实验三细菌革兰氏染色法
细菌涂片的制备及革兰氏染色实验报告
实验三细菌涂片的制备及革兰氏染色[实验目的]1、掌握细菌涂片的制备方法及革兰氏染色。
2、学习无菌操作，树立无菌观念。
[实验原理]细菌细胞微小，无色而半透明，在普通光学显微镜下不易识别，必须借助染色使菌体着色（由于毛细管、渗透、吸附和吸收等物理作用以及离子交换、酸碱亲和等化学作用，染料能使细菌着色，并且因细菌细胞的结构和化学成分不同而有不同的染色反应）后，使其与背景形成明显的色差，从而能较清楚的观察到细菌的基本形态和结构。
根据不同的染色反应，可作为鉴别细菌的一种依据。
微生物染料是一种带苯环的有机化合物，其分子上具有发色基团和助色基团。
前者给化合物以特有的颜色，但不能与细菌结合；后者使化合物具成盐的性质，能和菌体结合。
分为碱性染料、酸性染料和中性染料三类。
根据细菌个体形态观察的不同要求，可将染色分为三种方法即简单染色、鉴别染色和特殊染色。
革兰氏染色：1884年由丹麦病理学家C.Gram创立。
此法可将所有细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类。
是细菌学上最常用的鉴别染色法，有着重要的理论和实践意义。
其染色过程是先用草酸铵结晶紫进行初染，再加媒染剂-革兰氏碘液，以增加染料和细胞的亲和力，使结晶紫和碘在细胞膜上形成相对分子量较大的复合物，然后用脱色剂-乙醇脱色，最后用沙黄液复染。
凡细菌不被脱色而保留初染剂的颜色（紫色）者即为G+菌，反之，脱色后染上复染剂颜色（红色）者即为G-菌。
其原理是利用细菌的细胞壁组成成分和结构的不同，通过染色加以鉴别。
革兰氏阳性菌的细胞壁肽聚糖层厚，交联而成的肽聚糖网状结构致密，且类脂质含量少，经乙醇处理发生脱水作用后反而使其孔径缩小，通透性降低，结晶紫-碘形成的复合物保留在细胞内而不被脱色，结果细胞呈现紫色。
而革兰氏阴性菌的的肽聚糖层薄，网状结构交联少，而且类脂质含量较高，经乙醇处理后，细胞壁孔径变大，通透性增加，结晶紫与碘的复合物被溶出细胞壁，结果细菌被脱色，再经沙黄复染后呈现红色。
实验三细菌的革兰氏染色(Gram stain)
肽聚糖(peptidoglycan) 肽聚糖
革兰阳性菌肽聚糖—聚糖骨架、四肽侧链、 革兰阳性菌肽聚糖—聚糖骨架、四肽侧链、五肽交联桥
N-乙酰葡糖胺 N-乙酰胞壁酸
溶菌酶作用点
青霉素作用点
肽聚糖(peptidoglycan) 肽聚糖
革兰阴性菌肽聚糖—聚糖骨架、 革兰阴性菌肽聚糖—聚糖骨架、四肽侧链
大肠杆菌革兰氏染色
炭疽芽胞杆菌
五、实验报告
1．结果 ． 列表比较大肠杆菌、 列表比较大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和未知菌 的染色反应，并判断它们分别是G 的染色反应，并判断它们分别是 -或G+. 2．思考题 ． （1）作革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？ ）作革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？ 其染色成败的关键一步是什么？ 其染色成败的关键一步是什么？ （2）当你对一株未知菌进行革兰氏染色时， ）当你对一株未知菌进行革兰氏染色时， 怎样能确证你的染色技术操作正确， 怎样能确证你的染色技术操作正确，结果 可靠？ 可靠？
2．染色
（1）初染：加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟， ）初染：加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟， 水洗。 水洗。 （2）媒染：滴加碘液冲去残水，并覆盖约一 ）媒染：滴加碘液冲去残水， 分钟，水洗。 分钟，水洗。 （3）脱色：将载玻片上面的水甩净，并衬以 ）脱色：将载玻片上面的水甩净， 白背景， 白背景，用95％酒精滴洗至流出酒精刚刚 ％ 不出现紫色时为止， 秒钟， 不出现紫色时为止，约20～30秒钟，立即 ～ 秒钟 用水冲净酒精。 用水冲净酒精。 分钟， （4）复染：用番红液染 ～2分钟，水洗。 ）复染：用番红液染1～ 分钟 水洗。
• 革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料 革兰氏染色需用四种不同的溶液： （basic dye）初染液；媒染剂 ）初染液； ）；脱色剂 （mordant）；脱色剂（decolorising ）；脱色剂（ agent）和复染液（counterstain）。 ）和复染液（ ）。 • 碱性染料初染液 碱性染料初染液——结晶紫（crystal 结晶紫（ 结晶紫 violet） ） • 媒染剂 媒染剂——碘（iodine） 碘 ） • 脱色剂——95％的酒精（ethanol） 脱色剂 ％的酒精（ ） • 复染液 复染液——番红 番红
实验三 细菌的革兰氏染色
五、作业
• 绘图
• 1．革兰氏染色后观察到的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的形态图。
六、思考题
• 1、革兰氏染色成功与否需要注意哪些问题？为什么？ • 2、现有一株菌，个体明显大于大肠杆菌，请你鉴定是革兰氏阳
性菌还是革兰氏阴性菌，如何确定你的染色结果的正确性？ • 3.为什么用老龄菌进行革兰氏染色会造成假阴性？ • 4.你认为革兰氏染色中那个步骤可以省略，在什么情况下可以省
➢2.染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的残水，以免染色 液被稀释而影响染色效果。
➢3.选用幼龄的细菌。G+菌培养12h-16h，E.coli培养24h。若菌龄太老，由于菌体 死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。
Staphylococcus aureus
Escherichia coli Mixture of G+ and G- Bacteria
略？
革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄，脂类含量高，所 以当被脱色处理时，类脂质被乙醇溶解，细胞壁透性增加，使结晶紫 —碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复 染剂的红色。
三、实验材料
1、涂片染色用的细菌培养物 金黄色葡萄球菌、大肠杆菌（对数生长期） 2、染色液和试剂：结晶紫（crystal violet ）、碘液（Gram’s
iodine）、95%酒精、蕃红（safranin ）、香柏油（cedar oil)、擦 镜液 3、器材：废液缸、洗瓶、载玻片、酒精灯、擦镜纸、接种环、镊 子。
四、革兰氏染色的方法和步骤
➢1. 涂片：在载玻片的左、中、右各加一滴蒸馏水，按无菌操作法取菌涂片，左 边涂金黄色葡萄球菌，中间涂混合涂片，右边涂大肠杆菌。
细菌的单染色和革兰氏染色
这是因为稀释度过高，菌数少，误差大；稀释度过低菌数多， 不易得到分散的菌落，也不易数清 计数方法: 每克土壤的菌数=同一稀释度几次重复的菌落平均数 ×5×稀释倍数
表1
样品 菌落类 大小 来源 型
平板菌落特征描述
特征描述 菌落数 边缘情况 （近似值）
形状
颜色
表面情况
表2
稀释 度
细菌 菌落 数 霉菌 菌落 数
土壤中微生物计数结果
10-6 10-7 平均 1 2 平均 1 2 1g样品活 菌数
10-5 1 2 平均
计算结果时，常按下列标准从接种后的3个稀释度中选择一个合适的稀释度，求出每 克菌剂中的含菌数。 （1）同一稀释度各个重复的菌数相差不太悬殊。 （2）细菌、放线菌、酵母菌以每皿30—300个菌落为宜，霉菌以每皿10—100个菌 落为宜。 选择好计数的稀释度后，即可统计在平板上长出的菌落数，统计结果按下式计算。
（二）试管斜面接种
在酒精灯火焰旁操作，将平板上长出的2-3个单菌落无菌操 作，转接到大试管斜面，并贴标签，培养。 点燃酒精灯 左手拿培养皿，打开部分皿盖 右手拿接种环，灼烧灭菌，然后伸入平板中，冷却一会，取 适量菌，取出接种环 左手合上皿盖，放下培养皿，取一支无菌试管斜面
右手拔试管棉塞，管口过火
右手将接种环伸入到试管中，在斜面上轻轻划线接种，取出 接种环再次灼烧灭菌，塞上试管棉塞。
2. 初染：在做好的涂面上滴加草酸铵结晶 紫染液，染1min，倾去染液，流水冲洗至 无紫色。 3. 媒染：先用新配的路哥氏碘液冲去残水， 而后用其覆盖涂面1min，后水洗。 4. 脱色：除去残水后，滴加95%酒精进行 脱色约30s，后立即用流水冲洗。 5. 复染：滴加番红染色液，染1-2min，水 洗后用吸水纸吸干。
实验三 革兰氏染色法
三、实验器材及试剂
• 枯草芽孢杆菌、大肠杆菌 18～24h 培养 物 • 革兰染色液一套（草酸铵结晶紫染液、卢 戈碘液、95%乙醇、番红染液） • 酒精灯，玻片，接种环，吸水纸，香柏油， 二甲苯，显微镜。
五、注意事项
5、染色时注意看清染料名称，按序进行、滴加染料 以能覆盖涂片为度不宜过多，要掌握好染色时间， 尤其是酒精脱色时间，不宜过长或过短。染色中除 脱色时摇动玻片外均要端平玻片或将其静放台面上。 染色过程中，不可使染液干枯。
6、水洗切勿先倒去染料，而是用较小水流冲洗在玻 片一端，用水流将它们缓缓带走，避免直接冲洗菌 膜处，要切忌将未经火焰固定的标本染色水洗。
④复染：加番红染液1～2滴于标本面上，染1min， 水洗后吸干。
四、实验步骤
5、镜检 用毛边纸或滤纸轻轻吸干(珍贵标本应自然干燥)，
待标本充分干燥后加油，用油镜观察并判断细菌的 染色结果。
6、实验后处理 用二甲苯擦油镜镜头后用擦镜纸擦干，整理、
清洁显微镜，把显微镜放回原处，把标本片放入消 毒缸中消毒5min后清洗。
四、实验步骤
2、干燥 将涂片放空气中自然干燥，或在离火焰较远处
烘干，切勿高温烘烤，因温度太高会破坏菌体形态。
3、固定 手持载玻片一端，将涂片在火焰外焰上连续通
过 3 个来回，每个来回约1s， 就可固定标本，直 到手背试触涂片反面热而不烫为宜。
四、实验步骤
4、染色
①初染：滴加结晶紫染液1～2滴于标本面上，染色 1min，轻轻水洗，甩干； ②媒染：滴加卢戈碘液1～2滴于标本面上，染色 1min，轻轻水洗，甩干； ③脱色：滴加95％酒精1～2滴于标本面上， 频频倾 动玻片， 直到不再溶下染料为止， 约30s， 视标本 片材料厚薄而增减时间，然后水洗，甩干；
实验三革兰氏染色
革兰氏染色– 染色
6 镜检 干燥后，用油镜观察。蓝紫色为G+,红色为G-。 7 混合涂片染色 将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作混合涂片、染色、镜检进行 比较。
Procedures of Gram Staining
Gram positive or Gram negative?
实验报告
1．绘图说明经革兰氏染色后大肠肝菌和金黄色葡萄球 菌的染色结果。
细菌的等电点较低，pH值大约在2—5之间，故在中性、碱性或弱酸 性溶液中，菌体蛋白质电离后带负电荷；而碱性染料电离时染料离子带 正电。因此，带阴电的细菌常和带阳电的碱性染料进行结合。所以，在 细菌学上常用碱性染料进行染色。
2 染色方法
微生物染色方法一般分为单染色法和复染色法两种。前者用一种染 料使微生物染色，但不能鉴别微生物。复染色法是用两种或两种以上染 料，有协助鉴别微生物的作用，故亦称鉴别染色法。常用的复染色法有 革兰氏染色法和抗酸性染色法，此外还有鉴别细胞各部分结构的（如芽 胞、鞭毛、细胞核等）特殊染色法。
革兰氏染色– 制片
A.ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ加小滴水
B. 涂成薄层
C. 固定菌体
2 初染 滴加结晶紫（以刚好将菌膜覆盖为宜）,染色1－2 min，水洗。 3 媒染 用碘液冲去残水，并用碘液覆盖菌膜约1min，水洗。 4 脱色 用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，用滴管流加95％的乙 醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。脱色时间一般 液20－30 S。脱色不足与过度都会影响和改变染色的结果。 5 复染 用番红液复染约2min，水洗。
实验三 细菌的单染色与革兰氏 染色法
1 微生物染色的基本原理
微生物染色的基本原理，是借助物理因素和化学因素的作用而进 行的。物理因素如细胞及细胞物质对染料的毛细现象、渗透、吸附作 用等。化学因素则是根据细胞物质和染料的不同性质而发生的各种化 学反应。酸性物质对于碱性染料较易吸附，且吸附作用稳固；同样， 碱性物质对酸性染料较易于吸附。如酸性物质细胞核对于碱性染料就 有化学亲和力，易于吸附。
实验三简单染色法和革兰氏染色法
实验三简单染色法和革兰氏染色法实验三简单染色法和革兰氏染色法（一）细菌的简单染色法1实验目的1.1熟悉普通光学显微镜的构造及各部分的功能1.2学习微生物涂片、染色的基本技术1.3掌握细菌的简单染色法1.4初步认识细菌的形态特征，学习油镜的使用方法和无菌操作技术2 实验原理细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。
细菌的细胞小而透明，在普通的光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色。
利用单一染料对细菌进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。
此法操作简单，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。
用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。
一般使用碱性染料进行简单染色。
碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。
因细菌蛋电质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。
经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。
常用作简单染色的燃料有美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等。
酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。
当细菌分解糖类产酸使培养基pH值下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。
染色前必须固定细菌，其目的有二：一是杀死细菌并使菌体黏附于玻片上；二是增加对染料的亲和力。
常用的有加热和化学固定两种方法。
固定时尽量维持细胞原有的形态。
3实验材料3.1菌种金黄色葡萄球菌约18h营养琼脂斜面培养物，大肠杆菌24h营养琼脂斜面培养物。
3.2染色剂草酸铵结晶紫染液，番红染液。
3.3仪器或其他用具显微镜、擦镜纸、接种环、酒精灯、载玻片、吸水纸、无菌牙签等。
4 流程涂片干燥固定染色水洗干燥镜检5 步骤5.1涂片在洁净无脂的载玻片中央滴一小滴生理盐水或无菌蒸馏水，用无菌操作方法从菌种斜面挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成薄膜，涂布面积约1～1.5cm2。
实验三 细菌的简单染色和革兰氏染色
实验三 细菌的简单染色和革兰氏染色一、目的与要求1、掌握细菌涂片标本的制备2、掌握革兰氏染色法的步骤和关键点3、识别细菌革兰氏染色结果二、实验原理：细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。
为什么要对细菌染色？细菌的细胞小而透明，在普通光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。
用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。
简单染色法可用以观察微生物的形状、大小及细胞排列状态，是微生物技术中应用广泛，操作简便的染色法。
革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌(G )和革兰氏阴性菌(G-)两大类，是细菌学上最常用的鉴别性染色法。
其原理是利用细菌的细胞壁组成成分和结构的不同。
革兰氏阳性菌的细胞壁肽聚糖层厚，交联而成的肽聚糖网状结构致密，经乙醇处理发生脱水作用，使孔径缩小，通透性降低，结晶紫与碘形成的大分子复合物保留在细胞壁内使细胞呈蓝紫色，而革兰氏阴性菌肽聚糖层薄，网状结构交联少，且类脂含量较高，经乙醇处理后，类脂被溶解，细胞壁孔径变大，通透性增加，结晶紫与碘的复合物被溶出细胞壁，再经番红复染后细胞呈红色。
三、实验器材1、菌种 牛肉膏琼脂斜面28℃培养24h 的大肠杆菌(Escherichia coli)斜面菌种，牛肉膏琼脂斜面28℃培养16h 的枯草杆菌(Bacillus subtilis)斜面菌种；2、仪器 显微镜；3、材料 载玻片，香柏油，二甲苯，擦镜纸，吸水纸，染色缸等。
4、染料 草酸铵结晶紫染色液，路哥氏(Lugol)碘液，95%乙醇，0.5%番红染色液； 细菌的简单染色步骤：细菌的革兰氏染色步骤：涂 片,干 燥,固 定,结晶紫染色,水洗,碘液媒染,水 洗,乙醇脱色,水 洗,番红复染,水 洗,干 燥,镜 检.五、实验关键步骤和注意点：1、玻片要洁净无油，否则菌液涂不开。
2、挑菌量宜少，涂片宜薄，过厚则不易观察。
实验三革兰氏染色法
1
革兰氏染色法 （GRAM STAINING）
细菌微小、半透明，在普通
Hans Christian Gram
光学显微镜下不易识别。 将细菌染色，增加反差，便 于观察。 革兰氏染色法是细菌学中广 泛使用的一种鉴别染色法。 革兰染色在临床上有助于细 菌致病性分析及抗菌药物选 择。
4
实验步骤
染色标本制备
涂片
干燥
固定
染色
镜检
5
染色标本制备
标记：在载玻片上背面画两个圆形区域
并作标记
涂片：用接种环各加1环生理盐水，用灭
菌接种环挑取少量菌与玻片上的生理盐
水充分混匀
干燥：涂好的菌膜在室温下自然干燥。 固定：手持载玻片的一端，菌膜面向上，
在火焰最热部分迅速通过3次
6
• 滴加结晶紫覆盖菌膜，1min，流水 冲洗 初染
2
革兰染色法可基于细菌细胞壁成分和结构的不同，将 细菌分为革兰阳性菌 （G+）和革兰阴性菌 （G－）
革兰染液 第一液（初染液）： 结晶紫染液 第二液（媒染液）： 卢戈碘液 第三液（脱色液）： 95%酒精 第四液（复染液）： 石炭酸复红液
3
实验材料
菌种：表皮葡萄球菌 （SE） 大肠埃希菌 （E.coli） 器材：载玻片、生理盐水、接种环、 酒精灯、染色架 革兰染液
8
革兰染色的注意事项
水洗时，不要直接冲洗涂面，而应使水从载玻片的一端
流下，水流不宜过急，以免涂片薄膜脱落。
选用培养18-24小时菌龄的细菌为宜，若细菌太老，由
于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。
酒精脱色是革兰染色的关键，要掌握好脱色的时间。
实验三 细菌形态观察和革兰氏染色技术
⑥ 复染：
已经脱色处理的细胞或其结构常以复染液作复染 以便于观察。 复染液与初染液的颜色不同而成鲜明对比，所以 复染也称为对比染色。 复染液不宜太强，以免掩盖初染的颜色而失去对 比作用。
用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫。 媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和力或附着力，
即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落。
不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不
能，脱色剂常用95％的酒精。
复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染 的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未 被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，常用的复染液是番红。
三、结果:
② 固定：
染色前必须先行固定。其目的在于凝固细胞质和 其它细胞结构成分而杀死细菌；使菌体粘附于玻 片上以及改变细菌对染料的通透性（因活菌通常 不易使染料透入细胞内）。
固定的方法一般采用火焰加热法，在特殊目的时 也可用冷冻干燥法或化学法如醇、酸、氯化高汞 、重金属盐或氧化剂等进行固定。
③ 媒染：
① 涂片制备：
随标本的种类而略有不同。
• 若为液体培养液，亦可直接涂于载玻片上；
• 若为固体培养基上的细菌，则先取一接种环生理盐水于载玻片中 央，然后从培养基上取菌少许，在盐水中研磨均匀，使呈轻度乳 浊，以接种环扩成1cm2或2份硬币大小的涂面。
在室温下自然干燥或放在火焰上方的热空气中慢 慢烘干。但切忌紧靠火焰烤干。
⑤ 脱色：
脱色：是使被染物脱去已染上的颜色。脱色的目 的是观察细菌与染料结合的稳定程度，故可作为 鉴别染色之用。
凡具有脱色作用的化学试剂称脱色剂。脱色剂或 呈溶媒作用，如醇类、丙酮等；或能影响蛋白质 的电离程度，改变其电荷性质或数量，因而影响 细菌与染料的结合程度，如酸类能减少细菌的负 电荷，故可作碱性染料的脱色剂。
实验三细菌的革兰氏染色及显微镜油镜的使用
实验三细菌的革兰氏染色及显微镜油镜的使用实验三细菌的革兰氏染色及显微镜油镜的使用革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，1884 年由丹麦医师Gram创立。
显微镜各接物镜的放大率可由其外形辨认，镜头长度越大，镜片直径越小，放大倍数大 ; 反之，放大倍数小。
油镜头长低、高倍镜，镜头下缘一般刻有一圈黑线或白线，并刻有100×等字样。
细菌体积微小，在细菌的形态学研究中，经常需要借助显微镜油镜，才能比较清楚地进行观察。
实验目的 : 掌握革兰氏染色的方法与油镜的使用方法染色原理 :通过结晶紫初染和碘液媒染后，在内形成了不溶于水的结细胞壁晶紫与碘的复合物。
G，菌 : 细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，故保留结晶紫- 碘复合物在细胞膜上。
呈紫色。
Gˉ菌 : 肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高, 乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫- 碘复合物溶出细胞，番红复染后呈红色。
油镜的使用原理 : 油镜的透镜很小，光线通过玻片与油镜头之间的空气时，因介质密度不同，发生折射或全反射，使射入透镜的光线减少，物象显现不清。
若在油镜与载玻片之间加入和玻璃折射率(n=1.52) 相近的香柏油 (n=1.515) ，则使进入透镜的光线增多，视野亮度增强，使物象明亮清晰。
实验器材 : 大肠杆菌、枯草杆菌、染液、香柏油、二甲苯、显微镜等染色步骤1、涂片 :2、干燥 : 自然3、固定 : 首先玻片要洗干净，然后在中间滴一滴菌液，涂匀，自然晾干，注意不要用火烤 ( 变形 ) 。
干后方法是，快速在酒精灯上过3， 4 次固定，要使有菌的一面向上。
4、结晶盖涂面染 1 分钟。
5、水洗。
6、加碘液覆盖涂面媒染约 1 分钟。
7、水洗。
8、滴加 95%酒精进行脱色， 20 秒，马上水洗。
9、番红染液覆盖涂面 1 分钟。
10、水冲。
11、干燥，油镜观察。
注意事项 :1、涂片不能过厚，以便于观察;2、菌龄要适宜，枯草杆菌培养约18h, 大肠杆菌 24h。
实验三细菌的革兰氏染色及芽孢染色法-文档资料
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（三）实验器材
n
1、活材料：
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革兰氏染色：培养12h-16h枯草杆菌（Bacillus subtilis）和培养 24h大肠杆菌（ Evaluation only. Escherichia coli） n 芽孢染色：培养36 小时 的苏云金杆菌（Bacillus with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2 thuringiensis）或者枯草杆菌（Bacillus subtilis）
该染色法所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由 这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。 G—菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂 Evaluation only. ted with 质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或 Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2 丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透 Copyright 2019-2019 Aspose Pty Ltd. 性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结 果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。G+ 菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量 少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小， 通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。
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实验三细菌革兰氏染色法
【目的要求】了解革兰氏染色原理；掌握革兰氏染色的方法。
【基本原理】
革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，1884 年由丹麦医师Gram 创立。
未经染色之细菌，由于其与周围环境折光率差别甚小，故在显微镜下极难观察。
染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，而用以分类鉴定。
革兰氏染色法可将细菌分成革兰氏阳性（G+）和革兰氏阴性（G-）
两种类型，细菌对革兰氏染色的不同反应是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。
革兰氏染色的主要步骤包括初染、媒染、脱色和复染。
首先利用草酸铵结晶紫初染，所有细菌都会着上结晶紫的蓝紫色。
然后利用卢戈氏碘液作为媒染剂处理，由于碘与结晶紫形成碘-结晶紫复合物，增强了染料在菌体中的滞留能力。
之后用95%乙醇作为脱色剂进行处理时，两种细菌的脱色效果不同。
革兰氏阳性细菌细胞壁肽聚糖含量高，壁厚且脂质含量低，肽聚糖本身并不结合染料，但其所具有的网孔结构可以滞留碘-结晶紫复合物，现在一般认为乙醇处理可以使肽聚糖网孔收缩而使碘-结晶紫复合物滞留在细胞壁，菌体保持原有的蓝紫色。
而革兰氏阴性细菌细胞壁肽聚糖含量低，交联度低，壁薄且脂质含量高，乙醇处理时脂质溶解，细胞壁通透性增加，原先滞留在细胞壁中的碘-结晶紫复合物容易被洗脱下来，菌体变为无色。
而在最后用复染步骤（染色剂为番红），染色后变为复染剂颜色（红）。
【实验器材】
1.革兰氏染色液：
①草酸铵结晶紫
甲液：结晶紫（2 g）、乙醇（95%）（20 mL）;
乙液：草酸铵（0.8 g）、蒸馏水（0.8 mL）;
将甲、乙两液混合，静置48h 后使用，该染液稳定，在不透气的棕色瓶中可存储数月。
②卢戈氏碘液
碘（1 g）；碘化钾（2 g）；蒸馏水（300 mL）
先将KI溶于少量（3-5 mL）蒸馏水中，再放入碘，待碘全溶后，加水至300 mL。
此液稳定，可在不透气的棕色瓶中保存数月。
③脱色液：95%乙醇
④复染液：即2.5%蕃红（沙黄）水溶液。
沙黄（2.5 g）; 95%的酒精（10 mL）；蒸馏水（90 mL）
将沙黄溶于乙醇中，再用蒸馏水稀释。
2.显微镜、灭菌玻片、灭菌牙签、酒精灯、擦镜纸、计时器。
【操作步骤】
1涂片：取灭过菌的载玻片于实验台上，从平板上挑取待观测菌落于在载玻片的中央，用滴
管滴取蒸馏水一滴，用灭菌后的牙签将菌落与液滴混合物涂布成一均匀的薄层，涂布面不宜过大。
2干燥：将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。
3固定：固定常常利用高温，手持载玻片的一端，标本向上，在酒精灯火焰处尽快的来回通过2-3 次，共约2-3 秒种，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，不觉过烫为宜（不超过60C）,放置待冷后，进行染色。
4初染：在涂片薄膜上滴加草酸铵结晶紫1-2 滴，使染色液覆盖涂片，染色约
1min 。
5水洗：斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。
6媒染：用100-1000』移液枪吸取约300ul碘液滴在涂片薄膜上，使染色液覆盖涂片，染色约1min。
7水洗：斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。
8脱色：斜置载玻片，滴加95%乙醇脱色，至流出的乙醇不现紫色为止，大约需时20-30s，随即水洗。
9复染：在涂片薄膜上滴加蕃红染液1-2 滴，使染色液覆盖涂片，染色约1-2 min。
10水洗：斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。
11干燥、观察：用吸水纸吸掉水滴，待标本片干后置显微镜下，用低倍镜观察，发现目的物
后滴一滴浸油在玻片上，用油镜观察细菌的形态及颜色，紫色的是革兰氏阳性菌，红色的
是革兰氏阴性菌。
【实验结果】
1.绘出油镜下观察的混合区菌体图像。
注意标明革兰氏染色结果（紫或红），并判定所挑取菌落的革兰氏阴阳性。
2.观测单个细菌形状。
【思考题】
1.革兰氏染色时需要注意哪些问题，为什么？
2.你认为革兰氏染色法中哪个步骤可以省略？在何种情况下可以省略？。