谷胱甘肽 S-转移酶(glutathione S-transferase ,GST)活性测定试剂盒使用说明

谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferase，GST）活性测定试剂盒使用说明货号：SN101

规格：50管/48样

产品简介：

谷胱甘肽S-转硫酶（GST）是一种具有多种生理功能的蛋白质家族，主要存在于细胞质内。GST是体内解毒酶系统的重要组成部分，主要催化各种化学物质及其代谢产物与谷胱甘肽巯基的共价结合，使亲电化合物变为亲水物质，易于从胆汁或尿液中排泄，达到将体内各种潜在或具备毒性的物质降解并排出体外的目的。因此，GST在保护细胞免受亲电子化合物的损伤中发挥着重要的生物学功能。此外，因为GST具有GSH-Px活性，亦称为non-SeGSH-Px，具有修复氧化破坏的大分子如DNA、蛋白质等的功能。

GST催化GSH与CDNB结合，其结合产物的光吸收峰波长为340nm，通过测定340nm波长处吸光度上升速率，即可计算出GST活性。

试验中所需的仪器和试剂：

紫外-可见分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调节移液器、1ml石英比色皿、双蒸水

产品内容：

试剂一：试剂一×1支，用前充分溶解于100ml双蒸水中，4℃保存3个月

试剂二：粉剂二×1支；稀释液二×1管，用前将稀释液二加入粉剂二中充分溶解后加双蒸水至 5.0ml，4℃保存3个月

试剂三：粉剂三×1支，4℃保存3个月，临用前加试剂一 5.0ml充分溶解，临用前配制。

操作步骤：

一、样品测定的准备：

称约0.1g组织，加入1ml试剂一，冰上充分研磨，10000rpm4℃离心10min，取上清(如上清不清澈，再离心3min)。

二、GST测定操作

1、混合试剂配制：将试剂二与试剂一按1：8混合

2、试剂三放在25℃预温

3、分光光度计调到340nm处，设定时间为5min，用双蒸水调零

4、取0.1ml样品与0.9ml混合液混合，于25℃预温5min，再加入试剂三0.1ml，迅速混匀，于340nm处测定5min内吸光值的变化,第0s的吸光值记为A1，第300s的吸光值记为A2

5、空白管测定为操作4中以0.1ml试剂一代替0.1ml样品液

酶活计算：

一、血液GST活性计算

1、GST活力单位定义：在25℃下，每ml血液每分钟催化1μmol/L CDNB与GSH结合的GST酶量为U。

2、计算公式：

GST（U/ml）=ΔA340/min×〔106/(ε·d)〕×（V总/V样）=ΔA/min×106/(9.6×103×1)〕×1.1/0.1=ΔA340/min×1145.83

△A340=△A测定管-△A空白管，△A测定管与△A空白管均等于（A2-A1）/5，即每分钟吸光值变化3mol/L•cm

ε：产物在340nm处摩尔吸光系数为9.6×103mol/L•cm

106：摩尔分子换算成微摩尔分子

d：比色杯光径（cm）

V总：反应总体积（ml）

V样：所用样品体积（ml）

二、组织GST活性计算

1、GST活力单位定义：在25℃下，每毫克蛋白每分钟催化1μmol/L CDNB与GSH结合的GST酶量为1U。

2、计算公式：

GST（U/mg）=△A340/min×[106/(ε•d)]×(V总/V样)÷Cpr=△A340/min×106/(9.6×103×1)×1.1/0.1÷Cpr=△A340/min×1145.83÷Cpr

△A340=△A测定管-△A空白管，△A测定管与△A空白管均等于（A2-A1）/5，即每分钟吸光值变化

ε：产物在340nm处摩尔吸光系数为9.6×103mol/L•cm

106：摩尔分子换算成微摩尔分子

d：比色杯光径（cm）

V总：反应总体积（ml）

V样：所用样品体积（ml）

Cpr：蛋白浓度（mg/ml）

注意事项：

a)样品处理等过程均需要在冰上进行，且须在当日测定酶活力

b)本法测定GST活性的线性范围可达76U/L，测定前先用1～2个样做预实验，如5min 内反应不成线性，须对样品做相应稀释，稀释时用样品提取液稀释，计算结果乘以稀释倍数。

c)测定反映的温度对测定结果有影响，请控制在25℃

不同测定材料中GST酶液提取的注意事项

哺乳动物溶血液的配制：

①取肝素抗凝全血(人)20μL，以蒸馏水稀释至1mL，配成1：49的溶血液；取肝素抗凝全血(鼠)10μL加蒸馏水至1mL，配成1：99的溶血液。

②充分混匀，放置5分钟直至使玻璃管中的溶血液对光呈完全透明状，方可进行检测。

③已配好的溶血液中酶活力只能保持45-60分钟，天冷时可延迟至120分钟。如果当天来不及测定则以抗凝全血冰箱（4-8℃）保存，2-3天内酶活力变化不大。

哺乳动物组织中GST的提取：由于哺乳动物组织中酶活力较大，为保证灵敏度，要注意用试剂一将酶提取液进行稀释，肝脏稀释50倍左右，肾脏稀释20倍左右。计算酶活力时乘以相应稀释倍数。

细胞处理：收集约2×104个细胞，冷冻干燥后，加入1mL试剂一。超声破壁细胞(950 W，30%，15min，工作1s间隔2s)，再经1,0000r4℃高速离心10min，上清待测。

其它步骤按照试剂盒说明书操作即可。