放射免疫技术

牢固 的抗 原抗 体复 合物
人民卫生出版社
（二）分离技术
固相吸附分离技术 一般采用物理吸附法：用碳酸盐缓冲液将预 包被抗体稀释到3μg/ml~10μg/ml，室温过夜， 弃包被缓冲液（含有未结合物质和过剩标记 物），并洗涤去掉结合不牢固抗体，从而达 到分离的目的；然后，再加入1%牛血清白 蛋白溶液，封闭、保存备用。
释放射线（α、β、γ），又称为放射性衰变。 • 基本类型 依据其衰变方式 α衰变、β衰变、γ衰变 最常用的放射性核素是125I
人民卫生出版社
125I的优点
• 化学性质比较活泼，标记方法简单，且容易获得 高比活性的标记物； • 在衰变过程中产生γ射线，便于测量且效率高； • 半衰期适中（60天左右），且废弃物较容易处理。
标准曲线
注：T即是B与F的总和
人民卫生出版社
四、评价与应用
RIA由于具有敏感度高、特异性强、精密度高、 重复性好、用血量少、可测定小分子量和大分子 量物质等优点，在医学检验中应用极为广泛，常 用于各种激素和药物等的测定。 但由于放射性核素的放射性对人体会产生一定 的危害性，且其废物的储存和销毁会对环境造成 污染，因此操作时必须加以注意。
人民卫生出版社
三、放射标记物的纯化与鉴定 （一）放射标记物的纯化
因游离的125I与 125I标记抗原（抗 体）分子的大小 相差悬殊，故采 用凝胶层析即可 进行分离纯化
标记蛋白
聚合、 损伤物
游离125I
人民卫生出版社
（二）放射标记物的鉴定
放射化学纯度 单位标记物 中结合于被标 记物上的放射 性占总放射性 的百分率 应大于95% 免疫活性 标记物与抗体 结合的能力 标记物与过量 抗体反应百分比 该值越大, 标 记物免疫活性好
• 检测免疫复合物的放射性，从而得到待检样本的
浓度。
人民卫生出版社
Fra Baidu bibliotek 二、方法与类型
（一）单位点 IRMA
人民卫生出版社
（二）双位点 IRMA
人民卫生出版社
三、关键技术 抗原抗体反应 分离技术 放射性测定 数据处理
人民卫生出版社
（一）抗原抗体反应
*
Ag
(待检Ag)
Ab
固相 抗原 抗体 复合 物
Ab*
人民卫生出版社
第三节 免疫放射分析
• 免疫放射分析（IRMA）是从放射免疫分析 （RIA）的基础上发展起来的核素标记免疫 测定，其特点为用核素标记的抗体直接与 待检抗原反应，并用固相免疫吸附剂作为B 或F的分离手段。
人民卫生出版社
一、检测原理
• IRMA属于非竞争性免疫结合反应，其基本检测
原理是将放射性核素（125I）标记在抗体上，并 用过量的标记抗体与待测抗原进行非竞争性结合 反应，并采用固相免疫吸附方式对B和F进行分离。
人民卫生出版社
两种类型
(标准Ag/样品Ag)
三、关键技术 抗原抗体反应 分离结合标记物（分离技术） 放射性测定 数据处理
人民卫生出版社
（一）抗原抗体反应
Ag*
反应条件 体积 温度 时间 pH
Ag
Ab
牢固 的抗 原抗 体复 合物
(标准Ag/样品Ag)
人民卫生出版社
（二）分离结合标记物
二抗体沉淀法 PEG 沉淀法 PR 试剂法 活性炭吸附法
人民卫生出版社
（三）数据处理
晶体闪烁计数器 包括了NaI闪烁晶 体、光电倍增管 以及计数器 测量的放射性信 号是仪器输出的 电脉冲数：每分 钟计数(cpm)
参数 cpm
B/T (%) F/T (%) B/F (%) B/B0 (%)
注：T即是B与F的总和
人民卫生出版社
四、评价与应用
IRMA的优点 效率高、操作简便 灵敏度高 特异型强 稳定性好 IRMA的缺点 抗体用量较多 抗体的纯化较难
比放射活性 高比放射性 高纯度 完整免疫活性
人民卫生出版社
比放射活性 单位化学量标记 物中所含的放射性 强度 单位：Ci/g mCi/mg Ci/mmol 比放射性过高， 将影响标记物免疫 活性
计算法 自身置换法
人民卫生出版社
比放射性－计算法 依据标记反应中放射性核素的利用率（标记率） 来计算标记物的比放射性.
自身置换曲线 标准曲线
反应平衡后，测定B/T%。 若从两条曲线上取一点相同的B/T%， 则（标记物+标准品）标准曲线= （标记物） 自身置换曲线。由此便可直接计算 标记抗原的含量，并进一步求得比 放射活性 。
人民卫生出版社
• 自身置换法测定标记化合物的比放射活性，只 适用于RIA的标记抗原。使用时应注意： ①标记物与未标记物对抗体（受体）的亲和力 应相同； ②非特异性结合应较小，且计算时应扣除； ③制备标准曲线与自身置换曲线时，操作步骤 应相同，特别是B与F分离的条件要一致。
人民卫生出版社
二、放射性核素标记抗原抗体方法
直接标记法（氯胺T法） 主要包括 间接标记法
人民卫生出版社
（一）直接标记法——氯胺T法（Ch-T）
氯胺T将125I的I－氧化
125I-
为I+，I+取代蛋白质 酪氨酸苯环的氢，形 成稳定的放射标记物 （二碘酪氨酸），最 后加入偏重亚硫酸钠 （还原剂）终止反应。
人民卫生出版社
第一节 放射性核素和放射性标记物的制备 • 放射性核素作为放射性免疫技术的标记物， 选择何种放射性核素以及如何制备放射标 记物（将放射性核素与抗原或抗体连接）， 是建立放射免疫技术的基础。
人民卫生出版社
一、放射性核素的基本知识
• 基本概念 指在自然条件下可发生自发性的转化，由一种
放射性核素转变成另一种放射性核素，并同时
Ag*和Ag具有等同的
与Ab结合能力
人民卫生出版社
Ab限量，Ag*定量, Ag*和Ag的量大于 Ab结合位点，二者 通过竞争方式与Ab 结合；随着Ag增加， Ag*与Ab结合形成 Ag*Ab复合物的放 射量降低,二者变化 成函数关系。
人民卫生出版社
二、方法与类型
平衡法，即标记抗原、标准品抗原（或 待检样本）、特异性抗体同时加入反应 体系中。 非平衡法，即标准品抗原（或待检样 本）和特异性抗体，优先使非标记抗 原与特异性抗体达到平衡，然后再加 入标记抗原竞争与抗体结合。
Ch-T、 LPO氧化
125I或125I+
取代反应
125I-标记物
（混合物）
人民卫生出版社
使用无还原剂的 高比放射性碘源 被标记物用量要 少 Ch-T用量要低 控制总反应体积 <200μl 反应时间1分钟 ~2分钟 弱碱性反应条件 人民卫生出版社
（二）间接标记法
预先将125I用Ch-T法标 记琥珀酰胺酯，制成的 125I 化脂功能基团可与 蛋白分子上的氨基酸残 基反应，从而使待标记 物被碘化。
分离彻底，迅速 分离试剂和过程不 影响反应平衡 效果不受反应介质 影响 操作应简单、重复 性好 经济
人民卫生出版社
（三）数据处理
晶体闪烁计数器 包括了NaI闪烁晶 体、光电倍增管 以及计数器 测量的放射性信 号是仪器输出的 电脉冲数：每分 钟计数(cpm)
参数 cpm
B/T (%) F/T (%) B/F (%) B/B0 (%)
人民卫生出版社
第二节 放射免疫分析
• 放射免疫分析（RIA）是以放射性核素标 记的抗原（Ag*）与未标记抗原（Ag）竞争 结合特异抗体（Ab）来对待检样品中的抗 原进行定量测定的一种技术。
人民卫生出版社
一、检测原理
RIA属于竞争性分析， 其基本原理是由于Ag* 和Ag（待测物Ag)对特 异性抗体具有相同的结 合力，当三者同时存在 于同一反应体系时， Ag*和Ag相互竞争结合 特异性抗体。
免疫学检验
人民卫生出版社
第十九章 放射免疫技术
人民卫生出版社
本章要点
1. 2. 3. 4.
放射免疫技术的基本概念及类型 放射标记物的鉴定与纯化。 RIA和IRMA的测定原理及关键技术。 RIA和IRMA的临床应用与评价
人民卫生出版社
目
1 2 3
录
放射性核素和放射性标记物的制备 放射免疫分析性 免疫放射分析
RMA的测定对象主要限于有两个以上抗原决定簇 的肽类或蛋白质。抗体适用于大分子蛋白质和多 肽类激素的检测分析，如肿瘤标志物CA15-3，人 血清催乳素、胃蛋白酶，血清TSH、凝血因子、 降钙素、HBsAg等，某些难以标记的病毒抗原也 可通过IRMA进行检测。
人民卫生出版社
小
结
放射免疫技术是应用放射性核素标记抗原或抗 体，通过免疫反应进行定量测定的一种技术。有 两种类型经典的放射免疫分析（RIA）和免疫放射 分析（IRMA）。 放射免疫分析是待测抗原和定量的标记抗原竞 争性结合限量的抗体;免疫放射分析是将放射性物 质标记在抗体上，属于非竞争性免疫结合反应。 放射性免疫技术灵敏度高、特异性强，常用于 微量物质的定量测定。但由于放射性核素的放射 性对人体和环境会产生一定的危害和污染，因此 操作时必须加以注意。
人民卫生出版社
前 言
• 放射免疫技术是将放射性核素高敏感的示踪特点 和抗原抗体反应的高特异性特点相结合的一种体 外测定超微量物质的新技术。 • 其基本模式是应用放射性核素标记抗原或抗体， 通过免疫反应进行定量测定。 • 具有灵敏度高、特异性强、重复性好、样品及试 剂用量少、操作简便且易于标准化等优点，在医 学检验中得到了广泛应用。 • 放射免疫技术根据其方法学原理的不同主要有两 种类型：RIA和IRMA。
人民卫生出版社
人民卫生出版社
125I的缺点
• 用125I取代H，可能使原物质免疫活性受到影响； • 易因发生辐射损伤而使标记抗原变性； • 作为商品化试剂的产品货架期较短。
人民卫生出版社
放射性核素放射活性的检测
利用射线照射闪烁体（NaI晶体），导致晶体 分子激发，在退激发时，闪烁体发出一定波长 的荧光；再由光电倍增管将极微弱的荧光转换 成光电子并放大107倍；从光电倍增管输出的 电信号经过放大器放大，经单道分析器甄别处 理，并在定标器上显示。
结果欠准，计算简便
人民卫生出版社
比放射性－自身置换法
比较标记抗原与标准抗原的免疫活性来测定 标记物的比放射性。
作一条常规的RIA标准曲线，反应体系包括定 量标记抗原、不同浓度的非标记标准品抗原、 限量抗体；同时另作一条不加非标记标准品、 只加抗体和不同剂量的标记抗原的自身置换曲 线。
人民卫生出版社