第九章核酸的分离与提纯优秀课件

DNA片段的回收 4、质量评估
1） 凝胶电泳 2）光密度值测定 3）限制酶切分析
特定
第二节 核酸制备的基本方法
核酸制备的步骤
（1）抽提组织或细胞的破碎、消融。 – 抽提核酸必须事先将生物材料破碎或消融， 这关系到核酸回收率的高低。 – 破碎与消融组织细胞，通常有使用匀浆器、 捣碎器的机械方法以及温和的反复冻融法， 使用表面活性剂或各种酶处理的方法。
第九章核酸的分离与提纯
第一节 核酸制备的基本原理
核酸的种类
脱氧核糖核酸（DNA）：细胞核，单链或双链
核糖体RNA
核糖核酸（RNA） 转运RNA 信使RNA
细胞质， 单链或双链
但无论哪核酸，在生物体中一般以核蛋白的形式存在， 因此，为了提取制备核酸，必须将核蛋白解联（即利
用接联剂将核蛋白裂解为核酸和蛋白）并去除蛋白， 同时必须维持核酸的天然性状，不使核酸发生变性或
(2)组织捣碎器法
是一种剧烈的破碎细胞的方法。 捣碎器(8 000-10 000 r/min)处理30～45s，植物和
动物细胞能完全破碎。 若用它破碎酵母菌和细菌的细胞，则需加入石英砂方
才有效。 在捣碎期间必须保持低温，以防温度升高引起有效成
分变性，同时捣碎的时间不宜太长。
(3)超声波法
降解， 操作上尽量简化操作步骤，缩短操作时间，以减少各
种不利因素对核酸的破坏，同时要求去蛋白迅速彻底。 为了保证分离核酸的完整性及纯度，在实验过程中，
应注意以下条件和要求：
（1）尽量避免化学因素对核酸的降解 – 过酸或过碱以及其他化学因素将破坏多聚 核苷酸链的磷酸二酯键，使核酸降解； – 核酸（特别是RNA）在碱性溶液中十分容 易降解. – 因此抽提介质的pH常以5.5-9.0为宜。
分离总RNA
分离细胞器DNA RNA poly(A)RNA 特异DNA
感染或转染细胞（病毒型） 转化细菌细胞（质粒型）
分离病毒颗粒
培养转化细胞、收集菌体
病毒载体DNA分离与纯化
破碎细胞
质粒DNA分离与纯化
3、DNA片段的分离 DNA 限制酶切 凝胶电泳分离
（2）减少物理因素对核酸的降解 – 物理因素主要是机械剪切力，包括强烈震荡、搅拌、 细胞突然置于低渗溶液中，以及让溶液快速通过狭 长的孔道； – 其次是冻融、高温煮沸和辐射等，均将导致核酸的 降解。 – 机械剪切力主要破坏大分子量的线性DNA分子，而 对分子量小的环状质粒DNA及RNA分子，破坏相 对较小。
4．生物酶降解
生物酶有降解细菌细胞壁的功能。 在用此法处理细菌细胞时，先是细胞壁
生物降解是RNA提取过程的主要危害，储存的 RNA制品也不例外，因此，为了抑制核酸酶的 活性，一般在低温下（4℃或0℃，甚至-20 ℃ 左右）进行。
进行核酸分离时最好用新鲜生物组织或细胞样 品，若不能马上进行提取，应将材料置液氮中 或-80 ℃冰箱保存。
分离纯化核酸总的原则
一是应保证核酸一级结构的完整性，这是研究核酸结构 与功能的最基本要求；
是借助声波的振动力破碎细胞壁和细胞器的有效方法。 由于细菌的外部有一层细胞壁，破壁较为困难，因此
用超声波处理细菌和酵母的时问要长一点。有些菌体 破碎需要5～l0min或更长，如果在细胞浮液中加石英 砂则可缩短时间。 为了防止电器长时间运转产生过多的热量，常采用间 歇处理和降低温度的方法进行。
(4)压榨法
是一种温和、彻底破碎细胞的方法。 即用高压迫使几十毫升细胞悬液通过一个小于
细胞直径的小孔，致使细胞被挤压破碎。
2．溶胀和自溶
(1)溶胀
概念：在低渗溶液，如低浓度的稀盐溶液中，由于存 在渗透压差，溶剂分子将大量进入细胞，致使细胞膜 膨胀破裂的现象称为溶胀。
步骤：将细胞置低温下冰冻一定时间，然后取出至室 温下(或40℃左右)迅速融解。如此反复冻融多次，细 胞可在形成生物降解
细胞内外各种核酸酶可作用于磷酸二酯键，直接破坏核酸 的一级结构，使其降解；
DNA酶需要Mg 2+、Ca 2+的激活，因此实验中常加入 EDTA、柠檬酸盐，以络合核酸酶作用时所必需的Mg 2+离 子，以抑制DNA酶的活性；
制备RNA则需克服核糖核酸酶（RNase）的降解作用。因 为RNase不但分布广泛，极易污染，而且耐高温，即使加 热到蛋白变性， Rnase的活力也不会完全丧失，且具有惊 人的回复力，而细胞内的核蛋白又总是和它联在一起，若 去除不彻底，它将部分恢复活力，导致RNA降解。
(1)机械碾碎 – 对于动物组织(如鼠肝、兔肝等)，一般多采用匀浆的 方法。即将组织剪碎置研钵中，研碎。 – 为了提高研磨效果，可加入一定量的石英砂。但要注 意石英砂对有效成分的吸附作用。 – 用匀浆器处理，也能把动物细胞破碎，此法较温和， 适于实验室应用。 – 若需大规模生产，则可用电动研磨法，酵母、植物组 织的细胞破碎也可用此法。
(2)自溶
概念：细胞结构在本身所具有的各种水解酶作 用下，发生溶解的现象称为自溶。
注意：应用此法时要特别小心操作，因为水解 酶不仅可破坏细胞壁、细胞膜，同时也可使某 些有效成分在自溶时分解。
3．化学处理
用脂溶性的溶剂(如丙酮、氯仿、甲苯等) 或表面活性剂(如十二烷基硫酸钠)处理细 胞时，可使细胞壁和细胞膜的结构部分 溶解，导致整个细胞破碎。
二是要排除蛋白质、脂类、糖类等其他物质的污染。 – 纯化的样品不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂或过 高浓度的金属离子； – 蛋白质、脂类、糖类等的污染应降低到最低程度； – 无其他核酸的污染，如提取DNA时，应去除RNA。
一般程序
1、供体的核酸分离
供体细胞培养
收集(菌体)细胞
细胞破碎
分离总DNA 分离细胞器
（2）抽提核酸，去除与核酸结合的蛋白质、 多糖、脂类，去除盐、有机溶剂等杂质，以 及去除其他不需要的核酸分子；
（3）核酸的精制纯化。
一、细胞的破碎
一般动物组织的细胞膜较脆弱，易破碎，而植 物和微生物的细胞比较牢固。
细胞破碎的方法很多，可根据组织特性和核酸 分离目的加以选择。
1．物理方法