分子克隆详细步骤

分子克隆步骤：

一、贴壁细胞总RNA提取：

1、吸掉培养液，用PBS洗一遍?

2、往培养皿中加入1ml,TRIzol,吹打几次(每10cm2面积,即3.5cm直径的培养板加1ml)

3、移至1.5mlEP管，静置5分钟

4、加入200ul三氯甲烷，震荡混匀，室温静置5分钟

5、4度12000r/min，离心15分钟，取上清，约600ul

6、加入500ul异丙醇，混匀后，静置30分钟？

7、4度12000r/min，离心15分钟，弃上清

8、加入1ml70%预冷酒精洗涤沉淀物

9、4度7500r/min，离心5分钟

10、弃上清，自然晾干

11、加入50ulDEPC水溶解，测OD值

＊鼠尾基因组DNA粗提取：

1、100ul lysis buffer for each tail,and 2ul 10mg/ml PK,55℃,overnight.

2、Then,100℃ for 10min to denature the PK, use 0.5~1ul lysate as template to do PCR.

Lysis buffer:(store at 4℃)

KCl 0.5M

Tris 0.1M

NP-40 1%

Tween-20 1%

二、RT-PCR：

1、预变性体系12ul：

Total RNA 2ul

Oligo（dT18）primer 1ul

DH water 9ul

65℃ 5min 速置冰上

2、RT体系：20ul：

预变性体系12ul

5×buffer 4ul

RNAase inhibiter 1ul

10m dNTP 2ul

MMLV 1ul

42℃ 60min

70℃ 5min

12℃ forever

3、PCR体系20ul：

10×buffer 2ul

10m dNTP 0.5ul

Primer(F+R) 1ul （0.5ul+0.5ul）

稀释后cDNA（50ul）1ul

Pfu 0.2ul

dd water 15.3ul

95℃3min、（95℃30s，55℃30s，72℃35s）×29cycle、72℃10min、12℃forever

三、跑胶鉴定PCR产物：

四、醇沉PCR产物：

1、将PCR产物转移至1.5mlEP管中

2、加入0.1倍体积预冷NaAC，3倍体积70%预冷乙醇，混匀

3、—80℃静置30min

4、4度14000r/min，10min离心弃上清，加1ml70%预冷乙醇洗涤沉淀

5、4度14000r/min，10min离心弃上清，自然晾干

6、加入25-20ul dd water 吹匀静置10-20min待溶解

五、原始质粒/PCR醇沉产物双酶切体系50ul：

Enzyme1 1ul

Enzyme2 1ul

10×Buffer 5ul （在体系中被稀释成1×）

10×BSA 5ul （看需要）

Template 1ug

ADD dd water to 50ul

酶切过夜？

六、单独鉴定质粒酶切产物：

1、采用20ul体系：酶各0.5ul、buffer2ul、bsa0.5ul、template2ul）

酶切2h

2、跑胶鉴定

七、电泳，切胶回收与纯化：

使用DNA回收试剂盒（QIAquick Gel Extraction Kit Protocol）

PCR酶切产物纯化：

1.将PCR产物于需要的电压和电流下跑电泳

2. 紫外灯下仔细切下含待回收DNA的凝胶，置1.5ml离心管中，称重。

3. 加入Buffer QG（每100mg凝胶加Buffer QG 300μl），置50℃水浴10min,每隔3,min涡旋

一次至完全溶解，若回收片段小于500bp或大于4kb，则需加入异丙醇（每100mg凝胶加异丙醇100μl），混匀。

4. 加10ulNaAc 调pH值（至<7.

5.），混匀。若液体颜色同QG，则无需调pH值。

5. 将小柱放在2ml收集管上，将上述溶液加于柱上，静置3分钟，可分次做,每次不超过800ul。

6. 4℃离心12000rpm×1min，弃去收集管中液体。

7. 加入500μl Buffer QG于柱上，4℃离心12000rpm×1min，弃去收集管中液体。

8. 加入750μl Buffer PE于柱上，静置3min，4℃离心12000rpm×1min，弃去收集管中液体。

9. 4℃离心12000rpm×1min。弃去收集管。空柱离心？静置20-30min。

10. 将柱放于一新1.5ml离心管上，加50μl Buffer EB或水于柱上。放置1min，4℃离心17900rpm×1min。

11. 测浓度，可取5μl 回收DNA电泳检测鉴定。

注意事项：

紫外灯下切下含待回收DNA的凝胶时，要衬以干净的塑料薄膜，使用无DNA污染的新刀片，其目的在于防止外源DNA的污染。

载体纯化：

1、胶回收载体酶切产物，方法同PCR酶切产物胶回收。

2、CIAP体系60ul：

Vector 50ul

Buffer 6ul （占1/10体系)

Cip 1ul

dd water 3ul

混匀，37℃ 90min

3、进一步纯化：

①加入3倍与cip体系体积的Buffer II，置50℃水浴10min,每隔3,min涡旋一次。

②将小柱放在2ml收集管上，将上述溶液加于柱上，静置3分钟。

③ 4℃离心12000rpm×1min，弃去收集管中液体。

④加入500ul wash solution 12000rpm×1min弃液体。

⑤再加入500ul wash solution 12000rpm×1min弃液体。

⑥空柱离心12000rpm×30s

⑦将柱放于一新1.5ml离心管上，开盖静置20-30min，加50μl Buffer EB，50℃水浴3分钟。

⑧4℃离心17900rpm×1min。

⑨测浓度。

八、连接：体系20ul：

10× DNA Ligase Buffer 2ul

DNA Ligase 1ul

Vector 0.03pmol

Insert 0.09~0.3pmol

Nuclease-free water to 20ul