荧光显微镜详解

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三、荧光显微镜的基本构造
光源： 一般采用超高压汞灯(50-200W)等，它可发出各种波长的光(含大量紫外光 ,蓝 紫光) 滤片系统: 激发滤色镜，紧靠光源，提供一定波长范围的激发光（一般有紫外、紫色、蓝 色、绿色和红色激发滤片），仅使一定波长的激发光透过照射到标本上，而将 其他光都吸收掉。 UV:340-380nm V:390-460nm B:460-500nm G:500-570nm 阻断滤色镜 , 透过相应波长范围的荧光 ,吸收和阻挡激发光进入目镜、以免 于扰荧光和损伤眼睛。 二向分色镜，透射长波光线和反射短波光线的功能 照相系统
荧光显微镜的使用
森林生物工程 黄雅婷
目录
一、荧光显微镜成像原理 二、荧光显微镜的优点及应用 三、荧光显微镜的基本构造 四、荧光显微镜的使用 五、使用荧光显微镜注意事项 六、荧光镜检样品的制作注意事项 七、荧光强度计算
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一、荧光显微镜成像原理
某些物质在一定短波长的光(如紫 外光等)的照射下吸收光能进入激发态， 从激发态回到基态时, 就能在极短的时 间内放射出比照射光波长更长的光(可 见光)，这种光就称为荧光。
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五、使用荧光显微镜注意事项
1、打开灯源，超高压汞灯要预热几分钟才能达到最亮点。开关 间断时间要保持在20～30分钟以上。 高压汞灯关闭后不能立 即重新打开，在5min或稍长时间内 ,不许重新点亮 ,待汞灯 冷却后 ,始能再次点亮 .否则会不稳定，影响汞灯寿命
2、放置标本片，调焦后即可观察。 使用中应注意：防止紫外线 对眼睛的损害，做实验前将防护屏放下；用油镜观察标本时， 必须用无荧光的特殊油镜
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六、荧光镜检样品的制作注意事项
1. 不能使用本身能产生荧光的药剂 2. 切片标本不能太厚 3. 因石蜡可产生青色荧光，采用石蜡制片时，脱蜡必须 彻底。切片进入水后，应充分水洗，再经荧光染料处理。 4. 最好采用萤石玻璃制成的载玻片、盖玻片。 5. 封片时可采用甘油等无荧光的封固剂。
荧光显微镜是利用一个高发光效
率的点光源，经过滤色系统发出一定 波长的光作为激发光，激发标本内的 荧光物质发射出各种不同颜色的荧光 后，再通过物镜和目镜的放大进行观 察。
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二、荧光显微镜的优点及应用
优点：
1.检出能力高，即使荧光很微弱也易辨认，敏感性高（放大作用） 2.对细胞的刺激小（可以活体染色） 3.能进行多重染色等
３、检测时间每次以1h为宜，超过90min，高压汞灯发光强度逐 渐下降，荧光减弱，标本经激发15min后，荧光亦明显减弱。 标本染色后立刻观察，因存放时间太久，荧光会逐渐猝灭。 可将染好色的标本用黑纸包好，存放在聚乙烯塑料袋中，4℃ 保存，可延缓荧光的猝灭时间。
4、荧光显微镜的激发装置及高压汞灯寿命有限，标本应集中检 查，节省时间
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三、荧光显微镜的基本构造--光源
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四、荧光显微镜的使用
(1)打开与显微镜连接的计算机并点击数码成像系统软件，打开 高压汞灯的电源控制箱开关。
(2)插入挡光板，中断光路。 (3)预热5—10分钟。 (4)将载有样品的载玻片放到载物台上。 (5)选择物镜(按照先低倍，后高倍顺序)在白光下选好视角 (6)旋转分光镜组件转盘，选择所需要的分光镜组件 (7)使用阻断滤片 (8)通过粗、细螺旋调整焦距。 (9)数码成像系统软件采集数码图像。
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七、荧光强度计算
运用Image-Pro Plus图像分析软件分析荧光图像，计算荧光强度
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用途：
1.物体构造的观察——荧光素 2.荧光的有无、色调比较进行物质判别——抗体荧光等 3.发荧光量的测定对物质定性、定量分析
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二、荧光显微镜的应用--亚细胞定位
2020/9/23 豌豆细胞中NO衍生产物的亚细胞定位
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二、荧光显微镜的应用--亚细胞定位
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二、荧光显微镜的应用--活性分析