KJWI-QA-27 大肠菌群计数方法作业指导书
大肠菌群计数方法作业指导书
文件制修订记录1.0目的规定大肠杆菌计数的方法。
2.0适用范围适用于凉茶、浓缩汁、工艺水等产品或原辅材料中的大肠杆菌群的计数。
3.0术语3.1大肠菌群：一群在36℃条件下培养48h能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧格兰仕隐形无芽孢杆菌。
3.2MPN最可能数（most probable number）：基于泊松分布的一种间接计数方法。
4.0职责4.1质检部：负责按此方法对来凉茶、浓缩汁、工艺水等产品或原辅材料中大肠菌群进行计数。
5.0流程图见附录A、附录B。
6.0内容及要求6.1设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其它设备和材料如下：6.1.1恒温培养箱：36℃±1℃6.1.2冰箱：2℃-5℃6.1.3恒温水浴箱：46℃±1℃6.1.4天平：感量0.1g6.1.5振荡器6.1.6无菌吸管：1ml（具0.01刻度）、10ml（具0.1刻度）或微量移液器及吸头。
6.1.7无菌锥形瓶：容量500ml6.1.8无菌试管：18×200ml6.1.9小导管6.1.10无菌培养皿：直径90mm6.1.11菌落计数器6.2培养基和试剂6.2.1月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤6.2.2煌绿乳糖胆盐（BGLG）肉汤6.2.3乳糖胆盐发酵培养基（LBB）6.2.4乳糖蛋白胨培养基（LPB）6.2.5伊红美蓝琼脂培养基（EMB）6.2.6结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）6.2.775%乙醇溶液6.2.8无菌生理盐水：称取8.5g氯化钠溶于1000ml蒸馏水中，121℃高压灭菌15min6.3大肠菌群MPN计数法6.3.1凉茶、浓缩汁等产品及原辅材料中大肠菌群的测定6.3.1.1样品稀释a、固体和半固体样品：称取25g样品置于盛有225ml无菌生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1-2min，制成1：10的样品匀液。
b、液体样品：以无菌吸管吸取25ml样品置于盛有225ml的无菌生理盐水的无菌锥形瓶中，充分混匀，制成1：10的样品匀液。
总大肠菌的测定实验作业指导书
作业指导书 页码：第 1页，共11页 文件编号：JLQX-03-022 版次：2022版，第0次修订 文件名称：水中总大肠菌群的测定 发布日期：2022 年1 月1 日水中总大肠菌群的测定1、方法依据水质 水中总大肠菌群的测定 多管发酵法2、合用范围总大肠菌群是指那些能在37℃48h之内发酵乳糖产酸气的、需氧及碱性厌氧的革兰式阴性的无芽胞杆菌。
主要包括有埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属等菌属的细菌。
总大肠菌群的检验方法中，多管发酵法可合用于各种水样（包括底泥），但操作较繁，需要时间较长；滤膜法主要是用于杂质较少的水样，操作简单快速。
如果是使用滤膜法，则总大肠菌群可重新定义为：所有能在含乳糖的远腾氏培养基上，于37℃24h之内生长出带有金属光泽暗色菌落的、需氧的和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。
粪便中存在有大量的大肠菌群细菌，在水体中存活的时间和对氯的反抗力等于常道致病菌，如沙门氏菌、志贺氏菌等相似，因此将总大肠菌群作为水体受粪便污染的指示菌是合适的。
但在某些水质条件下，大肠菌群细菌在水中能自行繁殖，这是不利之处。
作业指导书 页码：第2页，共11页 文件编号：JLQX-03-022 版次：2022版，第0次修订 文件名称：水中总大肠菌群的测定 发布日期：2022 年1 月1 日3、测定原理3.1水中总大肠菌群的测定多管发酵是根据大肠菌群细菌能发酵乳糖、产酸产气以及具备革兰氏染色阴性、无芽孢、呈杆状等有关特性，通过三个步骤进行检验，以求得水样中的总大肠菌群数。
多管发酵法是以最可能数简称MPN来表示实验结果的。
实际上它是根据统计学理论，估计水体中的大肠杆菌密度和卫生质量的一种方法。
如果从理论上考虑，并且进行大量的重复检定，可以发现这种估计有大于实际数字的倾向。
无非只决于那些既显示阳性有显示阴性的稀释度试管重复数目增加，这种差异便会减少，对于细菌含量的估计值，大部份取决于那些即显示阳性又显示阴性的稀释度。
大肠菌群检验作业指导书 (1)
有限公司生效日期：2014.01.01页码：第1页，共2页1 目的规定大肠菌群的检验方法，以按标准化进行操作。
2 适用范围适用于大肠菌群检验。
3 术语大肠菌群：在37℃、24h能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽孢杆菌,它主要来源于人畜粪便,通常可作为水体粪便污染的指标菌。
4 职责质检员负责按作业指导书进行检验。
5 流程图无6 作业内容6.1 设备和材料净化工作台、培养箱（36±1℃）、新飞展示柜（0-10℃）、刻度吸管（10mL）、试管（18×200mm）、酒精灯、镊子、放大镜、培养皿、三角瓶（500mL）、显微镜等、40孔口的试管架、洗耳球等实验器材6.2 培养基和试剂75%酒精、生理盐水（0.9%）、乳糖胆盐发酵管、乳糖发酵管、伊红美蓝琼脂（EMB）、革兰氏染色液等培养基及试剂。
6.3 操作步骤6.3.1 样品处理一般情况下，产品没有受到污染，按照以下方法检验：取待检样品10mL接种于含10mL双料乳糖胆盐发酵管内,接种5管，置于36±1℃生化培养箱内培养24±2h，如所有乳糖胆盐发酵管都不产酸产气，可报告为大肠菌群阴性，如有产酸产气者，按下列程序进行。
6.3.2 分离培养从产酸产气的发酵管中用接种环挑取样液，划线接种于伊红美蓝琼脂平板上，置36±1℃生化培养箱内，培养18-24h。
取出观察菌落形态，并做革兰氏染色和证实试验。
6.3.3 证实试验有限公司生效日期：2014.01.01页码：第2页，共2页用接种环挑取疑似大肠菌群菌落（菌落呈黑紫色，表面有金属光泽），接种于乳糖发酵管内，置36±1℃生化培养箱内培养24±2h。
同时对上述可疑菌落进行革兰氏染色、镜检。
凡乳糖发酵管产气，革兰氏染色为阴性无芽胞杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。
6.3.4 MPN值计算及报告结果根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100mL样品中大肠菌群的最可能数。
014大肠菌群计数作业指导书
陕西威水饮品有限公司质量管理文件1目的：规定了公司产品检验大肠菌群（Coliforms）的计数方法.2适用范围：适用于本公司成品中大肠菌群的计数。
3编写依据：GB4789.3-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》. 4术语和定义:4.1 大肠菌群coliforms在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰阴性无芽胞杆菌。
4.2 最可能数most probable number，MPN基于泊松分布的一种间接计数方法。
5.设备和材料：除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：5.1 恒温培养箱：36℃±1℃5.2 冰箱：2℃～5℃5.3 恒温水浴箱：46℃±1℃5.4 天平：感量0.1g5.5 均质器5.6 振荡器5.7 无菌吸管：1mL（具0.01mL 刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头5.8 无菌锥形瓶：容量500 mL5.9 无菌培养皿：直径90 mm5.10 pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸5.11 菌落计数器6.培养基和试剂：6.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose，LST）肉汤：见附录A 中A.1 6.2 煌绿乳糖胆盐（Brilliant Green Lactose Bile，BGLB）肉汤：见附录A 中A.2 6.3 结晶紫中性红胆盐琼脂（Violet Red Bile Agar，VRBA）：见附录A 中A.36.4 磷酸盐缓冲液：见附录A 中A.46.5 无菌生理盐水：见附录A 中A.56.6 无菌1 mol/L NaOH：见附录A 中A.66.7 无菌1 mol/L HCl：见附录A 中A.7第一法大肠菌群MPN 计数法7检验程序：大肠菌群MPN计数的检验程序见图1。
图1 大肠菌群MPN计数法检验程序8操作步骤：8.1 样品的稀释8.1.1 固体和半固体样品：称取25g样品,放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内,8000r/min～10000r/min 均质1min～2 min,或放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2 min，制成1:10的样品匀液。
肉制品中大肠菌群的检验—第二法大肠菌群平板计数法
平 板
无菌磷酸盐缓冲液
计
数
无菌生理盐水
法
1mol/LNaOH 溶液
1mol/LHCl溶液
四、大肠菌群平板计数检样程序
选择15~150平板计数 典型和可疑菌落
36℃±1℃培 养18h~24h
典型菌落为紫红色 周围有红色胆盐沉 淀环，直径为0.5mm
挑选10个典型菌 落接种到BGLB
五、大肠菌群平板计数检样操作步骤
大肠菌群平板计数法
目录页
样品的采集和处理 设备和材料 培养基和试剂
大肠菌群平板计数检样程序 大肠菌群平板计数检样操作步骤
一、样品的采集和处理
大
1. 样品的采样原则和采样方案
肠
菌 群
样品的采样原则和采样方案和大肠菌群MPN计数法一样，都
平 板
按照国家食品微生物学检验总则GB4789.1—2016中的相关规定
计 数
去实施。
法
2. 样品的采集和处理
样品的采集和处理方式与大肠菌群MPN计数法一样，都按
照国家食品微生物学检验肉与肉制品检验GB/T 4789.17—2003
中的相关规定去实施。
二、设备和材料
备和材
菌
群
料如下：
平
板 计
➢ 恒温培养箱、恒温水浴箱、 均质器、振荡器、无菌
数 法
吸管或微量移液器及吸头、无菌锥形瓶、天平、菌落
计数器、无菌培养皿、菌落计数器、pH 计或pH 比
色管或精密pH 试纸等。
三、培养基和试剂
大 肠
煌绿乳糖胆盐(brilliantgreenlactosebile,BGLB)肉汤
菌 群
结晶紫中性红胆盐琼脂(violetredbileagar,VRBA)
大肠菌群检测(平板计数法)
平板菌落数的选择
选择菌落数在15-150之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。 典型菌落为紫红色，菌落周围有胆盐与酸形成的沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大。
什么样的菌落必须要做证实试验
一是非典型菌落，如在颜色、直径与典型菌落不符合的菌落。 另一种情况是被检样品中含有乳糖以外的其他糖类，如牛奶、饮料等样品。本
36℃±1 ℃ 18h ~24h
挑选10个菌落分别 接种到BGLB
VRBA琼脂
配方(g/L): 蛋白胨:7.0; 酵母粉:3.0;乳糖:10.0;3号胆盐:1.5;中性红:0.03;结晶紫:0.002;氯化 钠:5.0; 琼脂:15.0;pH 7.4±0.1,25℃ 其中蛋白胨提供氮源；酵母粉提供生长促进因子和Ｂ族维生素；乳糖提供碳源， 大肠菌群发酵乳糖，产生酸性物质；３号胆盐是一种抑菌剂，主要是抑制革兰氏 阳性菌；结晶紫也是一种抑菌剂，主要是抑制革兰氏阳性菌和一部分革兰氏阴性 菌；中性红是一种指示剂，在酸性条件显红色，碱性条件下显无色。氯化钠维持 细菌生长时的渗透压。琼脂是一种凝固剂。
10倍系列稀释
选择2~3个适宜稀释度的样液，接种VRBA平板
36℃±1℃
18~24h
计数典型和可疑菌落
注：VRBA(结晶紫中性红胆盐 琼脂)又称为：VRB或VRBL
BGh
报告结果
平板计数法操作
菌落数在15-150之 间的平板,计数典型
和可疑菌落
典型菌落为紫红色周围有 红色胆盐沉淀环，0.5mm
来大肠菌群的定义是发酵乳糖，但由于样品含有的其他糖类混入了培养基，使 得不能分解乳糖但能分解其他糖类的细菌也能够长出红色菌落，所以需要进行 证实实验。
结果报告
经最后证实为大肠菌群阳性的BGLB管的百分比乘以计数的平板菌落数，再乘 以稀释倍数，即为每g (mL)样品中大肠菌群数 。
大肠菌群计数
原标准
01
初发酵
02
EMB分离培养
03
染色，复发酵
04
报 告
05
现标准
06
LST初发酵
07
BGLB验证
08
报 告
09
检样
稀释
月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST）36±１℃，24~48±2h
不产气
产气
煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB） 36±１℃，24~48±2h
不产气
产气
大肠菌群阴性
大肠菌群阳性
计数红色带气泡菌落
报告结果
36℃±1℃
24±2h
大肠菌群PetrifilmTM 测试片检验程序
操作要点
按第一法的样品制备方法进行。 样品匀液的pH值应在6.5～7.5之间，pH值过低或过高时分别用1M NaOH或1M HCl予以调节。 合理稀释度的选择，每稀释度接种2张测试片。 接种时避免气泡产生。 培养基未凝固时勿挪动。 将测试片的透明面朝上置于培养箱内，堆叠片数不超过20片。
MPN
阳性管数
1g(mL)检样中最大可能数（MPN）表
使用MPN检索表的注意点
这个MPN检索表是ISO、FDA、AOAC、USDA/FSIS、北欧等标准通用的。 表里的数字是有小数点的。 报告单位不同。现报告单位为g/ml，而原报告单位是100g/ml。 原标准MPN表有64个组合，而现标准选择
选择菌落数在30~150之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。 典型菌落为紫红色，菌落周围有胆盐与酸形成的沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大。
证实试验
从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB肉汤管内，进行证实试验。 BGLB肉汤管产气者，所对应的菌落即为大肠菌群阳性菌落。
微生物作业指导书
一．适用范围：本方法引用GB/T4789-2003，适用于成品大肠菌群/生菌数检验/人员涂抹大肠菌群及生菌数检验二．检验规范：1）样品制备和稀释以无菌操作取25g样品放入装有225ml无菌生理盐水的广口瓶内，振摇均匀，制成1：10的样品匀液。
用1ml灭菌吸管准确吸取1：10的样品匀液1ml，注入含9ml无菌生理盐水的的螺旋盖试管中，振摇，制成1：100的样品匀液。
2）平板菌落计数A：取1ml灭菌吸管，吸取1：10稀释样品匀液1ml，分别接种两个已经编号的灭菌平皿内，再以同一吸管吸1：100样品匀液1ml，分别接种两个异外编号的灭菌平皿内。
B：分别加12-15ml营养琼脂培养基（已放45±1℃的水浴中恒温）到各平皿内，立即将平皿内的样品液和琼脂培养基充分混合。
混合方法是将平皿倾斜和旋转。
要防止把混合物溅到平皿壁和盖上，同时将另一平皿加入1ml生理盐水和营养琼脂12-15ml混合，作空白对照试验。
将样品液加入平皿后应立即倾注琼脂培养基，每个样品从开始稀释到倾注最后一个平皿所用的时间不得超过20min。
C：待琼脂凝固后，倒置平板，在36±1℃恒温培养箱内培养24±2h。
D：菌落计数和结果的报告方法a) 若为一种稀释倍数时，则以该稀释倍数的两个平皿的菌落数平均值乘以稀释倍数Ａ1＋Ａ2 Ａ：稀释倍数─────×Ａ２Ａ1、Ａ2：培养皿菌落数b) 若有两种稀释倍数时，则依下列公式计之，记录生菌数时应将第三位数字四舍五入Ａ1＋Ａ2 Ｂ1＋Ｂ2─────×Ａ＋─────×Ｂ２２─────────────────２Ａ、Ｂ：稀释倍数Ａ1、Ａ2、Ｂ1、Ｂ2：稀释倍数之菌落数3）大肠菌群检验A：用1ml灭菌吸管分别吸取1：10稀释的样品匀液，接种两个灭菌平皿，每皿1ml。
另取1ml灭菌生理盐水加入一个灭菌平皿作空白对照。
B：将冷却至45±1℃的去氧胆酸盐琼脂培养基10-15ml倾注到每个平皿中，小心旋转平皿，将培养基与样液充分混合。
大肠菌群检验作业指导书[1]
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密级一般大肠菌群检验作业指导书生效日期2011年8月1日文件页码1/81.0 水源水1.1 范围本法适用于天然泉水水源水大肠菌群的检验。
1.2 原理根据大肠菌群细菌具有的生物特性，如革兰氏阴性无芽胞杆菌，在37℃培养24h能发酵乳糖并产气的特点，将不同量的水样接种到含乳糖的培养基中，经培养后根据阳性反应结果可测出原水样中大肠菌群的MPN值。
1.3 培养基和试剂1.3.1 乳糖胆盐发酵培养液。
1.3.2 亮绿乳糖胆盐培养液（BGB）。
1.3.3 灭菌生理盐水。
1.4 仪器1.4.1 超净工作台。
1.4.2 高压蒸汽灭菌锅。
1.4.3 培养箱：36℃±1℃。
1.4.4 冰箱：0℃～8℃1.4.5 电子天平：感量0.1g。
1.4.6 培养皿。
1.4.7 小倒管。
1.4.8 试管：150mm×20mm,140mm×15mm。
1.4.9 吸管：10mL、5mL、1mL。
1.4.10 接种环。
1.4.11 酒精灯。
1.5 检测步骤1.5.1 推测性检验1.5.1.1 吸取10mL水样接种到盛有10mL双料乳糖胆盐发酵培养液中，共接种5份。
1.5.1.2 吸取1mL水样接种到盛有10mL单料乳糖胆盐发酵培养液中，共接种5份。
1.5.1.3 另吸取1mL水样接种到9mL灭菌生理盐水中，混匀，用5mL灭菌吸管吸取5mL稀释液，分别加到5支盛有10mL单料乳糖胆盐发酵培养液中，每管1mL（即0.1mL水样）。
轻摇试管，使液体充分混合，置36℃±1℃培养箱内培养24h。
观察每支管是否产气，若有气体产生该管则为推测性检验阳性。
如不产气则为大肠菌群阴性。
密级一般大肠菌群检验作业指导书生效日期2011年8月1日文件页码2/81.5.2 确证性试验1.5.2.1 自推测性检验阳性管中取一接种环培养液，接种到亮绿乳糖胆盐培养液（BGB）管中，置36℃±1℃培养箱中培养48h。
1.5.2.2 观察BGB管中的产气情况，如有气体产生，就可确定为“大肠菌群阳性”；如无气体产生则为“大肠菌群阴性”。
2017年word版食品中大肠菌群测定食品中大肠菌群的测定
一、编制目的为规范本中心食品中大肠菌群测定的检验方法，特编制本指导书。
二、适用范围本作业指导书适用于食品中大肠菌群( Coliforms)计数的方法。
本作业指导书第一法适用于大肠菌群含量较低的食品中大肠菌群的计数;第二法适用于大肠菌群含量较高的食品中大肠菌群的计数。
三、编制依据GB/T 4789.3—2016 《食品安全国家标准食品卫生微生物学检验大肠菌群计数》。
四、实验原理4.1 MPN法 MPN法是统计学和微生物学结合的一种定量检测法。
待测样品经系列稀释并培养后,根据其未生长的最低稀释度与生长的最高稀释度,应用统计学概率论推算出待测样品中大肠菌群的最大可能数。
4.2平板计数法大肠菌群在固体培养基中发酵乳糖产酸,在指示剂的作用下形成可计数的红色或紫色,带有或不带有沉淀环的菌落。
五、仪器和试剂5.1设备与材料5.1.1冰箱：2℃～5℃；5.1.2恒温培养箱：36℃±1℃；5.1.3恒温水浴锅：46℃±1℃5.1.4显微镜：10×～100×；5.1.5灭菌乳钵、灭菌玻璃珠：直径约5mm;5.1.6 天平：感量0.1g；5.1.7灭菌吸管：1mL(具0.01mL刻度)、10 mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸头；5.1.8灭菌培养皿：直径90ml、灭菌锥形瓶：500mL；5.1.9灭菌刀、剪子、镊子等。
5.2培养基和试剂5.2.1月桂基硫酸盐胰蛋白胨胨(lauryl sulfate tryptose,LST)肉汤将胰蛋白胨或胰酪胨20.0g、氯化钠 5.0g、乳糖 5.0g、磷酸氢二钾2.75g、磷酸二氢钾2.75g，溶于蒸馏水1000mL中，校正PH至6.8±0.2，分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10ml。
121℃高压灭菌15min。
5.2.2煌绿乳糖胆盐(brilliant green lactose bile,BGLB)肉汤将蛋白胨10.0g、乳糖10.0g溶于约500ml蒸馏水中，加入牛胆粉(oxgall或oxbile)200ml溶液（(将20.0g脱水牛胆粉溶于200mL蒸馏水中,调节pH至7.0～7.5），用蒸馏水稀释到975ml，调节PH7.2±0.1，再加入0.1%煌绿水溶液13. 3mL,用蒸馏水补足到1000mL,用棉花过滤后,分装到有玻璃小倒管的试管中,每管 10mL。
食品大肠菌群的测定(平板计数法).
任务五 典型和可疑菌落计数
• 选择菌落数在15~150之间的平板，分别计 数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。 • 典型菌落为紫红色，菌落周围有胆盐与酸形 成的沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大。
• 任务六 证实试验
• 从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和 可疑菌落，分别移种于BGLB肉汤管内，进 行证实试验。 • BGLB肉汤管产气者，所对应的菌落即为大 肠菌群阳性菌落。
注意事项 • 1、选择稀释度时，应以对含菌量的估计为 依据，具体情况所选稀释度不同。 • 2、两种检测方法的比较
• 平板计数法相对于MPN法来说，检验结果更 精确。 • 适合用于污染比较严重的样品，但对于污 染菌量太少的样品，还是MPN法更有优势。
任务四 平板制备
选择适宜的稀释样液 根据对标本情况的估计,选择 3 个适宜稀释度,吸取该稀释度1mL稀释液于灭菌平皿内。 待培养基冷却至46℃左右，以无菌操作侵入无菌培 养皿中。每个平皿倒入约15-20mL培养基，利用培养基冲 散菌液，混匀。冷却凝固后，再在表面加3-4mL培养基。
从样品稀释到平板 涂布要求在15min 内 完成。
加入46℃结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)培养基 12~15ml待琼脂凝固后，再加3-4mL培养基覆盖。 挑选菌落接种BGLB
典型菌落为紫红色 , 菌 落周围有红色的胆盐沉 淀环。菌落直径为 0.5ห้องสมุดไป่ตู้m 或更大。
实践操作
任务一 仪器试剂准备
任务二 仪器试剂灭菌
任务三 样品稀释制备
全过程遵循无菌操作程序，考虑如何满足要求？ ⑴检样处理 以无菌操作取经过充分摇匀的检样25mL， 放入含有225mL灭菌生理盐水的灭菌广口瓶内做成1:10的 均匀稀释液。 ⑵样品稀释 用1mL灭菌吸管,吸取1:10稀释液1mL,沿管壁 徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内 （注意吸管尖端不要触及管内稀释液),充分振摇试管，使 之混合均匀,制备成1:100的稀释液。另取1mL灭菌吸管,按 上项操作顺序，作10倍递增稀释液,如此每递增稀释一次, 即换用1支1mL灭菌吸管。
大肠菌群检验方法及操作方法
大肠菌群检验方法及操作方法1、什么是大肠菌群：指一群需氧及兼性厌氧，在37℃能分解乳糖产酸、产气的革兰氏染色阴性无芽胞杆菌。
2、大肠菌群的组成：大肠埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、产气克雷伯氏菌属和阴沟肠杆菌。
3、大肠菌群的测定意义◆粪便污染的指标菌：大肠菌群或粪大肠菌群◆以大肠菌群作为粪便指标菌原因：1)在粪便中数量最大；2)在外环境中存活的时间与致病菌大体相同；3)检测方法简便容易。
◆大肠菌群的测定意义：1)判断食品中否受到粪便污染。
2)有利于控制肠道传染病的发生和流行。
3)有利于控制食品在生产加工、运输、保存等过程中的卫生状况。
4、大肠菌群的生物学特性1 形态与染色：革兰氏染色阴性，无芽胞杆菌。
2 发酵乳糖产酸产气3 培养特性：在EMB琼脂上的典型菌落:呈深紫黑色或中心深紫色，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，常有金属光泽；4 在麦康凯琼脂上的典型菌落：呈桃红色或中心桃红、圆形，扁平，光滑湿润。
5、大肠菌群检验方法及操作方法◆国家标准：◆三步法：乳糖胆盐发酵试验→分离培养→证实试验(乳糖发酵试验)◆行业标准：◆两步法：推测试验→证实试验表1 大肠菌群在几种常用分离培养上的菌落特征MPN法简介Most Probable Number Method最大可能数•对样品进行连续系列进行稀释，加入培养基进行培养，从规定的反应呈阳性管数的出现率，用概率论来推算样品中菌数最近似的数值。
•MPN检索表只给了三个稀释度，如改用不同的稀释度，则表内数字应相应降低或增加10倍。
6、粪大肠菌群的检验•粪大肠菌群：系一群需氧及兼性厌氧，在44.5℃培养24h内能发酵乳糖产酸产气和分解色氨酸产生靛基质的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
•于LST中36℃培养48h内产气，并于EC内培养44℃24h产气的一群细菌；在胰蛋白胨肉汤中于44.5℃，24h 内产生吲哚的耐热大肠菌群。
检验方法：7、检验注意事项1）从制备样品匀液至稀释完毕,全过程不得超过15min。
水质_总大肠菌群测定作业指导书
水质总大肠菌群测定作业指导书1水样采集、运输和保存1.1 采样瓶应经高压或干热灭菌处理后方可使用；1.2 样品含有余氯时采样瓶灭菌前应加脱氯剂，即于500mL采样瓶中加入0.3mL10%硫代硫酸钠溶液；1.3 样品含铜锌等重金属较高时采样瓶灭菌前应加螯合剂，即于500mL）溶液；采样瓶中加入1.0mL15%乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na21.4 同一地点同时采多瓶水样时，细菌学检验水样先采；1.5 采样时，采样瓶不得用水样荡洗；1.6 采样后，样品应2小时内检验，否则，应10℃以下保存且不超过6小时。
2分析方法2.1方法名称、方法来源及适用范围方法名称：多管发酵法方法来源：《水和废水监测分析方法》(第四版)国家环保总局2002年第五篇第二章五(一)方法适用范围：此法适用于各种水样（包括底泥）的总大肠菌群测定。
2.2仪器高压蒸汽灭菌器电热干燥箱恒温培养箱显微镜冰箱采样瓶、三角烧瓶、试管、平皿（直径9cm）、刻度吸管等器皿121℃（20min）高压蒸汽灭菌后于电热干燥箱中烘干。
2.3标准菌株制备将标准菌株的母种或稳定工作种接种到单倍乳糖蛋白胨培养液中培养对照控制。
必须包括大肠埃希氏菌和山夫登堡沙门氏菌两种对照。
接种完后需记录：母种的来源，母种和工作种的保存方法、保存温度、传代间隔时间、生长培养基及孵育条件，确认试验（存活度、纯度、关键诊断指标等），母种到工作种的传代代数。
2.4培养基2.4.1 单倍乳糖蛋白胨培养液：市售乳糖蛋白胨培养基，按铭牌配制，用定量加液器分装每个试管10ml，加塞，在115℃灭菌20min，贮存于暗处备用。
2.4.2 三倍乳糖蛋白胨培养液：市售乳糖蛋白胨培养基，按铭牌比例，三倍配制（蒸馏水除外），用定量加液器分装每个试管5ml或每个大试管50mL，加塞，在115℃灭菌20min，贮存于暗处备用。
2.4.3 品红亚硫酸钠培养基：市售品红亚硫酸钠培养基，按铭牌配制，分装于三角烧杯内，加塞，在115℃灭菌20min，贮存于冷暗处备用。
(完整)16大肠菌群的检验作业指导(发酵法)
参照《食品检验与分析》第一版P773-776参照《食品卫生国家标准汇编(3）》第一版GB 4789。
3—941。
原理大肠菌群系指一群在37℃下24h内能发酵乳糖产酸、产气的需氧或兼厌氧性革兰氏阳性无芽孢杆菌。
该菌群主要来自人粪便,以此作为粪便污染指标,来评价食品卫生质量具有广泛的卫生学意义。
食品中的大肠杆菌群数是以每100ml（g）检样内大肠杆菌群最近似数（M.P.N）来表示。
据此含义,所有食品卫生标准中所规定的大肠菌群的最小样品限量（即大肠菌值)为报告标准。
2.设备和材料2。
1温箱:37±1℃2.2 冰箱：0～4℃2.3 恒温水浴：44.5±0.5℃2.4 天平2.5 载玻片2.6 吸管2.7 广口瓶或三角瓶:容量瓶500ml2.8 玻璃珠：直径约5mm2。
9 平皿:直径为90mm2。
10 试管2。
11 显微镜2。
12 酒精灯2。
13 载玻片3。
培养基和试剂3.1乳糖发酵管:按GB 4789.28中4。
9规定。
3。
2伊红美蓝琼脂平板:按GB 4789.28中4。
25规定。
3.3乳糖发酵管：按GB 4789.28中4.10规定。
3.4 EC 肉汤:按GB 4789.28中4。
11规定.3。
5磷酸盐缓冲稀释液:按GB 4789.28中3.22规定。
3。
6生理盐水。
3。
7革兰氏染色液：按GB 4789。
28中2.2规定。
4。
检验程序大肠菌群检验程序如下：5。
方法及步骤 5。
1 检样稀释及培养5。
1。
1 以无菌操作,将检样25g （或25ml ）剪碎放于含有225ml 灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃内（瓶内预置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。
固体检样在加入稀释液后，最好置均质器中以8000～10000r/min 的速度处理1min ，做成1：10的均匀稀释液.5。
1。
2 用1ml 灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml ，沿管壁徐徐入含有9ml 灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液)，振摇试管，混合均匀,做成1:100的稀释液。
大肠菌群的计数标准
大肠菌群的计数标准目录一、引言 (1)二、大肠菌群的重要性 (1)2.1 指示作用 (1)2.2 法规要求 (2)三、常用的检测方法 (2)3.1 平板计数法 (2)3.2 MPN法 (3)3.3 其他快速检测方法 (3)四、计数标准 (3)4.1 适用范围 (3)4.2 计算公式 (4)4.3 结果解释 (4)五、质量控制 (4)六、案例分析 (4)6.1 食品行业 (4)6.2 饮用水安全 (5)一、引言大肠菌群是指一群能在37℃条件下发酵乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽孢杆菌，主要包括埃希氏菌属（Escherichia）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）、肠杆菌属（Enterobacter）等。
这些细菌广泛存在于人和动物的肠道中，并且在自然环境中也能找到它们的身影。
由于大肠菌群与粪便污染密切相关，因此被用作指示微生物来评估食品、饮用水及其他环境样本的安全性。
本文将详细介绍大肠菌群的定义、检测方法及其计数标准。
二、大肠菌群的重要性2.1 指示作用•卫生指标：大肠菌群的存在通常表明样品可能受到了粪便污染，这不仅意味着可能存在病原微生物的风险，还反映了生产加工过程中的卫生状况。
•风险评估：通过监测大肠菌群的数量可以间接判断其他潜在致病菌的存在概率，从而为食品安全管理提供重要依据。
2.2 法规要求许多国家和地区都制定了关于食品及饮用水中大肠菌群限量的规定。
例如，在中国，《食品安全国家标准》GB 4789.3-2016《食品微生物学检验 大肠菌群计数》就明确规定了不同类型食品的大肠菌群限值。
三、常用的检测方法3.1 平板计数法平板计数法是一种基于培养基上形成可见菌落进行定量分析的技术。
常用培养基包括麦康凯琼脂 （MacConkey Agar）和伊红美蓝琼脂 （Eosin Methylene Blue Agar, EMB）。
该方法操作简便但耗时较长，一般需要48小时左右才能完成全部步骤。
3.1.1 麦康凯琼脂法•原理：利用麦康凯琼脂的选择性和鉴别性，使大肠菌群生长并呈现红色或粉红色菌落。
大肠杆菌及大肠菌群计数方法
大肠杆菌及大肠菌群计数方法大肠杆菌和大肠菌群计数方法Enumeration of Escherichia coli and the coliform章节内容：传统检测大肠菌群和大肠杆菌的方法LST-MUG法检测冷藏和冷冻食品中的大肠杆菌（除双壳类软体动物制品外）瓶装水检测方法贝类和贝类肉制品检测方法柑桔类水果汁中大肠杆菌检测方法大肠菌群和大肠杆菌计数的其他方法参考文件大肠埃希氏菌，以前常称大肠杆菌，于1885年由德国儿科医生Theodor Escherich 发现，广泛存在于人类和温血动物的肠道中，是人类和动物肠道中需氧性共生菌的优势菌群，维持宿主健康部分生理功能必需的肠道菌。
大肠埃希氏菌属肠杆菌科，肠杆菌科包括许多种细菌，致病菌有沙门氏菌、志贺氏菌、和耶尔森氏菌。
虽然大多数的大肠埃希氏菌为非致病菌，但是当宿主免疫力降低或细菌侵入肠道的外组织或器官时，可引起肠外感染。
某些血清型可产生毒素，为致病性大肠埃希氏菌，可引起人类腹泻。
1892年，Shardinger建议把大肠杆菌作为粪便污染的指标。
由于大肠杆菌广泛存在于人类和动物中，而在其他地方少见。
再者，大肠杆菌能发酵葡萄糖（以后改为为乳糖）产生气体。
与已知的非产气致病菌容易区别开来。
因此，大肠杆菌的检测已成为水和食品的近期粪便污染指标，表明可能含有致病菌。
肠道中柠檬酸盐菌，克雷伯氏菌和肠杆菌能发酵乳糖，与大肠杆菌的生物型非常相似，使得把大肠杆菌作为健康威胁的指标，在实际应用中很复杂。
于是，大肠菌群这个术语用来描述这类肠道菌，大肠菌群不是一个分类学上的定义，而是一个工作定义，指的是一群在35℃培养48h，产酸产气的，革兰氏阴性的芽孢杆菌。
1914年，每国公共健康协会把大肠菌群作为一个重要的卫生标准。
虽然大肠菌群很容易检测到，但不一定与粪便污染有关系，因为在自然环境样品中也常存在。
于是，粪大肠菌群就作为粪便污染的指标。
首先由Eijkman提出，指的是在高温下发酵乳糖，是总大肠菌群的亚群，同时也称为耐热大肠菌群。
培养基配制作业指导书
5.0工作流程图
无
6.0内容及要求
6.1乳糖胆盐发酵培 养基
6.1.1用途：用于测定大肠菌群的乳糖发酵实验；
6.1.2成分（g/l）:蛋白胨（20g）、乳糖（10g）、猪胆盐（5g）、溴甲酚紫（0.01g）；
6.1.3配制方法：称取乳糖胆盐发酵培养基35g，加入1000ml蒸馏水中，加热煮沸溶解，
6.6.5储存条件：常温、密封、干燥处。
批准:
（仅盖有红色印章的文件才有效）
批准:
食品有限公司
作业指导书
文件号：KJWI-QA-24
版本:A/2
日期：2013-07-25页数：Page2of6
标题:培养基配制作业指导书
1.0目的
规定了培养基配制的基本要求及方法。
2.0范围
适用于大肠菌群、细菌总数、霉菌及酵母菌检测时用培养基配制。
3.0术语
无
4.0职责
标题:培养基配制作业指导书
622成分（g/l）:胰蛋白胨（5g）、酵母浸粉（2.5g）、葡萄糖（1g）、琼脂（15g）;623配制方法：称取本品23.5g，加入1000ml蒸馏水中，加热煮沸溶解，分装，121C高 压灭菌15min后备用；
6.2.4注意事项：灭菌后应在无菌环境下操作，出现结块严禁继续使用。
6.2.5储存条件：常温、密封、干燥处。
6.3月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤
6.3.1用途：用于大肠菌群、大肠杆菌、粪大肠菌群的初发酵试验及大肠杆菌（MPN计 数；
6.3.2成分（g/l）:胰蛋白胨（20g）、月桂基硫酸钠（0.1g）、乳糖（5g）、硫酸氢二钾 （2.75g）、氯化钠（5g）、磷酸二氢钾（2.75g）;
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食品有限公司版本:A/1日期:2012-05-25页数: Page 1 of 12标题：大肠菌群计数方法文件修改记录版本修订次数修订日期修订内容0 0 2011-02-14A 1 2012-05-25 修订食品有限公司版本:A/1日期:2012-05-25页数: Page 1 of 12标题：大肠菌群计数方法分发号 : ______(仅适用于控制文件)(仅盖有红色印章的文件才有效)1.0目的规定大肠杆菌计数的方法。
2.0适用范围适用于加多宝凉茶、浓缩汁、工艺水等产品或原辅材料中的大肠杆菌群的计数。
3.0术语3.1大肠菌群：一群在36℃条件下培养48h能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧格兰仕隐形无芽孢杆菌。
3.2MPN最可能数（most probable number）：基于泊松分布的一种间接计数方法。
4.0职责4.1质检部：负责按此方法对加多宝来凉茶、浓缩汁、工艺水等产品或原辅材料中大肠菌群进行计数。
5.0流程图见附录A、附录B。
6.0内容及要求6.1设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其它设备和材料如下：6.1.1恒温培养箱：36℃±1℃6.1.2冰箱：2℃-5℃6.1.3恒温水浴箱：46℃±1℃6.1.4天平：感量0.1g6.1.5振荡器6.1.6无菌吸管：1ml（具0.01刻度）、10ml（具0.1刻度）或微量移液器及吸头。
6.1.7无菌锥形瓶：容量500ml6.1.8无菌试管：18×200ml食品有限公司版本:A/1日期:2012-05-25页数: Page 1 of 12标题：大肠菌群计数方法6.1.9小导管6.1.10无菌培养皿：直径90mm6.1.11菌落计数器6.2培养基和试剂6.2.1月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤6.2.2煌绿乳糖胆盐（BGLG）肉汤6.2.3乳糖胆盐发酵培养基（LBB）6.2.4乳糖蛋白胨培养基（LPB）6.2.5伊红美蓝琼脂培养基（EMB）6.2.6结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）6.2.775%乙醇溶液6.2.8无菌生理盐水：称取8.5g氯化钠溶于1000ml蒸馏水中，121℃高压灭菌15min6.3大肠菌群MPN计数法6.3.1加多宝凉茶、浓缩汁等产品及原辅材料中大肠菌群的测定6.3.1.1样品稀释a、固体和半固体样品：称取25g样品置于盛有225ml无菌生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1-2min，制成1：10的样品匀液。
b、液体样品：以无菌吸管吸取25ml样品置于盛有225ml的无菌生理盐水的无菌锥形瓶中，充分混匀，制成1：10的样品匀液。
c、用1ml无菌吸管吸取1：10样品匀液1ml，沿管壁缓慢注入盛有9ml无菌生理盐水的试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管，制成1：100的样品匀液。
d、根据对样品污染状况的分析，按上述操作，依次制成10倍递增系列稀释样品匀液。
注意每递增稀释依次，换用一次1ml灭菌吸管。
从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min6.3.1.2初发酵试验a、每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1ml（如果接种量超过1ml，则用双料LST肉汤）。
食品有限公司版本:A/1日期:2012-05-25页数: Page 1 of 12标题：大肠菌群计数方法b、将以上接种好的试管置于36±1℃培养24±2h，观察导管内是否有气泡产生，如未产气则继续培养至48±2h。
记录在24h和48h内产气的LST肉汤管数。
未产气者为大肠菌群阴性，产气者则进行复发酵试验。
6.3.1.3复发酵试验用接种环从所有48±2h内发酵产气的LST肉汤中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤管中，36±1℃培养48±2h，观察产气情况。
产气者，计为大肠菌群阳性管。
6.3.1.4大肠菌群最可能数（MPN）的报告根据大肠菌群阳性管数，检索MPN表（见附录C），报告每克（或每毫升）样品大肠菌群的MPN值。
6.3.2工艺水等水样中大肠菌群的测定6.3.2.1推测性试验a、取待检样品10ml，接种到10ml双料的乳糖胆盐发酵培养液或乳糖蛋白胨培养液中，共接种5管；对于可能存在污染的水源，取待检样品10ml、1ml、0.1ml（取样品1ml于9ml无菌生理盐水中稀释，取稀释后的样液1ml），分别接种于含10ml双料、单料和单料乳糖胆盐发酵培养液或乳糖蛋白胨培养液中，各接种5管。
b、如果水样污染较严重，应加大稀释度，可接种1ml、0.1ml、0.01ml甚至0.1ml、0.01ml、0.001ml，每个稀释度接种5管，每个水样共接种15管。
接种1ml一下水样时，必须做10倍递增稀释后，取1ml接种，每递增稀释一次，换用1支1ml灭菌刻度吸管。
c、将以上接种好的试管置于36±1℃培养箱内培养24±2h，如所有乳糖胆盐发酵管或乳糖蛋白胨发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产气者，则按下列程序进行。
6.3.2.2确证性试验6.3.2.2.1方法一a、分离培养将产酸产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置于36±1℃升华培养箱内，培养18-24h取出。
观察菌落形态，用接种换挑取符合下列特征的菌落作革兰氏染色、镜检和证实试验。
食品有限公司版本:A/1日期:2012-05-25页数: Page 1 of 12标题：大肠菌群计数方法①菌落呈深紫黑色，表面有金属光泽；②紫黑色、不带或略带金属光泽的菌落；③淡紫红色、中心较深的菌落。
b、证实试验经上述染色镜检为革兰氏阴性无芽孢杆菌，同时接种乳糖胆盐发酵管内，置于36±1℃升华培养箱培养24±2h，有产酸产气者，即证实有大肠菌群存在。
6.3.2.2.2方法二自推测性检验阳性管中取1接种环培养液，接种到煌绿乳糖胆盐（BGLG）肉汤中，置于36±1℃培养箱内培养48h。
观察BGLG管中的产气情况，如有气味产生，就可确定为大肠菌群阳性，如无则为大擦汗那个菌群阴性。
6.3.2.3结果报告根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，可得出水样中大肠菌群的MPN 值。
5管法见附录E。
稀释样品查表后所得结果应乘以稀释倍数。
如所有乳糖胆盐发酵管均为阴性时，可报告大肠菌群未检出。
6.4大肠菌群平板计数法6.4.1样品稀释按6.3.1.1执行6.4.2平板计数6.4.2.1选取1-3个适宜的稀释度（液体样品可以选用原液）接种两个无菌平皿，每皿1ml，同时分别取1ml无菌生理盐水加入到两个无菌平皿作空白对照。
6.4.2.2及时将冷却至46℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）15-20ml倾注于每个平皿中。
小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后再加3-4ml结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）覆盖平板表层。
翻转平板，置于36±1℃培养箱内培养18-24h。
6.4.2.3选取菌落数在30-150之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑的大肠菌群菌落。
典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落至今岗位0.55mm或更大。
6.4.3证实试验食品有限公司版本:A/1日期:2012-05-25页数: Page 1 of 12标题：大肠菌群计数方法从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB肉汤管内，36±1℃培养箱内培养24-48h，观察产气情况。
凡BGLB肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。
6.4.4平板计数法的报告经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以6.2.2.3中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每克（或每毫升）样品中大肠菌群数。
例：10-4样品稀释液1ml，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：100×（6/10）×10-4 g/ml = 6.0×10 CFU/g （CFU/ml）7.0质量记录7.1 KJWIF-QA-34 《成品检测记录》食品有限公司版本:A/1日期:2012-05-25页数: Page 1 of 12标题：大肠菌群计数方法附录A大肠菌群MPN计数检验程序食品有限公司版本:A/1日期:2012-05-25页数: Page 1 of 12标题：大肠菌群计数方法检样25g（25ml）样品+225ml稀释液，均质10倍系列稀释选择适宜三个连续稀释度的样品匀液，接种LST肉汤管36℃±1℃ 48h±2h不产气产气BGLB肉汤36℃±1℃ 48h±2h不产气产气大肠菌群阴性大肠菌群阳性查ＭＰＮ表报告结果附录Ｂ大肠菌群平板计数检验程序食品有限公司版本:A/1日期:2012-05-25页数: Page 1 of 12标题：大肠菌群计数方法检样25g（25ml）样品+225ml稀释液，均质１０倍系列稀释选择2——3个适宜稀释度的样品匀液，接种VRBA平板36℃±1℃ 18—24h计数典型和可疑菌落BGLB肉汤或复发酵试验36℃±1℃ 24—48h报告结果食品有限公司版本:A/1日期:2012-05-25页数: Page 1 of 12标题：大肠菌群计数方法附录C大肠菌群最可能数（MPN）检索表每克（或每毫升）检样中大肠菌群最可能数（MPN）的检索见下表：阳性管数MPN 95%可信限阳性管数MPN95%可信限0.1 0.01 0.001 下限上限0.1 0.01 0.001 下限上限0 0 0 <3.0 —9.5 2 2 0 21 4.5 42 0 0 1 3.0 0.15 9.6 2 2 1 28 8.7 94 0 1 0 3.0 0.15 11 2 2 2 35 8.7 94 0 1 1 6.1 1.2 18 2 3 0 29 8.7 94 0 2 0 6.2 1.2 18 2 3 1 36 8.7 940 3 0 9.4 3.6 38 3 0 0 23 4.6 941 0 0 3.6 0.17 18 3 0 1 38 8.7 110 1 0 1 7.2 1.3 18 3 0 2 64 17 180 1 0 2 11 3.6 38 3 1 0 ？9 180 1 1 0 7.4 1.3 20 3 1 1 75 17 200 1 1 1 11 3.6 38 3 1 2 120 37 420 1 2 0 11 3.6 42 3 1 3 160 40 420 1 2 1 15 4.5 42 3 2 0 93 18 4201 3 0 16 4.5 423 2 1 150 37 4202 0 0 9.2 1.4 383 2 2 210 40 430 2 0 1 14 3.6 42 3 2 3 290 90 1000 2 0 2 20 4.5 42 3 3 0 240 42 1000 2 1 0 15 3.7 42 3 3 1 460 90 2000 2 1 1 20 4.5 42 3 3 2 1100 180 4100 2 1 2 27 8.7 94 3 3 3 >1100 420 —注1：本表采用3个稀释度［0.1g（或0.1ml）、0.01g（或0.01ml）和0.001g（或0.001ml）］，每个稀释度接种3管。