2 组份编号规格 50T 100T试剂A：酵母原生质体制备液A 20ml 40ml 36300A试剂B：酵母原生质体制备液B 25ml 50ml 36300B试剂C：原生质体保存液C 20ml 40ml 36300C 使用说明书 1 1有效期：一年。

※ ※ ※ 使用前请仔细阅读产品说明书 ※ ※ ※使用限制：本试剂盒仅供科学研究使用，不可用于诊断或治疗。

产品更新：贝博会更新或升级产品，以优化和增强其使用性能，产品说明书会进行相应的版本更新。

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质量控制：贝博对每批产品进行严格测试以确保产品质量一致。

知识产权：贝博TM BBproExtra TM系列试剂盒及其使用方法包含专有技术。

注意事项：1.螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖和管内壁上的液体离心至管底，避免开盖时试剂损失。

2.禁止与其他品牌的试剂混用，否则会影响使用效果。

3.样品或试剂被细菌或真菌污染或试剂交叉污染可能会导致错误的结果。

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产品简介：贝博BBproExtra TM酵母原生质体制备试剂盒提供全套试剂，适用于从各种酵母样本制备原生质体。

微生物学教程(第三版)周德庆课后答案

微生物学复习资料绪论1、名词解释：微生物，微生物学，种，菌株、品系、克隆，菌落，菌苔。

微生物: 微生物是形体微小、单细胞或个体结构简单的多细胞、甚或无细胞结构，用肉眼看不见或看不清的低等生物的总称。

微生物学: 微生物学是一门在细胞、分子或群体水平上研究微生物的形态构造、生理代谢、遗传变异、生态分布和分类进化等生命活动基本规律，并将其应用于工业发酵、医药卫生、生物工程和环境保护等实践领域的科学，其根本任务是发掘、利用、改善和保护有益微生物，控制、消灭或改造有害微生物，为人类社会的进步服务。

种：种是最基本的分类单位,它是一大群表型特征高度相似，亲缘关系极其相近，与同属内其它种有着明显差异的菌株的总称。

菌株（品系）：表示任何由一个独立分离的单细胞繁殖而成的纯种群体极其一切后代；实际上是一个微生物达到遗传性纯的标志。

克隆：若菌落是由一个单细胞发展而来的，则它就是一个纯种细胞群或克隆。

菌落：在适宜的培养条件下，微生物在固体培养基表面（有时为内部）生长繁殖，形成以母细胞为中心的一堆肉眼可见的、有一定形态构造的子细胞集团，这就是菌落。

菌苔：如果将某一纯种的大量细胞密集地接种到固体培养基表面，结果长成的各“菌落”互相连成一片，这就是菌苔。

2、简述微生物学发展史上5个时期的特点和代表人物。

①史前期——朦胧阶段（约8000年前-1676）特点：人们虽然没有看到微生物，但已经不自觉的利用有益微生物、防止有害微生物。

中国古代：②初创期--形态学时期（1676-1861）特点：这一时期微生物学的研究工作主要是对一些微生物进行形态描述。

代表人物——列文虎克：微生物学的先驱者③奠基期--生理学时期（1861-1897）特点：这一时期的主要工作是查找各种病原微生物，把微生物学的研究从形态描述推进到生理学研究的新水平，建立了系列微生物学的分支学科。

代表人物：巴斯德和科赫。

④发展期——生化水平研究阶段特点：微生物学的研究进入分子水平，微生物学家的研究工作从上一时期的查找病原微生物转移到寻找各种有益微生物的代谢产物。

微生物解答

第一章1.试述革兰氏染色机制：结晶紫液初染和碘液媒染：在细菌的细胞膜内可形成不溶于水的结晶紫与碘的复合物。

乙醇脱色：G＋细胞壁较厚、肽聚糖网层次多和交联致密且不含类脂，把结晶紫与碘的复合物牢牢留在壁内，使其保持紫色；G-细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄和文联度差，结晶紫与碘复合物的溶出，细胞退成无色。

复染: G-细菌呈现红色，而G+细菌则仍保留最初的紫色。

2.渗透调节皮层膨胀学说是如何解释芽孢的耐热机制的？芽孢的耐热在于芽孢衣对多价阳离子和水分的渗透很差以及皮层的离子强度很高，这就使皮层产生了极高的渗透压去夺取芽孢核欣中的水分，其结果造成皮层的充分膨胀和核心的高度失水，正是这种失水的核心才赋予了芽孢极强的耐热性。

3.何为“栓菌”试验？即设法把单毛菌鞭毛的游离端用相应抗体牢固地“栓”在载玻片上，然后在光镜下观察该菌细胞的行为，结果发现，该菌只能在载玻片上不断打转而未作伸缩“挥动”，因而肯定了“旋转论”的正确性4.对细菌细胞一般构造和特殊构造设计表解。

一般构造：包括细胞壁、细胞质膜、拟核、细胞质。

特殊构造:糖被、鞭毛芽孢第二章2.试对酵母菌的方式作一表解酵母菌的繁殖方式：（一）无性：①芽殖②裂殖③产无性孢子（节孢子、掷孢子、后垣孢子）（二）有性（产子囊孢子）3.试图示酿酒酵母的生活史，并对其中各主要过程作一简述1．子囊孢子在合适的条件下发芽产生的单倍体营养细胞2．单倍体营养细胞，不断地进行出芽繁殖3．两个性别不同的营养细胞彼此接合，在质配后即发生核配，形成二倍体营养细胞4．二倍体营养细胞不进行核分裂，而是不断进行出芽繁殖5在以醋酸盐为唯一或主要碳源，同时又缺乏氮源等特定条件下6子囊经自然或人为破壁后，可释放出其中的子囊孢子4.试以表解法介绍霉菌的营养菌丝和气生菌丝各可分化成哪些特化构造，并简要说明它们的功能吸取养料假根吸器附着：附着胞、附着枝菌核特化的营养菌丝休眠（或休眠及蔓延）菌索延伸：匍匐枝菌环捕食线虫菌网菌丝体无性分生孢子头孢子囊简单有性：担子特化的气生菌丝（子实体）无性：分生孢子器、分生孢子座复杂有性（子囊果）：闭囊壳、子囊壳、子囊盘简述功能：假根：具有固着和吸取养料等功能吸器：吸取宿主细胞内的养料附着胞：用以牢固的黏附在宿主表面附着枝：将菌丝附着于宿主体上菌核：休眠菌丝组织菌索：促进菌体蔓延和抵御不良环境菌环或菌网：捕捉线虫或其他微小动物5.试列表比较细菌、放线菌、酵母菌和霉菌细胞壁成分的异同，并提出制备相应原生质体的酶或试剂细胞壁成分的异同：细菌分为G+和G-，G+肽聚糖含量高，G-含量低；G+磷壁酸含量较高，而G-不含磷壁酸；G+类脂质一般无，而G-含量较高；G+不含蛋白质，G-含量较高。

原生质体制备和再生的影响因素

原生质体制备和再生的影响因素【摘要】以酿酒酵母YS5为出发菌株，经蜗牛酶酶解获得原生质体后，用紫外线进行诱变处理，通过一级筛选得到了61株诱变菌株，将这些诱变株直接进行发酵，利用气相色谱对发酵液酒精产量进行分析。

结果表明，经过紫外线照射30s后，通过筛选获得了一株酒精发酵较高产菌株，酒精产率达到了10.36%（v/v），比出发菌株提高了3.6%。

【关键词】酿酒酵母；原生质体；紫外诱变；甘蔗汁发酵酵母细胞的融合及酵母原生质体的诱变的一个重要前提就是如何制备大量的原生质体，原生质体制备率受到各种条件的影响，如菌龄、酶浓度、温度、预处理等的影响，因此确定不同因素对酵母原生质体的影响及优化不同因素，可以大大提高产率。

1.菌体菌龄对原生质体制备的影响微生物的生理状态是决定原生质体产量的主要因素之一，特别是菌龄，明显影响原生质体释放的频率。

不同时期的菌体，对各种溶壁酶的敏感性不同，原生质体的形成率与再生率也有很大差异。

较年轻的菌体细胞制备原生质体较为容易，而且此阶段的原生质体再生率也较高。

处于对数生长期的菌体代谢活性高而稳定、细胞壁对酶的作用较为敏感，且大小比较一致，生长适应能力强，故通常取处于对数生长期的菌体制备原生质体。

有研究表明对数生长早期形成率最高，对数生长中期时再生率最高，对数生长晚期的再生率也比对数生长中期的低。

这是由于细胞壁越稚嫩，越易被酶破坏，对数生长早期菌体幼小，代谢活性高而稳定、细胞壁对酶的作用较为敏感，且大小比较一致，故生活适应能力强；对数生长中期幼小菌体对不利因素抵抗能力差，一旦失去细胞壁，较难恢复；对数生长晚期的原生质体存在着很大比例的非活性个体。

菌体如果进入稳定期，细胞壁结构趋于稳定和老化，不易去壁形成原生质体，原生质体形成率显著降低，而且再生率也有所下降。

微生物的菌龄是随着菌种和培养条件而异，酵母菌菌液中加入β-巯基乙醇可以破坏细胞壁组分中的二巯基，处于对数生长期的酵母菌菌体代谢极为旺盛，细胞壁易被瓦解，其细胞壁对蜗牛酶较为敏感，易于酶解脱壁，且酵母菌制备原生质体时，要使菌体同步化才能大幅度的提高制备率。

一株内生真菌的原生质体制备及再生过程研究

第34卷　第2期河南师范大学学报(自然科学版)V ol.34　N o.2　2006年5月J ournal of Henan N ormal Universit y(N atural S cience)M ay.2006 文章编号:1000-2367(2006)02-0106-04一株内生真菌的原生质体制备及再生过程研究郭丹钊,李　兰(河南科技学院生命科技学院,河南新乡453003)摘　要:通过对酶系组成和酶解条件的研究,得出了制备禾本科植物内生真菌N eot y phodi um sp.原生质体的最佳条件:鲜菌丝由10.3%蔗糖溶液预处理,酶系组成为1.5%崩溃酶、1.0%蜗牛酶、1.0%纤维素酶和2.0%溶菌酶,酶解温度32℃,p H6.8,酶解5h,原生质体得率达7.3×103个/mg鲜菌丝.另外,液体再生涂布平板法结合钙离子作用可使原生质体再生率达4.72%,为不含钙离子处理组的2.5倍.关键词:原生质体;内生真菌;N eot y p hodi um s p.;制备;再生中图分类号:Q813.2 文献标识码:A内生菌以禾本科植物内生真菌最为常见[1],这类内生真菌与其宿主植物有着密切的互利共生关系[2],但同时它会提高植物体内麦角碱类生物碱的含量,给畜牧业带来重大的损失[3].将内生真菌制备成原生质体[4],从而更便捷地进行遗传物质的改造,实现共生体品系的改良,是内生菌资源利用的一个重要方向.本文对一株禾本科植物内生真菌原生质体的制备与再生过程进行了研究,为进一步研究禾本科牧草2内生菌共生体系提供了理论和技术依据.1　材料与方法1.1　材　料内生真菌RB-1菌株(N eot y p hodi um s p.)由本实验室分离并初步鉴定.崩溃酶(SIGMA),其余试剂购自上海化学试剂公司.最小成分培养基(MM)(g/L):(N H4)2SO41;MgSO4・7H2O0.1;KH2PO43;K2H PO47;葡萄糖5;液体再生培养基:渗透压稳定剂(ST或STC)中加入0.5%酵母膏和0.7%葡萄糖.固体再生培养基: PDA培养基加10.3%蔗糖.双层固体再生培养基:下层为含2%琼脂的固体再生培养基,上层为含1%琼脂的固体再生培养基.渗透压稳定剂(p H7.5).ST等渗液:1mol/L山梨醇、20mmol/L Tris-HCl(p H7.5);STC等渗液: 1.2mol/L山梨醇、10mmol/L Tris-HCl(p H7.5)、50mmol/L CaCl2.1.2　方　法1.2.1　菌丝培养:将菌株接种于PDA培养基,8d后转接于30ml MM液体培养基中,于28℃静置培养.1.2.2　酶液的配制:用无菌的0.7mol/L NaCl溶液配置,经0.22μm微孔滤膜过滤除菌.1.2.3　原生质体的制备:取培养40d的菌丝经无菌水荡洗后用无菌滤纸吸去多余水分.称取0.1g鲜菌丝于2ml离心管中,加入酶液酶解0～8h,其间每隔5～10min颠倒离心管数次.随后加入1ml ST缓冲液750g离心5min.吸取酶解菌丝团上方约0.5ml的液相,适当稀释,通过血球计数板计算原生质体浓度和得收稿日期:2005-07-07基金项目:河南科技学院2004年度高层次人才科研项目(040125)作者简介:郭丹钊(1978-),女,江苏丹阳人,河南科技学院讲师,硕士,主要从事微生物资源开发利用的研究.率,并观察原生质体的释放方式[5].酶系组成、酶解反应温度、酶解时间、酶解液p H 值等设置见结果部分.1.2.4　原生质体的再生及再生形态的观察:分别吸取19.8ml 含ST 和STC (含Ca 2+)等渗液的液体再生培养基于50ml 离心管中,加入一定浓度的原生质体悬液0.2ml.混匀后,吸取0.1ml 的混合液加入到p H 6.8的液体再生培养基中或涂布于再生平板上,于28℃暗培养9～10h 后,取样于显微镜下观察其再生状态.继续培养7d 后统计再生菌落数,它与涂布原生质体数目的比值即为原生质体再生率.观测再生菌株的菌落形态、孢子大小和孢子梗长短,初步判断原生质体制备和再生过程对实验菌株的影响.2　结果与分析2.1　原生质体的制备2.1.1　原生质体的释放方式及酶系组成对原生质体制备的影响制备得到的原生质体直径主要集中于4～6μm (图1).经观察发现菌株RB -1有两种基本的原生质体释放方式:顶端释放:酶解初期,菌丝顶端出现孔洞,从中释放出一个至多个原生质体.原位释放:随着酶解时间的延长,菌丝的细胞壁被整个酶解,原生质体在原位形成球状体,单个或数个地呈串珠状排列.28℃下设计正交试验L 9(34)(表1),通过极差R 值的比较可以看出,这4种酶在消解细胞壁时所起的作用大小依次为崩溃酶>蜗牛酶>纤维素酶>溶菌酶,其优化配比为崩溃酶(1.5%)、蜗牛酶(1.0%)、纤维素酶(1.0%)和溶菌酶(2.0%).图2比较了优化酶系与等质量体积百分比(5.5%)的不同酶系制备原生质体的效果,可见优化酶系明显较相同用量的单一酶有更好的酶解效果,表明优化酶系中的各酶份能有效互补.表1　酶组合正交实验安排及结果处理崩溃酶/%蜗牛酶/%溶菌酶/%纤维素酶/%原生质体得率/(个・mg -1)10.50.5 2.0 1.0 1.6×1022 1.00.50.50.5 4.0×1023 1.50.5 1.0 2.0 1.4×10340.5 1.0 1.00.5 1.7×1025 1.0 1.0 2.0 2.08.0×1026 1.5 1.00.5 1.0 2.9×10370.5 2.00.5 2.0 2.6×1028 1.0 2.0 1.0 1.09.0×1029 1.5 2.0 2.00.5 2.7×103K 1 5.9×102 1.96×103 3.56×103 3.27×103K 2 2.1×103 3.87×103 2.47×103 3.96×103总和=9.69×103K 37.0×103 3.86×103 3.66×103 2.46×103R6.41×1031.91×1031.19×1031.5×1032.1.2　p H 值对原生质体制备的影响将2.1.1中筛选出的优化酶系p H 值分别设置为5.8、6.2、6.5、6.8、7.1和7.5,结果显示在p H 6.8时701第2期郭丹钊等:一株内生真菌的原生质体制备及再生过程研究综合酶效最高(图3),原生质体得率为6.1×103个/mg鲜菌丝.2.1.3　酶解温度和时间对原生质体制备的影响对优化酶系进行28℃、32℃和35℃3个温度处理,由图4可见,在32℃处理下原生质体得率最高.由图5随酶解时间的延长原生质体产量不断提高,至酶解5h 时达到最大值,随后原生质体数量呈下降趋势,这是由于过量酶解造成原生质体破裂速度大于其形成速度所致.2.1.4　菌丝预处理对原生质体制备的影响用10.3%的蔗糖溶液预处理菌丝0.5h ,后续原生质体制备步骤同上.测得此法原生质体得率为7.3×103个/mg 鲜菌丝,较无菌水处理对照组的原生质体得率(6.1×103个/mg 鲜菌丝)高出近20%.2.2　原生质体的再生2.2.1　再生方法和Ca 2+对再生率的影响再生方法:液体再生涂布平板法和双层固体再生法对3种原生质体再生方法———液体再生法进行了比较.结果表明液体再生法无法获得和筛选再生菌株;双层固体再生法操作繁琐,融化温度不易控制且再生率低(<<1‰);液体再生涂布平板法先把原生质体悬浮液转移到液体再生培养基中使其在液相中再生5h ,再涂布到固体再生培养基上,克服了以上两种方法的不足,原生质体再生率为1.85%.Ca 2+的影响:液体再生培养基中分别添加ST 和STC (含Ca 2+50mmol/L )两种等渗液,原生质体经此处理后,分别涂布至固体再生培养基上,待菌落长出后计算再生率.结果显示液体再生涂布平板法结合钙离子作用可使原生质体再生率达到4.72%(表2),为不含Ca 2+的ST 组的2.5倍.表2　Ca 2+对菌株RB -1原生质体再生率的影响处理ST STC 再生率/% 1.85 4.722.2.2　原生质体的再生过程取再生培养9～10h 时的培养物进行观察,原生质体由于再生的不同步性可使得在同一视野内同时呈现各种再生阶段(图6).结果显示菌株RB -1原生质体的再生方式有两种:一种是原生质体上首先伸出一突起物(或称芽)(图6a ),随后该突起物逐渐增大并延伸成一条菌丝(图6c ),进而发育成正常菌丝(图6d ,e );另一种为原生质体类酵母状分裂(图6b ),而后在酵母状串珠链的一端或两端形成芽管,进而发育为菌丝.经再生培养,菌株RB -1的原生质体再生并在平板上长成菌落(图6f ),再生后的菌株记录为RB -1R.2.2.3　再生菌株部分形态学特征描述根据表3的结果,初步判定再生菌株无显著变异.表3　再生菌株RB -1R 与出发菌株RB -1的形态学特征比较菌株菌落形态特征生长速度/(mm ・d -1)孢子形态孢子大小/μm孢子梗大小/μm隔膜RB -1棉质,致密,白色0.6柠檬型 4.8×3.617.4×2.6无RB -1R棉质,致密,白色0.7柠檬型5.0×2.919.6×2.6无3　结　论本研究成功地实现了禾本科植物内生真菌N eot y p hodi um s p.原生质体的制备和再生.得到了制备原生801河南师范大学学报(自然科学版) 2006年质体的最佳条件(原生质体得率可达7.3×103个/mg 鲜菌丝).液体再生涂布平板法结合钙离子作用可使原生质体再生率达到4.72%,较不含钙离子的处理组高出2.5倍.经此再生法得到的再生菌株初步判断无显著变异.参　考　文　献[1]　邹文欣,谭仁祥.植物内生菌研究新进展[J ].植物学报,2001,43(9):881-892.[2]　Clay K.Fungal endophytes of grasses :a defensive mutualism between plants and f ungi[J ].Ecology ,1988,19:10-16.[3]　Hoveland C S.Importance and economic Significance of the Acremonium endophytes to performance of animals and grassplant [J ].Ecosystems &Environment ,1993,44:1-2.[4]　谭周进,肖启明,肖克宇.原生质体融合技术在微生物菌种选育中的应用[J ].生物技术,2003,13(1):35-36.[5]　Murray F R ,Latch G C M ,Scott D B.Surrogate transformation of perennial ryegrass ,Lolium perenne ,using genetical 2ly modified Acremonium [J ].Mol G en Genet ,1992,233:1-9.Protoplast Preparation and R egeneration from a G ramineous E ndophyteGUO Dan 2Zhao ,L I Lan(College of Life Science and Technology ,Henan Institute of Science and Technology ,Xinxiang 453003,China )Abstract :By studying the enzyme combinations and factors of enzyme 2hydrolysis ,the conditions for protoplast prepara 2tion f rom gramineous endophyte Neotyphodium sp.were optimized.While hyphae were digested by enzyme combination (p H6.8)consisting of 1.5%driselase ,1%snailase ,1%celluase and 2%lysozyme for 5h at 32℃,the protoplasts were obtained at the percentage of 7.3×103/mg.The results showed that the protoplast regeneration rate could amount to 4.27%with liquid 2solid culture method and CaCl 2treatment ,which was 2.5times higher than that in C K.K ey w ords :protoplast ;gramineous endophyte ;N eot y p hodi um s p.;preparation ;regeneration901第2期郭丹钊等:一株内生真菌的原生质体制备及再生过程研究。

一种酵母原生质体的制备方法(一)

一种酵母原生质体的制备方法(一)
一种酵母原生质体的制备方法
引言
酵母原生质体是研究酵母生物学和细胞功能的重要工具。

本文将详细介绍一种酵母原生质体的制备方法，包括材料和步骤。

材料
•酵母菌株
•酵母培养基
•液氮
•酶（如裂解酶）
•加压破碎机
步骤
1.酵母菌株的培养
–选取合适的酵母菌株，并在适宜的酵母培养基中培养。

–确保培养条件适宜，包括温度、pH值和营养物质。

2.收获酵母菌细胞
–将培养好的酵母菌细胞收获到离心管中。

–使用低温和高速离心将酵母菌细胞沉淀到管底。

3.冻存酵母细胞
–将收获到的酵母菌细胞用液氮快速冷冻保存。

–这样可以保持细胞的完整性和活力。

4.酵母细胞的裂解
–从冻存酵母菌中取出适量细胞液。

–加入适量的裂解酶，在恰当的温度下孵育制备酵母细胞裂解液。

5.原生质体的制备
–将酵母细胞裂解液加入加压破碎机。

–根据设备要求进行适当压力和时间的制备。

6.分离原生质体
–经过加压破碎机后，从制备好的原生质体悬浮液中轻轻吸取上清液。

–上清液中富集了酵母原生质体。

7.原生质体的储存
–将得到的酵母原生质体储存于低温条件下，如冰箱等。

–注意保持原生质体的稳定性和活性。

结论
本文介绍了一种酵母原生质体的制备方法，该方法可以有效地从酵母菌株中制备出具有活性和稳定性的原生质体。

通过这种方法，可以为酵母生物学和细胞功能的研究提供有力的工具。

以上是详细的酵母原生质体制备方法，我们希望本文能对该领域的研究者和实验室工作者有所帮助。

原生质体制备和转化

收集原生质体液 4000r/min室温离心10min，收集原生质体沉淀去上清，沉淀用1mol/L 山梨醇溶液洗涤2次，每次4000r/min离心10min 弃上清将原生质体悬浮于5mL 1mol/L 山梨醇溶液中，-70℃冰箱冷冻保存备用
将制备好的原生质体溶液3200r/min，4℃离心10min；
经四层无菌镜头纸过滤，制成孢子浓度约为107个/mL的单孢子悬浮液
将上述制得的孢子悬浮液每1mL接种于一瓶盛有50mL菌丝培养基的三角瓶中，于30℃静止培养23~25h
6000r/min，离心10min收集幼嫩的菌丝体用无菌水洗涤菌丝体，4000r/min，离心5min收集菌丝体
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弃上清，沉淀重悬于预冷的STC溶液中，将原生质体浓度调整为5×106 ~ 5×107个细胞 /mL；
将约2~5µg质粒DNA(体积不超过10µL)与 100µL米曲霉原生质体置冰上轻轻混匀；
加入25µL PTC溶液，冰浴20min；
加入1 mL PTC溶液，室温放置15min；
最后加入2mL STC溶液，混匀。
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培养基成分高渗溶液（有机/无机）
缓冲液的pH（5.8-7.4）酶解条件（时间/各种酶的比例）
酶液用高盐还是高渗缓冲液配擦镜纸收集菌丝体or离心收集菌丝体
双层or单层培养基
高渗缓冲液：
《微生物学实验教程》周德庆（酵母）
1、接种于液体培养基上培养。
高渗缓冲液：
蔗糖0.5mol/L, MgCl2 10mmol/L,Tris-HCl(pH 7.4) 10mmol/L
2、取培养液10ml，4000r/min离心5min, 弃上清液，用TrisHCl(pH 7.4)、0.5mol/LEDTA、高渗缓冲液各洗涤一次。

一种重组酵母菌株及其构建方法和应用与流程

一种重组酵母菌株及其构建方法和应用与流程引言：重组酵母菌株是指通过基因重组技术将外源基因导入酵母菌中的一种菌株。

重组酵母菌株的构建方法可以分为直接转化法、原生质体法和自由质粒法等多种方式。

重组酵母菌株在生物医药、农业生物技术和食品工业等领域具有广泛的应用前景。

一、重组酵母菌株的构建方法1. 直接转化法：将外源基因和酵母菌细胞一起处理，使外源基因转化到酵母菌细胞内。

该方法适用于酵母菌对外源DNA接受性较高的情况，如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

直接转化法的优点是操作简单、效率高，但对于某些酵母菌株效果不佳。

2. 原生质体法：将外源基因和酵母菌细胞分别处理，然后通过融合原生质体的方式将外源基因导入到酵母菌细胞内。

该方法适用于酵母菌对外源DNA接受性较低的情况，如担子酵母(Pichia pastoris)。

原生质体法的优点是适用范围广，可以用于多种酵母菌株的基因转化。

3. 自由质粒法：将外源基因和质粒分别处理，然后通过质粒转化的方式将外源基因导入到酵母菌细胞内。

该方法适用于酵母菌株对外源DNA接受性较低的情况，如甘露酵母(Candida utilis)。

自由质粒法的优点是无需使用化学试剂，操作相对简单。

二、重组酵母菌株的应用与流程1. 生物医药领域：重组酵母菌株被广泛应用于生物医药领域，可用于生产重组蛋白、抗体和疫苗等。

流程包括选择合适的酵母菌株、构建重组酵母菌株、表达目的基因、纯化目的蛋白等步骤。

2. 农业生物技术领域：重组酵母菌株可用于农业生物技术领域的基因转化和基因编辑。

例如，通过导入抗虫基因，可以使酵母菌株具有抗虫性，从而减少农药使用。

流程包括选择适合的酵母菌株、导入目的基因、鉴定转基因酵母菌株的稳定性和表达效果等。

3. 食品工业领域：重组酵母菌株可用于食品工业领域的发酵生产。

例如，通过导入酵母菌株具有产酶能力的基因，可以使酵母菌株在发酵过程中产生特定的酶，如纤维素酶、蛋白酶等，从而提高发酵产品的品质和产量。

真核微生物的形态、构造和功能

真核微生物的形态、构造和功能一、填空：1.酵母菌细胞壁的主要成分为“”，它呈三明治状，外层为_ ，内层为，中间层为。

2.酵母菌无性繁殖方式有、、，其中以为主要方式。

以产方式进行有性繁殖。

3.霉菌的菌丝细胞有两种，一种是无横隔的，如霉和霉，另一种是有横隔的，如霉和霉。

4.霉菌繁殖产生有性孢子和无性孢子，请各举两例，前者有和，后者有和等。

5.制备酵母细胞的原生质体一般使用酶。

6.在粗糙脉孢菌菌丝的成熟区，细胞壁构造由内至外相应地为层、层、层和层。

7.真菌子囊果的种类有、、三种。

8.标出下面的图名和各部分的名称构造图构造图构造图构造图构造图二、选择题1.八孢裂殖酵母菌的生活史属。

A.双倍体型B.单倍体型C.单双倍体型D.双核体型2.路氏类酵母的生活史属。

A.单倍体型B.双倍体型C.单双倍体型D.双核体型3.指出错误的回答:毛霉菌的孢子囊具有。

A.囊轴B.囊托C.囊领D.囊梗4.指出错误的回答,根霉菌的孢子囊具有。

A. 囊轴B. 囊托C. 囊领D. 囊梗5.真菌中发现的惟一的几丁质物质存在于中。

A.细胞质B.孢子C.细胞壁D.线粒体6.下列微生物器官耐温顺序为。

A.营养体＞孢子＞芽孢B.芽孢＞孢子＞营养体C.孢子＞营养体＞芽孢7.指出错误的回答,真菌包括有。

A.酵母菌 .粘菌 C.霉菌 D.蕈菌8.所有下述特征皆适合酵母菌细胞，除了之外。

A.它们不形成菌丝B.它们是典型的卵圆形细胞C.它们只能用显微镜才能看见D.它们是多细胞的真菌三、名词解释真核微生物菌物真菌霉菌酵母菌生活史假菌丝子实体。

四、是非题1.切下真菌的任何一段营养菌丝，它们都能独立生长，因此营养菌丝也有繁殖能力。

2.青霉分生孢子梗梗基部有一厚壁的足细胞，其分生孢子一般呈蓝绿色。

3.在分类学上酵母菌分属于真菌门的藻状菌纲、子囊菌纲、担子菌纲和半知菌类。

4.因为不具吸收营养的功能，所以，将根霉的根称为“假根”。

5.曲霉属主要通过产生分生孢子进行无性繁殖，有性繁殖大多数不明，归为半知菌类。

原生质体制备和再生的影响因素

原生质体制备和再生的影响因素【摘要】以酿酒酵母YS5为出发菌株，经蜗牛酶酶解获得原生质体后，用紫外线进行诱变处理，通过一级筛选得到了61株诱变菌株，将这些诱变株直接进行发酵，利用气相色谱对发酵液酒精产量进行分析。

结果表明，经过紫外线照射30s后，通过筛选获得了一株酒精发酵较高产菌株，酒精产率达到了10.36%（v/v），比出发菌株提高了3.6%。

【关键词】酿酒酵母；原生质体；紫外诱变；甘蔗汁发酵酵母细胞的融合及酵母原生质体的诱变的一个重要前提就是如何制备大量的原生质体，原生质体制备率受到各种条件的影响，如菌龄、酶浓度、温度、预处理等的影响，因此确定不同因素对酵母原生质体的影响及优化不同因素，可以大大提高产率。

1.菌体菌龄对原生质体制备的影响微生物的生理状态是决定原生质体产量的主要因素之一，特别是菌龄，明显影响原生质体释放的频率。

不同时期的菌体，对各种溶壁酶的敏感性不同，原生质体的形成率与再生率也有很大差异。

较年轻的菌体细胞制备原生质体较为容易，而且此阶段的原生质体再生率也较高。

处于对数生长期的菌体代谢活性高而稳定、细胞壁对酶的作用较为敏感，且大小比较一致，生长适应能力强，故通常取处于对数生长期的菌体制备原生质体。

有研究表明对数生长早期形成率最高，对数生长中期时再生率最高，对数生长晚期的再生率也比对数生长中期的低。

这是由于细胞壁越稚嫩，越易被酶破坏，对数生长早期菌体幼小，代谢活性高而稳定、细胞壁对酶的作用较为敏感，且大小比较一致，故生活适应能力强；对数生长中期幼小菌体对不利因素抵抗能力差，一旦失去细胞壁，较难恢复；对数生长晚期的原生质体存在着很大比例的非活性个体。

菌体如果进入稳定期，细胞壁结构趋于稳定和老化，不易去壁形成原生质体，原生质体形成率显著降低，而且再生率也有所下降。

微生物的菌龄是随着菌种和培养条件而异，酵母菌菌液中加入β-巯基乙醇可以破坏细胞壁组分中的二巯基，处于对数生长期的酵母菌菌体代谢极为旺盛，细胞壁易被瓦解，其细胞壁对蜗牛酶较为敏感，易于酶解脱壁，且酵母菌制备原生质体时，要使菌体同步化才能大幅度的提高制备率。

原生质体融合(实验报告)

酵母原生质体融合××××××××××酵母有发酵工业的灵魂之称，其发酵性能的好坏直接影响发酵产品的质量，同时也决定着发酵工艺流程和运转周期及运转费用[1]。

因此，选育优良的酵母菌种在发酵工业中具有重要的意义[2]。

对酿酒酵母的选育始终是酿酒工作者所要从事的重要工作之一。

好的酿酒酵母能够提高酒的质量和产量，赋予酒良好的风味；能够简化工艺流程，减少设备投资；能够缩短发酵周期，降低运转费。

原生质体融合育种( protoplast fusion)是20世纪60年代发展起来的基因重组技术。

通过两个遗传性状不同的亲株原生质体融合从而达到杂交目的。

1960年法国的Barsi研究小组在培养两种不同动物细胞混合时发现了自发融合现象，同时日本的Dkada发现仙台病毒可诱发内艾氏腹水病细胞彼此融合，从而开始了细胞融合的探索。

国内外对原生质体融合技术的研究都比较成熟, 一般认为酵母菌原生质体融合技术的关键点有原生质体的制备和再生、原生质体的融合以及融合子的筛选等。

传统的对酿酒酵母的选育方法主要有自然分离、连续培养和诱变育种[3]。

近年来重组技术，基因工程和原生质体融合技术迅速发展，得到了广泛应用。

两个或两个以上的细胞经过自然的或者人为的作用合并成为一个细胞叫融合细胞，这个过程就称为细胞融合过程。

用微生物作材料进行细胞融合，必须消除细胞壁和细胞膜。

通常采用酶解作用破除细胞壁，采用聚乙二醇促使细胞膜融合。

细胞融合之后，还经过细胞质融合，细胞核重组，细胞壁再生等一系列过程才能形成具有生活能力的新菌株。

融合后的细胞有两种可能：一是染色体DNA不发生重组，两种细胞的染色体共存于一个细胞内，形成异核体，这是不稳定的融合。

另一类是两亲本细胞核染色体DNA真正发生重组。

通过连续传代分离纯化可以区别这两类融合。

应该指出，即便是真正的重组融合子，在传代中也有可能发生分离，产生回复或新的遗传重组体。

《原生质体的制备》课件

选取动物组织
选择健康的动物组织作为制备原生质体的材料。
酶解消化
将动物组织放入酶液中，在适宜的温度和pH条件下进行酶解消化。
洗涤和保存
清洗原生质体去除残留的酶液和其他杂质，然后进行保存备用。
微生物原生质体制备的步骤
选取微生物菌株
选择生长旺盛、无污染的微生物菌株作为制备原生质体的材料。
成功案例2
在蓝细菌原生质体制备实验中，通过选择合适的酶种类和浓度，以及优化酶解和再生过程，成功制备出可用于遗传转化实验的原生质体。
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实验过程中的注意事项
1 操作规范
在操作过程中，要严格遵守无菌操作规程，避免交叉污染。
2 酶液处理
在操作过程中，要严格遵守无菌操作规程，避免交叉污染。
3 离心条件
在操作过程中，要严格遵守无菌操作规程，避免交叉污染。
4 温度控制
在操作过程中，要严格遵守无菌操作规程，避免交叉污染。
实验后的处理事项
02
原生质体制备的实验材料
植物细胞原生质体制备所需的材料
酶
用于分解细胞壁，常用的酶包括纤维素酶、果胶酶和离析酶等。
渗透压稳定剂
用于保持原生质体的稳定形态，常用的渗透压稳定剂包括甘露醇、山梨醇等。
01
植物组织
用于制备原生质体的材料，通常选用幼嫩的叶片、茎段或根尖等部位。
02
03
缓冲液
用于维持细胞内的酸碱平衡，常用的缓冲液包括Tris-HCl和MES 等。
微生物原生质体制备所需的材料
微生物菌落
用于制备原生质体的材料，可以根据实验需求选择不同的微生物菌落。
酶
用于分解细胞壁，常用的酶包括溶菌酶、蜗牛酶等。

酿酒酵母W5及休哈塔假丝酵母20335原生质体制备条件的确定

酿酒酵母W5及休哈塔假丝酵母20335原生质体制备条件的确定张麓岩;张梦云;葛菁萍【摘要】确定了酿酒酵母W5及休哈塔假丝酵母20335原生质体制备的最佳条件.选取不同脱壁预处理时间及不同酶解时间,对酿酒酵母W5、休哈塔假丝酵母20335进行原生质体制备和再生,比较制备率和再生率.确定脱壁预处理30 min后,以终浓度2%的蜗牛酶,30 ℃、100 r/min酶解处理15 min为双亲株原生质体制备的最佳条件.利用原生质体融合的方法,以酿酒酵母W5和休哈塔假丝酵母20335为亲本株,构建可以利用木糖生产生物乙醇的新型酿酒酵母融合株,该前期工作为W5、20335原生质体融合工作奠定了重要的基础,对于将木质纤维素原料转化为生物乙醇的研究具有极其重要的意义.【期刊名称】《微生物学杂志》【年(卷),期】2010(030)005【总页数】4页(P41-44)【关键词】酿酒酵母;休哈塔假丝酵母;原生质体融合;制备率;再生率【作者】张麓岩;张梦云;葛菁萍【作者单位】黑龙江大学生命科学学院,微生物黑龙江省高校重点实验室,黑龙江,哈尔滨,150080;黑龙江大学生命科学学院,微生物黑龙江省高校重点实验室,黑龙江,哈尔滨,150080;黑龙江大学生命科学学院,微生物黑龙江省高校重点实验室,黑龙江,哈尔滨,150080【正文语种】中文【中图分类】Q933自1974年匈牙利学者Ferenczy报道了白地霉(Geotrichum candidum)营养缺陷型突变株的原生质体融合后[1],微生物原生质体融合技术迅速发展。

融合的种属范围逐渐扩大,融合的亲缘关系由最初的种内株间融合,发展到种间、属间,甚至科间的远源融合,融合的技术也由最初的化学融合法扩展到电细胞融合法、电磁融合法、激光融合法等[2]。

发展至今,原生质体融合技术已成为一种系统、成熟的微生物育种手段,在微生物工业育种中发挥着重要的作用。

木质纤维素原料是地球上最丰富、最廉价的可再生资源,但目前大部分木质纤维素资源尚不能够被人类利用。