免疫标记技术及分析应用

金免疫技术 检测金颗粒沉淀
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免疫标记技术
用标记物标记抗体或抗原进行抗原抗体反应借以提高免
疫学诊断的敏感性
放 125I射、性131同I 位素：酶：碱辣性根磷过酸氧酶化物酶、
荧光素 ：异硫氰酸荧光素（黄绿 色荧光）、藻红蛋白、 罗丹明 （红色荧光）
放射免疫检测法（RIA） 酶免疫检测法（EIA） 免疫荧光检测法（IFA）
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直接法
Leabharlann Baidu间接法
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（2）间接荧光染色法
将荧光素标记在第二抗体（抗抗体） 上或标记在SPA上，检测与抗原结合的特 异性抗体。
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直接法
间接法
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（3）补体荧光染色法
将荧光素标记在补体的抗体上（抗C3 抗体），检测抗原抗体复合物。
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优点：可检测所有的抗原抗体系统， 具通用性；敏感性高。
双位一点法
其他标记技术
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Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
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三、酶标记物的纯化及鉴定 1、纯化 游离酶：增加非特异染色 游离抗原（抗体）：竞争降低特异性染色
葡聚糖凝胶层析法 50%饱和硫酸铵沉淀提纯法
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2、鉴定 免疫活性鉴定：免疫电泳/双扩/ELISA 酶标记率测定：分光光度法
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四、酶标仪（酶联免疫检测仪）
比色 测定波长、吸光度范围、光学系统、检测
速度、震板功能、温度控制、定性和定量 的软件，自动洗板、温育、加样 450nm、492nm、620nm、630nm、650nm、 405nm
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返回
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免疫标记技术
放射物标记技术
酶标技术
免疫荧光技术
ELISA 酶联免疫吸附技术 酶免疫组化技术
双抗体夹心法
竞争法
双抗原夹心法
间接法
光度计 特异、敏感 可以在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或
抗体的所在部位，或在µg、甚至ng水平 上对其进行定量。
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将酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合， 酶标记抗体可与存在于组织细胞或吸附于固相 载体上的抗原或抗体发生特异性结合。
滴加底物溶液后，底物可在酶作用下催化 底物水解、氧化或还原等反应，产生有颜色的 物质。酶降解底物的量与呈现的颜色成正比。
第七章 免疫标记技术及分析应用
第一节 免疫标记技术 第二节 免疫荧光技术 第三节 免疫酶技术 第四节 放射免疫技术 第五节 免疫胶体金标记技术
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第一节 免疫标记技术
用荧光素、放射性同位素、酶、发光剂、 胶体金或电子致密物质等作为示踪剂，标记 抗体或抗原进行的抗原抗体反应。
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荧光显微镜，射线测量仪，酶标检测仪，电 子显微镜和发光免疫测定仪等精密仪器，对 实验结果直接镜检观察或进行自动化测定。
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缺点： 标记反应较难掌握，在操作
过程中容易引起酶、抗原或抗体 的失活。
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一、常用的酶及其底物
酶活性高；具有抗原抗体共价结合的基团；标记
后不影响酶活性及抗原、抗体反应性；产物易判
定或测定；酶活性不受样品中其他成分的影响
常（用用酶于均相测定底的物酶标抗原与抗显体色结合后酶活性 辣出根现过抑氧制化或物激酶 活邻）四苯；甲二基无胺联害、苯；H胺2稳O、2定H，2O2价橙廉蓝黄、色色易得。
液相（ELISA）、固相（免疫组化技术）
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第二节
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将抗体或抗原标记以荧光素，然后与 相应抗原或抗体结合，形成的免疫复合物 在一定波长光的激发下可产生荧光，借助 荧光检测仪测定或定位被检抗原或抗体。
当出现荧光时，表明标记抗体存在， 相应的抗原也存在。
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抗体的荧光素标记
FITC 异硫氰酸荧光素
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优点： ①灵敏度高，特异性强； ②可定性、定量检测可溶性抗原和抗体，适用于 普查； ③试剂来源广，稳定，保存时间长，且无同位素 污染； ④结果可肉眼半定量，也可用仪器定量检测，且 仪器价格较低廉，可在大多数实验室开展； ⑤操作简便，易于掌握和使用，且重复性好； ⑥可用于定位组织细胞上的抗原或抗体成分。
碱性磷酸酶
对硝基苯磷酸酯
黄色
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二、 标记方法 酶结合物
技术简单、产率高；不影响酶和抗体（抗 原）的生物活性；所得酶标记物稳定；较 少形成酶与酶、抗体与抗体、抗原与抗原 的聚合物。
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戊二醛交联法：抗原-戊二醛-酶
改良过碘酸钠标记法：过碘酸钠氧化酶的羟
基为醛基，再与抗体蛋白的氨基结合。HRPCH2-NH-IgG
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免疫标记技术
分类：免疫酶技术(ng)、放射免疫技术(pg)、免疫荧
光技术、免疫电镜技术、免疫胶体金技术、发光免 疫测定。
特点：高度灵敏、特异、快速，定性、定量、定位
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免疫标记技术
反应类型
实验技术
结果判断
标记免疫反应 荧光免疫技术 检测荧光现象
放射免疫技术 检测放射性强度
酶免疫技术 检测酶底物显色 发光免疫技术 检测发光强度
缺点：操作流程长、干扰因素多、 非特异性荧光多，补体易失活、需 新鲜制备不方便。
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第三节
Enzyme Immunoassay（EIA）
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就是将抗原和抗体的特异性免 疫反应与酶的催化反应相结合 而建立的一种免疫检测技术。
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抗原抗体反应＋酶催化反应 肉眼、光学显微镜、电子显微镜、分光
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常 用 的 荧 光 素
返
回
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荧光抗体的纯化
❖去除游离荧光素及其降解产物：透析或凝胶过 滤 ❖去除荧光素未结合和结合过度的抗体：阴离子 交换层析法 ❖去除交叉反应或非期望抗体：动物肝粉吸收或 固相抗原吸收
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荧光检测仪
（1）荧光显微镜 （2）荧光分光光度计 （3）流式细胞仪 （4）荧光偏振光分析仪
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荧光显微镜
利用一定波长的激发 光对样品进行激发，产 生一定波长的荧光，对 样品结构或其组分进行 定性、定位、定量观察 检测。
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荧光显微镜的种类
透射式
落射式
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荧光显微镜的构造
吸收滤色镜 激发滤色镜
分色镜
汞灯
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流式细胞仪
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荧光酶标仪
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（1）直接荧光染色法
将荧光素标记在特异性抗体上，直接检 测抗原。 优点：简单、快速、特异性高。 缺点：敏感性差。
❖标记原理：利用抗体蛋白的自由氨基与FITC的异硫 氰基在碱性溶液中形成硫碳酰胺键，使抗体与FITC结 合成荧光抗体。 ❖标记方法:
搅拌法：适于标记体积较大、蛋白含量较高的抗体。 标记时间短，荧光素用量少，但有非特异性染色。
透析法：适于标记样品量少，蛋白含量低的抗体。 标记比较匀， 非特异染色较低。